Изоляция нейронов ядра из человеческих тканей мозга Посмертные

Summary

Сотовые неоднородность ткани головного мозга создает значительные ограничения для изучения эпигенетической маркировки в хроматина, потому что большинство анализов отсутствие одной резолюции клетки. Нейроны обычно идут прямо глии и других не-нервных клеток. Мы предоставляем протокол для извлечения и собирать нейронов ядер от человеческого мозга.

Abstract

Нейроны человеческого мозга стали постмитотических основном в период внутриутробного развития, и таким образом поддерживать их ядер на протяжении всего срока службы. Тем не менее, мало известно об изменениях в нейронных хроматина и ядерной организации в ходе развития и старения, или при хронических психоневрологических заболеваний. Однако на сегодняшний день наиболее хроматина и ДНК на основе анализов (кроме рыбы) отсутствие одной резолюции клетки. Для этого, значительное сотовой неоднородность ткани мозга представляет существенное ограничение, так как обычно различные субпопуляции нейронов перемешаны с различными типами глии и других не-нервных клеток. Одно из возможных решений будет расти камерного типа конкретной культуры, но большинство ЦНС клеток, включая нейроны, являются бывшими естественных условиях устойчивого, в лучшем случае, лишь несколько недель, и таким образом обеспечит неполной моделью для эпигенетических механизмов потенциально операционных по всему продолжительность жизни . Здесь мы предоставляем протокол для извлечения и очистки ядер из замороженных (никогда не фиксированной) человеческого мозга посмертных. Метод включает в себя добычу ядер в гипотонический лизис буфера, а затем ультрацентрифугирования и immunotagging с анти-Neun антител. Маркированный нейронов ядра затем собирают отдельно с помощью флуоресцентной активированной сортировки. Этот метод должен быть применимы к любой области мозга, в широком диапазоне видов и пригодны для хроматин иммунопреципитации исследований с сайта и изменения конкретных анти-гистонов антител, а также для метилирования ДНК и другие анализы.

Protocol

Добыча ядер

1. Положите 250 мг замороженных тканей мозга посмертных в 5 мл лизирующего буфера ¹ в douncer и поместите его на лед. Чтобы получить около 5 миллионов ядер после FACS сортировки, мы обычно используем 1000 мг ткани на пробу.
2. Как только ткань оттаяли, Dounce ткани в течение 1 минуты в то время как на льду.
3. Возьмите гомогенизированной ткани и поместите его в 15 мл ясно трубки ультрацентрифуге. Положите трубку на льду.
4. Возьмите 9 мл раствора сахарозы, ² с пипетки, положить пипетку в нижней части трубки ясно ультрацентрифуге, и освободить раствором сахарозы ² для создания градиента концентрации с гомогенизированный решение ткани поверх Сахароза Решение ^2.
5. Взвесьте ультрацентрифуге трубы, чтобы убедиться, что все они будут сбалансированы при вращении в ультрацентрифуге. Внести любые изменения в весе, добавив Лизис буфера ¹ до верхнего слоя.
6. После трубы были взвешены, поместить их в ведра ротора.
7. Поместите все ведра в SW28 ротора и осторожно поместите ротор в ультрацентрифуге.
8. Ультрацентрифуге образцов на 107163,6 RCF в течение 2,5 часов при температуре 4 ° C.
9. После центрифугирования завершено, удалить супернатант, вместе с слоем мусора найти на градиент концентрации, с применением вакуума, стараясь при этом не мешать гранул содержащих ядер в нижней части трубы.
10. Добавить 500 мкл 1X PBS, чтобы каждая гранула и пусть сидят на льду в течение 20 минут. Это позволяет гранулы растворить немного о себе, что делает его легче позже механически растворить его с помощью пипетки вверх и вниз, что уменьшает количество напряжения ядра опыт.
11. После ядра имеют инкубировали на льду в течение 20 минут, механически пипетку вверх и вниз до полного растворения ядер в 1XPBS.
12. Удалить ядер раствор, содержащий от ультрацентрифуге труб и объединить содержимое двух труб в одну две трубки микроцентрифужных мл. Опять же, место образцы на льду.

Иммуноокрашивание для FACS

1. На данный момент, сделать иммуноокрашивания смеси, состоящей из первичного и вторичного антитела, и блокировка Mix. Для каждого образца, объединить 300 мкл 1XPBS, содержащей 1,2 мкл Neun антител, 100 мкл блокирующего Mix, который содержит 0,5% BSA и 10% нормальной козьей сывороткой в ​​1XPBS и 1 мкл Alexa Fluor 488. Для контрольных образцов, исключают первичную Neun антител и, вместо этого, просто добавьте несколько 1XPBS.
2. Vortex иммуноокрашивания смеси и инкубировать 5 минут при комнатной температуре в темноте.
3. Хотя окрашивание смесь инкубации, делают управление для образцов. Для FACS сортировка, выборка, содержащих ядра один, называемый "неокрашенных контроль" требуется; второго образца, отрицательный контроль, содержащие ядра с вторичными антителами Alexa Fluor 488 без первичных антител Neun также необходима.
4. Алиготе 20 мкл ядер, содержащих раствор в 2 мл микроцентрифужных пробирку 1XPBS для неокрашенных контроля, и еще 20 мкл в другую 2 мл пробирку, содержащую 980 мкл 1XPBS для отрицательного контроля. Повышение объема ядер содержащих образец обратно до 1 мл с 1XPBS. Все образцы помещают обратно на лед.
5. Теперь, когда иммунной смесь закончил инкубации, добавьте его содержимое из 401 мкл в соответствующие образцы. Ядер образца получит смесь, содержащую оба Neun и Alexa Fluor 488, в то время как отрицательный пример получите смесь, содержащие только вторичными антителами Alexa Fluor 488.
6. Возьмите образцы в холодной комнате вращаться в темноте в течение 45 минут.
7. После пробы инкубировали в темноте в течение 45 минут, положить их на лед и довести их до объекта СУИМ. Во время перевозки на объект FACS, образцы должны храниться на льду и в темноте.

FACS

1. На объекте FACS, фильтр образцов через 40 мкм фильтр. Затем пропустить их через прибор в течение нескольких минут, в то же время держать в холоде, чтобы получить некоторые предварительные данные до сортировки.
2. На данный момент, необходимо установить соответствующие ворота, необходимых для сортировки. Несколько различных ворота используются для сортировки образцов. Первых ворот дает представление о размере различных ядрах обнаружены в образце, а также позволяет separatation мусора от реальных ядер. Вторые ворота позволяет сортировать ядер по отдельности. Не использовать агрегаты, отбрасываются в этой точке. Наконец, третьи ворота установлен на конкретной длине волны флуоресценции, соответствие, что из флуорохромом найти в нашем вторичными антителами. Размещение этих ворот позволяет сортировать и отдельный + Neun, следовательно нейронов ядер от Neun - ядер.
3. В конце концов ворота выбраны, ядра могут быть отсортированы в 1XPBS.
4. Послевсей выборке прошла, проверьте чистоту рода, запустив аликвоту отсортированы образца через инструмент. Убедитесь, что флуоресценция образца не распространено, а, скорее, находится в пределах одного квадранта. Лучше всего выбрать образцов, которые более 90% чистой.

После FACS

1. Как только образец был отсортирован, переработки ядер может начаться. Возьмите 10 мл отсортированы образца и добавить к нему 2 мл раствора сахарозы, ^2, 50 мкл 1М CaCl ₂ и 30 мкл 1м Mg (Ace) _2. Напомним, что всегда не забудьте сохранить образец на льду поскольку ядра незаписанных.
2. Если есть менее 10 мл отсортированы образца, довести объем до 10 мл, добавляя 1XPBS, или настроить дополнительные материалы, соответственно.
3. Обратить образца в несколько раз и место на льду в течение 15 минут.
4. После пробы инкубировали на льду в течение 15 минут, центрифуги их в ведро ротора качели на 1786 RCF в течение 15 минут при ⁴ ° C.
5. Удалите надосадочную с применением вакуума, не нарушая белый шарик найти на дне пробирки.
6. Растворить осадок в 200 мкл все решения, которые требуются для производства экспериментов и пипетки вверх и вниз.
7. Перенесите раствор в меньшей трубки и поместить его в -80 ° C морозильнике до дальнейшего использования.

Discussion

Протокол, представленные здесь должно быть особенно полезно для исследования сосредоточены на эпигенетические изменения нейронов хроматина и, более общо, на молекулярном фенотип нейронов ядра, при нормальном развитии и старении, или неврологическими или психиатрическими заболеваниями. Метод имеет особое преимущество, когда сотовая неоднородность ткани мозга, в том числе потенциальные сдвиги в нейрон-к-глии рацион в ходе старения или из-за болезни обеспокоенность ^1. Например, путем объединения настоящим Протоколом сортировки с методами иммунопреципитации хроматина, мы недавно описал нейрон конкретных моделей метилирования гистонов на мозг нейротрофического фактора (BDNF) промотора гена, так и для дополнительных нейронов генов ^2. Подобный метод был использован ранее для сбора нейронов коры головного мозга взрослого для ретроспективного рождения знакомств ^3. Сортировка техника также используется в мозг мыши ^2, и из-за стабильности ядер в замороженном-то-талого ткани, мы ожидаем, что подход, представленный здесь, применимы к широкому спектру видов. Потому что хроматин иммунопреципитации от всего лишь 10 тысяч клеток для теперь и годится для более полной покрытия генома ^4, то можно использовать гораздо меньше, чем 1000 мг исходного материала, который мы рекомендовали выше.

Materials

Reagents: 1. Lysis Buffer 0.32M Sucrose 5.47 g 5 mM CaCl2 250 μl 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 0.1 mM EDTA 10 μl 10mM Tris-HCl, pH8 500 μl 1 mM DTT 17 μl 0.1% Triton X-100 50 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 2. Sucrose Solution 1.8 M Sucrose 30.78 g 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 1 mM DTT 17 μl 10 mM Tris-HCl, pH8 500 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 3. Dounce buffer 10 mM Tris 0.242 g 4 mM MgCl2 0.163 g 1 mM CaCl2 0.03 g Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water