Aislamiento de los núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post-mortem

Summary

La heterogeneidad celular del tejido cerebral supone una limitación importante para el estudio de las marcas epigenéticas en la cromatina, porque la mayoría de los ensayos de la falta de resolución única célula. Las neuronas normalmente se entremezclan con la glía y otras células no neuronales. Ofrecemos un protocolo para extraer y recoger los núcleos neuronales del cerebro humano.

Abstract

Las neuronas en el cerebro humano se postmitóticas en gran parte durante el desarrollo prenatal, y así mantener sus núcleos en todo el ciclo de vida completo. Sin embargo, poco se sabe acerca de los cambios en la cromatina nuclear y la organización neuronal durante el curso del desarrollo y el envejecimiento, o en las enfermedades neuropsiquiátricas crónicas. Sin embargo, hasta la fecha la mayoría de los ensayos basados ​​en la cromatina y el ADN (excepto los de pescado) Resolución de la falta de células individuales. Con este fin, la gran heterogeneidad celular del tejido cerebral supone una limitación importante, ya que por lo general diversas subpoblaciones de neuronas se entremezclan con los diferentes tipos de glía y otras células no neuronales. Una posible solución sería hacer crecer células de tipo culturales específicas, pero la mayoría de las células del SNC, incluyendo las neuronas, son ex vivo sostenible, en el mejor de los casos, sólo un par de semanas y por lo tanto proporcionaría un modelo incompleto de los mecanismos epigenéticos potencialmente operan en todo el ciclo de vida completo . Aquí, ofrecemos un protocolo para extraer y purificar los núcleos de congelación (no fijos) del cerebro de cadáver. El método consiste en la extracción de núcleos en solución amortiguadora de lisis hipotónica, seguida por ultracentrifugación y immunotagging con anticuerpos anti-NeuN. Núcleos etiquetados neuronal continuación, se recogen por separado mediante fluorescencia activadas por la clasificación. Este método debe ser aplicable a cualquier región del cerebro en una amplia gama de especies y adecuada para los estudios de inmunoprecipitación de la cromatina en el sitio-y la modificación de los anticuerpos específicos anti-histonas, y por la metilación del ADN y otros ensayos.

Protocol

Los núcleos de extracción

1. Poner 250 mg de tejido congelado el cerebro post mortem en 5 ml de ^un tampón de lisis en un douncer y colocarlo sobre hielo. Para recibir unos 5 millones de núcleos después de FACS clasificación, por lo general el uso de 1000 mg de tejido por muestra.
2. Una vez que el tejido se ha descongelado, el tejido Dounce durante 1 minuto, mientras que en el hielo.
3. Tome el tejido homogeneizado y colocarlo en un tubo de ultracentrífuga 15 ml claro. Ponga el tubo en hielo.
4. Tomar 9 mL de solución de sacarosa ² con una pipeta, poner la pipeta en la parte inferior del tubo de ultracentrífuga claro, y liberar la solución de sacarosa ² para crear un gradiente de concentración con la solución de tejido homogeneizado en la parte superior de la solución de sacarosa ^2.
5. Pesar los tubos de ultracentrífuga para asegurarse de que todos ellos serán equilibradas al girar dentro de la ultracentrífuga. Realizar ajustes en el peso mediante la adición de ^un tampón de lisis a la capa superior.
6. Después de que los tubos han sido pesados, colocarlos en cubos del rotor.
7. Coloque todos los cubos en un rotor SW28 y coloque cuidadosamente el rotor en la ultracentrifugación.
8. Ultracentrífuga las muestras a 107.163,6 RCF durante 2,5 horas a 4 ° C.
9. Una vez se haya completado la centrifugación, separar el sobrenadante, junto con la capa de desechos que se encuentran en el gradiente de concentración, con el uso de un vacío, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento que contiene los núcleos en la parte inferior del tubo.
10. Añadir 500 l de PBS 1X a cada pastilla y deje reposar en hielo durante 20 minutos. Esto permite que la pastilla se disuelva un poco por su cuenta, lo que facilita que se disuelva después mecánicamente pipeteando arriba y hacia abajo, lo que disminuye la cantidad de estrés la experiencia de los núcleos.
11. Después de los núcleos que se incubó en hielo durante 20 minutos, mecánicamente pipeta hacia arriba y abajo, para disolver completamente los núcleos dentro de 1XPBS.
12. Eliminar la solución de los núcleos que contienen los tubos de ultracentrífuga y combinar el contenido de dos tubos en un solo tubo de microcentrífuga de 2 ml. Una vez más, el lugar de las muestras en hielo.

La inmunotinción para FACS

1. En este punto, hacer una mezcla compuesta por inmunotinción de anticuerpos primaria y secundaria, y el bloqueo de la mezcla. Para cada muestra, se combinan 300 L de 1XPBS que contiene 1,2 l de anticuerpos NeuN, 100 l de mezcla de bloqueo, que contiene 0,5% de BSA y el 10% suero normal de cabra en 1XPBS, y 1 l de Alexa Fluor 488. Para las muestras de control, excluye la NeuN anticuerpo primario y, en cambio, sólo tiene que añadir más 1XPBS.
2. Vortex la mezcla inmunotinción e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
3. Mientras que la mezcla de tinción se está incubando, que los controles de las muestras. Por FACS clasificación, una muestra que contiene núcleos solo, llamado el "control sin mancha" es necesario, una segunda muestra, un control negativo, que contiene el núcleo con el anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 sin NeuN anticuerpo primario es también necesaria.
4. Alícuota de 20 l de los núcleos que contiene la solución en un tubo de microcentrífuga de 2 ml contiene 1XPBS para el control de mancha, y otro 20 l en otro tubo de 2 ml que contiene 980 l de 1XPBS para el control negativo. Aumentar el volumen de los núcleos que contienen una copia de seguridad muestra a 1 ml con 1XPBS. Todas las muestras se colocan de nuevo en hielo.
5. Ahora que la mezcla de inmunotinción ha terminado la incubación, añadir su contenido de 401 l en la toma de muestras adecuadas. La muestra de núcleos recibirá la mezcla que contiene tanto NeuN y Alexa Fluor 488, mientras que la muestra negativa recibirá la mezcla que sólo contenga el anticuerpo secundario Alexa Fluor 488.
6. Tomar las muestras en la cámara frigorífica para girar en la oscuridad durante 45 minutos.
7. Después de las muestras se han incubado en la oscuridad durante 45 minutos, los ponen en hielo y llevarlos al centro de FACS. Durante el transporte a las instalaciones de la FACS, las muestras deben mantenerse en hielo y en la oscuridad.

FACS

1. En las instalaciones de la FACS, filtro de las muestras a través de un filtro de 40 um. A continuación, ejecutar a través del instrumento durante unos minutos, mientras que se mantiene frío, con el fin de obtener algunos datos preliminares antes de la clasificación.
2. En este punto, es necesario establecer las puertas apropiadas requeridas para la clasificación. Varias puertas se utilizan diferentes a las muestras de clase. La primera puerta da una idea del tamaño de los núcleos diferentes que se encuentran dentro de la muestra, y permite separatation de escombros de los núcleos actuales. La segunda puerta que nos permite ordenar los núcleos de forma individual. Deseche todos los agregados se descartan en este momento. Por último, la tercera puerta está establecido en una longitud de onda de fluorescencia específica, igual a la del fluorocromo en nuestro anticuerpo secundario. La colocación de esta puerta que nos permite clasificar y separar NeuN +, por lo tanto, los núcleos neuronales de NeuN - núcleos.
3. Después de todas las puertas son elegidos, los núcleos se pueden clasificar en 1XPBS.
4. Una vez que eltotalidad de la muestra ha pasado, comprobar la pureza de la especie mediante la ejecución de una parte alícuota de la muestra ordenados a través del instrumento. Asegúrese de que la fluorescencia de la muestra no es hacia fuera, sino que está contenido en un solo cuadrante. Lo mejor es elegir las muestras que son más del 90% de pureza.

Después de FACS

1. Una vez que la muestra ha sido ordenada, el procesamiento de los núcleos puede comenzar. Tomar 10 ml de muestra ordenados y añadir a 2 ml de solución de sacarosa ^2, 50 uL de 1 M de CaCl ₂ y 30 ul de 1m Mg (As) _2. Como recordatorio, siempre asegúrese de mantener la muestra en hielo desde los núcleos son fijadas.
2. Si hay menos de 10 ml de muestra ordenada, subir el volumen hasta 10 ml mediante la adición de 1XPBS, o ajustar los materiales adicionales en consecuencia.
3. Invertir la muestra en varias ocasiones y el lugar en hielo durante 15 minutos.
4. Después de que las muestras han incubaron en hielo durante 15 minutos, los de centrifugación en un rotor basculantes a 1786 rcf durante 15 minutos a 4 ^° C.
5. Eliminar el sobrenadante con el uso de un vacío, sin perturbar el precipitado blanco en la parte inferior del tubo.
6. Disolver el precipitado en 200 l de cualquier solución que usted requiere para los experimentos de procedimiento, y la pipeta hacia arriba y hacia abajo.
7. La transferencia de la solución en un tubo más pequeño y colocarlo en el congelador de -80 º C hasta su uso posterior.

Discussion

El protocolo que aquí se presenta debe ser particularmente útil para los estudios se centraron en los cambios epigenéticos de la cromatina neuronal y, en general, sobre el fenotipo molecular del núcleo neuronal, durante el funcionamiento normal desarrollo de la enfermedad y el envejecimiento, o neurológicos o psiquiátricos. El método es particularmente ventajoso cuando la heterogeneidad celular del tejido cerebral, incluyendo posibles cambios en la ración de las neuronas a células gliales en el transcurso del tiempo ya causa de la enfermedad son una preocupación ^1. Por ejemplo, al combinar el protocolo de clasificación se presentan con las técnicas de inmunoprecipitación de la cromatina, lo describió recientemente neuronal específica patrones de metilación de las histonas en el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), promotor del gen, y ² para otros genes neuronales. Un método similar se ha usado previamente para recoger las neuronas de la corteza cerebral de adultos para el nacimiento de retrospectivas que data ^3. La técnica de clasificación se empleó también en cerebro de ratón ^2, y debido a la estabilidad de los núcleos de congelado y descongelado el tejido luego, esperamos que el enfoque que aquí se presenta es aplicable a una amplia gama de especies. Debido a la inmunoprecipitación de la cromatina de tan sólo 10.000 células por ahora es factible incluso para una cobertura más completa del genoma ^4, puede ser posible utilizar mucho menor que la de 1000 mg de material de partida que se detalla más arriba.

Materials

Reagents: 1. Lysis Buffer 0.32M Sucrose 5.47 g 5 mM CaCl2 250 μl 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 0.1 mM EDTA 10 μl 10mM Tris-HCl, pH8 500 μl 1 mM DTT 17 μl 0.1% Triton X-100 50 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 2. Sucrose Solution 1.8 M Sucrose 30.78 g 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 1 mM DTT 17 μl 10 mM Tris-HCl, pH8 500 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 3. Dounce buffer 10 mM Tris 0.242 g 4 mM MgCl2 0.163 g 1 mM CaCl2 0.03 g Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water