인간의 사후 뇌 조직에서 핵의 연결을 격리

Summary

뇌 조직의 세포 이질은 대부분의 assays 단일 셀 해상도 부족하기 때문에 염색질의 epigenetic 자국의 연구에 대한 중요한 제한 포즈. 뉴런은 일반적으로 glia 및 기타 비의 연결을 세포와 혼합된 있습니다. 우리는 인간의 두뇌에서 핵의 연결을 추출하고 수집하는 프로토콜을 제공합니다.

Abstract

인간 두뇌의 뉴런은 태아 발달 동안 주로 postmitotic되며, 따라서 전체 수명에 걸쳐 그들의 핵을 유지합니다. 그러나, 약간은 개발과 노화 과정 동안의 연결 염색질과 핵 조직의 변화 또는 만성 neuropsychiatric 질병에 대해 잘 알려져 있습니다. 그러나, 대부분의 염색질과 DNA 기반 assays (물고기 이외의) 부족 단세포 해상도를 날짜합니다. 뉴런의 일반적으로 다양한 subpopulations가 glia 및 기타 비의 연결을 세포의 다른 종류의 혼합된 있기 때문에이를 위해, 뇌 조직의 상당한 이질 세포는 상당한 한계를 포즈. 한 가지 가능한 솔루션은 셀 타입의 특정 문화를 성장하는 것이지만, 신경을 포함하여 대부분의 CNS의 세포는, 몇 주 동안, 최고의, 지속 전직 생체내이며, 따라서 잠재적으로 전체 수명에 걸쳐 운영 epigenetic 메커니즘에 대한 불완전한 모델을 제공하는 . 여기, 우리는 냉동 (고정 절대) 인간의 사후 두뇌에서 핵을 추출하고 정화하는 프로토콜을 제공합니다. 방법은 안티 NeuN 항체와 ultracentrifugation 및 immunotagging 다음 hypotonic 용해 버퍼에서 핵의 추출을 포함합니다. 라벨의 연결 핵은 다음 형광 활성화 정렬을 사용하여 별도로 수집하고 있습니다. 이 방법은 인류의 다양한에서 뇌 영역에 적용 및 사이트 및 수정 - 특정 안티 - 히스톤 항체 및 DNA의 methylation과 다른 assays를위한과 염색질의 immunoprecipitation 연구에 적합해야합니다.

Protocol

핵 추출

1. douncer 5 ML의 용해 버퍼 ¹ 냉동 사후 뇌 조직 250 MG를 넣어 얼음에 놓으십시오. 정렬 외과 이후 만 5 핵을 받게하기 위해, 우리는 일반적으로 샘플 당 조직 1000 MG를 사용합니다.
2. 조직은 해동되면, 동안 얼음에서 1 분 조직을 다운스.
3. 균질 조직을 가지고 15 ML 맑은 초원 심 분리기 튜브에 넣습니다. 얼음에 튜브를 넣어.
4. , 피펫과 자당 ^솔루션이 9 ML을 가지고 명확한 초원 심 분리기 튜브의 하단에있는 피펫을 놓고, 자당 솔루션 ² 위에 균질 조직 솔루션 농도 기울기를 만들 자당 솔루션 ² 릴리스.
5. 초원 심 분리기 내에서 회전하는 동안 그들이 모두 균형 수 있는지 확인하기 위해 초원 심 분리기 튜브의 무게를. 상단 레이어에 용해 완충액 ¹ 추가하여 중량 어떤 조정합니다.
6. 튜브가 아무리 발버둥치고 후 회전자의 버킷으로 그들을 놓으십시오.
7. SW28 회전자에 모든 양동이를 놓고 조심스럽게 초원 심 분리기에 날개를 놓으십시오.
8. 4 2.5 시간 107163.6 RCF에서 샘플을 초원 심 분리기 ° C.
9. 원심 분리가 완료되면 튜브의 하단에있는 핵을 포함하는 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서, 진공의 사용과 함께, 농도 기울기에서 발견된 파편의 계층과 함께 뜨는을 제거합니다.
10. 각각의 펠렛에 1X PBS 500 μL를 추가하고 20 분 동안 얼음에 앉아 보자. 이것은 펠릿가 쉽게 나중에 기계적 스트레스의 양을 핵 경험을 lessens하는, 그리고 아래로 pipetting하여 해산 수 있도록 자체에 약간 용해 수 있습니다.
11. 핵 20 분 동안 얼음에 incubated 후, 기계적으로 완전히 1XPBS 이내에 핵을 해산하기 위해 아래 피펫합니다.
12. 초원 심 분리기 튜브의 핵 함유 솔루션을 제거하고 하나 둘 ML의 microcentrifuge 관 두개의 튜브의 내용을 결합하여. 다시 얼음 샘플을 넣으십시오.

외과에 대한 Immunostaining

1. 이 시점에서, 기본 및 보조 항체로 구성된 immunostaining 혼합을하고, 믹스를 차단. 각 예제, NeuN 항체, 0.5 % BSA와 10 % 정상 염소 1XPBS에 세럼, 그리고 알렉사 플루어 488 1 μL를 포함 차단 믹스, 100 μL의 1.2 μL를 포함 1XPBS 300 μL을 결합. 컨트롤 샘플, 기본 NeuN 항체를 제외하고, 대신, 더 많은 1XPBS를 추가합니다.
2. 소용돌이 어둠 속에서 실온에서 5 분 immunostaining 혼합물과 부화.
3. 얼룩 혼합물은 잠복기지만, 샘플 컨트롤을합니다. 혼자 핵을 포함, 샘플을 정렬 외과 들어, "흠없는 컨트롤이"필요라는, 두 번째 샘플, 부정적인 컨트롤을 기본 항체 NeuN도 필요없이 이차 항체 알렉사 플루어 488로 핵을 포함하는.
4. 부정적인 제어를위한 1XPBS의 980 UL을 포함하는 다른 두 ML 튜브에 흠없는 컨트롤에 대한 1XPBS, 다른 20 μL를 포함하는 2 ML의 microcentrifuge 관에 솔루션을 포함하고있는 핵의 나누어지는 20 μL. 의 볼륨 핵 함유 1XPBS 1 ML까지 다시 샘플을 올립니다. 모든 샘플은 얼음에 다시 배치됩니다.
5. immunostaining 혼합물은 잠복기 완료 했으니, 해당 샘플에 401 μL의 내용을 추가합니다. 부정적인 예제는 보조 항체 알렉사 플루어 488를 포함하는 혼합물을 받게됩니다 동안 핵의 샘플은, NeuN과 알렉사 플루어 488 모두를 포함하는 혼합물을 받게됩니다.
6. 45 분 동안 어둠 속에서 회전하는 차가운 방으로 샘플을 가져가라.
7. 샘플 45 분 동안 어둠 속에서 incubated 후, 얼음에 넣고 외과 시설에 그들을 데리고. 외과 시설에 전송하는 동안, 샘플은 얼음과 어둠에 보관해야합니다.

외과

1. 외과의 시설에서, 40 음 필터를 통해 샘플을 필터링합니다. 감기에 보관하면서 다음, 정렬 전에 예비 데이터를 얻기 위해서, 몇 분 동안 악기를 통해 그들을 실행합니다.
2. 이 시점에서, 그것은 정렬에 필요한 적절한 성문을 설정할 필요가 있습니다. 몇 가지 다른 종류의 게이트는 샘플하는 데 사용됩니다. 첫 번째 게이트는 샘플 내에서 발견된 다른 핵의 크기의 아이디어를 제공하고, 실제 핵의 파편 separatation 수 있습니다. 두 번째 게이트는 우리가 개별적으로 핵을 정렬할 수 있습니다. 폐기 모든 집합체는이 시점에서 무시됩니다. 마지막으로, 세 번째 게이트는 우리의 차 항체에있는 fluorochrome의 일치, 특정 형광 파장으로 설정됩니다. 이 게이트를 게재하면 우리 정렬할 수 있으며 따라서 별도의 NeuN의 +, NeuN부터의 연결을 핵 - 핵.
3. 모든 게이트가 선택되면 핵은 1XPBS으로 정렬할 수 있습니다.
4. 일단전체 예제를 통해 간, 악기를 통해 정렬 샘플의 나누어지는을 실행하여 일종의 순도를 확인하십시오. 샘플의 형광이 펼쳐 아니지만, 오히려 하나의 사분면에 포함된 있는지 확인합니다. 90 % 이상 순수 아르 샘플을 선택하는 것이 좋습니다.

외과 후

1. 일단 샘플이 시작할 수 있습니다 핵 처리 정렬되었습니다. 정렬 샘플 10 ML을 가지고 그것에 자당 솔루션 ^2, 1M CaCl ₂ 50 UL과 1m MG (에이스) ₂ 30 UL 2 ML를 추가합니다. 거듭 말씀 드리지만, 항상 핵이 수정되지 않은 있기 때문에 얼음에 샘플을 보관해야합니다.
2. 정렬 샘플 미만 10 ML가있다면, 1XPBS을 추가로 10 ML에 볼륨을 높이거나 적절하게 추가 자료를 조정합니다.
3. 15 분 샘플에게 얼음에 몇 시간과 장소를 반전.
4. 샘플은 15 분 동안 얼음에 incubated 후, 4에서 15 분 동안 1,786 RCF에서 스윙 버켓 로터에서 그들을 원심 분리기 ^° C.
5. 튜브의 하단에있는 흰색 펠렛 방해하지 않고, 진공의 사용으로 뜨는 폐기하십시오.
6. 당신이 진행 실험에 필요한 어떤 솔루션을 200 μl의 펠렛을 디졸브, 그리고 위아래로 피펫합니다.
7. 작은 튜브에 솔루션을 전송하여 추가로 사용할 때까지 -80 ° C 냉장고에 넣습니다.

Discussion

여기에 제시 프로토콜이 더 일반적으로 epigenetic의 연결을 염색질의 변화와에 초점을 맞춘 연구에 특히 유용해야 정상적인 개발과 노화, 또는 신경 또는 정신 질환 중의 연결을 핵의 분자 표현형에. 잠재적인 노화의 과정에서 신경 세포 - 투 - glia의 배급에있는 교대 또는 질병에 의한 포함한 뇌 조직의 세포 이질이 우려 ^일아르 때 방법은 특히 장점입니다. 예를 들어, 염색질의 immunoprecipitation 기술과 함께 현재 정렬 프로토콜을 결합하여, 우리는 최근에 neurotrophic 요인 (BDNF) 유전자 프로 모터를 파생 두뇌에 신경 세포 특정 히스톤 methylation 패턴을 설명하고, 추가의 연결을 유전자 ^2. 유사한 방법을 회고 출산 데이트 ³ 성인 대뇌 피질의 뉴런를 수집하기 위해 이전에 사용했다. 정렬 기술은 또한 마우스 뇌 ² 고용 때문에의 핵의 안정성의 냉동 당시 해동 조직을, 우리가 여기에서 제시한 접근 방식이 인류의 다양한 적용됩니다 것을 기대하고 있습니다.했습니다 에 관해서는 조금 만 같은 세포에서 염색질 immunoprecipitation 이제 훨씬 더 포괄적인 게놈 범위 ⁴ 가능하기 때문에, 우리가 위의 권장되는 자료를 시작하는 1000 MG보다 훨씬 적게 사용할 수 있습니다.

Materials

Reagents: 1. Lysis Buffer 0.32M Sucrose 5.47 g 5 mM CaCl2 250 μl 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 0.1 mM EDTA 10 μl 10mM Tris-HCl, pH8 500 μl 1 mM DTT 17 μl 0.1% Triton X-100 50 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 2. Sucrose Solution 1.8 M Sucrose 30.78 g 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 1 mM DTT 17 μl 10 mM Tris-HCl, pH8 500 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 3. Dounce buffer 10 mM Tris 0.242 g 4 mM MgCl2 0.163 g 1 mM CaCl2 0.03 g Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water