İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon

Summary

Beyin dokusunda hücresel heterojenite testlerin çoğu tek hücreli çözünürlük eksikliği nedeniyle kromatin epigenetik işaretlerin çalışma için önemli bir sınırlama teşkil etmektedir. Nöronlar genellikle glia ve diğer non-nöronal hücreler ile iç içe. Biz özü ve insan beyninin nöron çekirdekleri toplamak için bir protokol sağlar.

Abstract

Insan beyninin nöron prenatal gelişimi sırasında büyük ölçüde postmitotic hale gelir, ve böylece tam ömrü boyunca çekirdekleri korumak. Ancak gelişme ve yaşlanma ders sırasında nöronal kromatin ve nükleer organizasyon değişiklikleri veya kronik nöropsikiyatrik hastalık hakkında bilinen çok az. Ancak bugüne kadar, en Kromatin ve DNA tabanlı testlerin (FISH dışında) eksikliği, tek hücreli çözünürlük. Nöronların genellikle çeşitli alt popülasyonlar glia ve diğer non-nöronal hücrelerin farklı türleri ile iç içe, çünkü bu amaçla, beyin dokusu önemli hücresel heterojenite, önemli bir sınırlama teşkil etmektedir. Hücre türüne özgü kültürleri büyümeye olası bir çözüm olurdu, ama nöronlar da dahil olmak üzere en çok merkezi sinir sistemi hücreleri, sadece birkaç hafta için, en azından, sürdürülebilir ex vivo ve böylece potansiyel olarak tam ömrü boyunca faaliyet epigenetik mekanizmalar için eksik bir model sağlayacak . Burada, (sabit asla) dondurulmuş insan postmortem beyin çekirdeklerinin özü ve arındırmak için bir protokol sağlar. Bu yöntem, anti-neun antikor ile Ultrasantrifügasyon ve immunotagging takip Hipotonik lizis tamponu çekirdeklerinin çıkarılması içerir. Etiketli nöronal çekirdeklerinin daha sonra floresan aktive sıralama kullanılarak ayrı toplanır. Bu yöntem, türlerin geniş bir yelpazede herhangi bir beyin bölgesi için geçerli olup, site ve modifikasyon özgü anti-histon antikorlar ve DNA metilasyon ve diğer testleri ile kromatin immunoprecipitation çalışmalar için uygun olmalıdır.

Protocol

Çekirdekler Ekstraksiyon

1. Bir douncer 5 ml Lizis Tampon ^1, 250 mg donmuş postmortem beyin dokusu koyun ve buz üzerine yerleştirin. Sıralama FACS sonra yaklaşık 5 milyon çekirdekleri almak için, genellikle örnek başına 1000 mg doku kullanın.
2. Doku çözülmüş sonra, buz üzerinde ise 1 dakika için doku Dounce.
3. Homojenize doku ve 15 ml açık ultrasantrifüjdeki tüp içine yerleştirin. Buz tüpü koyun.
4. 9 Sakkaroz Çözüm ² mL pipet ile alın açık ultrasantrifüjdeki tüpün dibinde pipet koymak ve Sakkaroz Çözüm ² üstüne homojenize doku çözümü ile bir konsantrasyon degrade oluşturmak için Sakkaroz Çözüm ² serbest.
5. Ultrasantrifüjdeki içinde dönerken tüm dengeli olacağına emin olmak için ultrasantrifüjdeki tüpler tartılır. Lizis Tampon ^1, üst tabaka eklenerek ağırlığı herhangi bir ayarlamaları yapın .
6. Tüpler tartılır sonra, rotor kova içine koyun.
7. SW28 rotor içine yerleştirin ve tüm kovalar rotor ultrasantrifüjdeki dikkatlice yerleştirin.
8. 4 2,5 saat süreyle 107163,6 RCF örnekleri ultrasantrifüjdeki ° C
9. Tüpün alt kısmındaki çekirdekleri içeren pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, bir vakum kullanımı ile, konsantrasyon farkı Bulunan enkaz tabakası ile birlikte, süpernatant kaldırmak.
10. 1X PBS 500 mcL her pelet ekleyin ve 20 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Bu pelet, daha sonra mekanik stres miktarını azaltır çekirdekleri deneyimi, yukarı ve aşağı pipetleme çözmek için kendi başına çözmek için biraz izin verir.
11. Çekirdekleri, 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe sonra, mekanik 1XPBS içinde çekirdekleri tamamen erimesi için aşağı yukarı pipet ve.
12. Çekirdekleri içeren çözüm ultrasantrifüjdeki tüpleri çıkarın ve 2 mL tek mikrosantrifüj tüpe iki tüp içeriğini birleştirmek. Yine, buz örnekleri yer.

FACS için immün

1. Bu noktada, birincil ve ikincil antikor oluşan bir immün karışımı yapmak ve Engelleme karıştırın. Her bir numune için 300, 1.2 Neun antikor,% 0.5 BSA ve% 10 Normal Keçi 1XPBS Serum ve Alexa Fluor 488 1 mcL içeren Engelleme Mix, 100 mcL mcL içeren 1XPBS mcL birleştirir. Kontrol örnekleri için, birincil antikor Neun dışlamak yerine, sadece daha fazla 1XPBS eklemek.
2. Vorteks immün karışımı 5 dakika karanlıkta, oda sıcaklığında ve kuluçkaya yatmaktadır.
3. Boyama karışımı inkübe iken, numuneler için kontrollerini yapmak. Yalnız çekirdekleri içeren bir örnek sıralama FACS için, "lekesiz kontrol" tabi olarak adlandırılan ikinci bir örnek, bir negatif kontrol, birincil antikor Neun de tabi olmadan ikincil antikor Alexa Fluor 488 çekirdekleri içeren.
4. 980 uL negatif kontrol 1XPBS içeren başka bir 2 ml tüp içine 1XPBS lekesiz kontrolü için, ve başka bir 20 mcL içeren 2 ml mikrosantrifüj tüpe çözüm içeren çekirdeğinin kısım 20 mcL. Hacmi çekirdekleri içeren 1XPBS 1 ml yedeklemek örnek kaldırın. Tüm numuneler, buz üzerinde geri yerleştirilir.
5. Immün karışımı inkübe tamamladı Şimdi uygun numuneler 401 mcL içeriğini ekleyin. Olumsuz örnek içeren karışımın sadece ikincil antikor Alexa Fluor 488 alacaksınız çekirdekleri örnek, hem Neun ve Alexa Fluor 488 içeren karışım alacaksınız.
6. 45 dakika boyunca karanlıkta döndürmek için soğuk oda içine örnekleri alın.
7. Örnekleri 45 dakika boyunca karanlıkta inkübe sonra, buz koyun ve FACS tesisi getirin. FACS tesisine taşıma sırasında, örnekleri, buz üzerinde ve karanlıkta tutulmalıdır.

FACS

1. FACS tesiste, 40 um filtresi aracılığıyla numuneler filtre. Sonra, soğuk tutuluyor sıralamadan önce bazı ön verileri elde etmek için, onları bir kaç dakika aracı ile çalışacak.
2. Bu noktada, bu sıralama için gerekli olan uygun kapılarını ayarlamak için gereklidir. Birkaç ayrı ayrı kapılardan tür örnekleri için kullanılır. Ilk kapısı örnek içinde bulunan farklı çekirdeğinin boyutu hakkında bir fikir verir ve gerçek çekirdekleri enkaz separatation sağlar. İkinci kapı bizi tek tek çekirdekleri sıralamak için izin verir. Bu noktada atın herhangi bir agrega atılır. Son olarak, üçüncü kapı bizim sekonder antikoru bulundu florokrom bu eşleşen, belirli bir floresan dalga boyu ayarlanır. Bu kapıdan yerleştirilmesi bize düzenlemenize olanak sağlar ve bu nedenle ayrı Neun + Neun nöronal çekirdeklerin çekirdekleri.
3. Bütün kapıları seçilmiştir sonra, çekirdekleri 1XPBS sıralanabilir.
4. Sonratüm örnek geçti, aracı ile sıralanmış örnek bir kısım çalışan tür saflık kontrol edin. Örnek floresan yayılmamış değil, tek bir kadran içinde yer emin olun. % 90'ın üzerinde saf örnekleri seçmek için en iyisidir.

FACS sonra

1. Örnek çekirdekleri işleme başlayabilirsiniz sıralanır olmuştur. 10 ml sıralaması örnek alın ve Sakkaroz Çözüm ² uL 1M CaCl _2, 50 ve 30 ul 1m Mg (As) ₂ 2 mL ekleyin. Bir hatırlatma olarak, her zaman örnek çekirdekleri Sabitlenmemiş beri buz üzerinde tutmak için emin olun.
2. Az 10 ml sıralaması örnek varsa, 1XPBS ekleyerek 10 ml sesini yükseltmek, ya da ek maddeler buna göre ayarlamak.
3. 15 dakika boyunca örnek birkaç kez buz üzerinde ve yerde tersine çevirin.
4. , 4, örnekleri 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe sonra 15 dakika boyunca 1786 RCF bir salıncak kova rotor ^{santrifüj °} C
5. Borunun alt kısmında bulunan beyaz pelet bozmadan, bir vakum kullanımı ile süpernatant atın.
6. 200 ul geçmeden deneyler için gerekli her türlü çözüm pelet çözülür ve pipet ve aşağı yukarı.
7. Çözüm küçük bir tüp içine aktarın ve daha sonra kullanmak kadar -80 ° C derin dondurucu içine yerleştirin.

Discussion

Burada sunulan protokol daha genel nöronal kromatin epigenetik değişiklikler ve odaklanmış çalışmaları için özellikle yararlı olacaktır, normal gelişmekte olan ve yaşlanma veya nörolojik veya psikiyatrik bir hastalık sırasında nöronal çekirdeği, moleküler fenotipi. Bu yöntem, potansiyel yaşlanma seyri sırasında nöron glia rasyon vardiya veya hastalık nedeniyle beyin dokusunda hücresel heterojenite bir ^endişe 1 belli bir avantajdır . Örneğin, bugünkü sıralama protokolü kromatin immunoprecipitation teknikleri ile birleştirerek, son zamanlarda nörotrofik faktör (BDNF) gen promoter elde edilen beyin nöron spesifik histon metilasyon kalıpları açıklanan ve Ek nöronal genler için ^2. Retrospektif doğum escort ³ yetişkin serebral korteks nöronları toplamak için önceden benzer bir yöntem kullanılır olmuştu. Sıralama tekniği de fare beyin ² istihdam ve çekirdeklerin kararlılık nedeniyle dondurulmuş sonra çözülmüş doku, burada sunulan yaklaşımı türlerin geniş bir yelpazede uygulanabilir olduğunu tahmin ediyoruz. Için en az 10.000 hücrelerin kromatin immunoprecipitation şimdi daha kapsamlı bir genom kapsama ⁴ için bile mümkün olduğundan, yukarıda önerilen malzeme başlayan 1000 mg daha az kullanmak mümkün olabilir.

Materials

Reagents: 1. Lysis Buffer 0.32M Sucrose 5.47 g 5 mM CaCl2 250 μl 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 0.1 mM EDTA 10 μl 10mM Tris-HCl, pH8 500 μl 1 mM DTT 17 μl 0.1% Triton X-100 50 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 2. Sucrose Solution 1.8 M Sucrose 30.78 g 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 1 mM DTT 17 μl 10 mM Tris-HCl, pH8 500 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 3. Dounce buffer 10 mM Tris 0.242 g 4 mM MgCl2 0.163 g 1 mM CaCl2 0.03 g Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water