Summary
Die postnatale Rattenmodell für hypoxisch-ischämischen Hirn-Trauma ist ein gut etabliertes Modell der menschlichen Neugeborenen hypoxisch ischämischen Enzephalopathie (HIE). In diesem Artikel beschreiben wir das Modell der HIE in postnatalen Rattenjungen.
Abstract
Hypoxisch-ischämischen Enzephalopathie (HIE) ist die Folge der systemischen Asphyxie auftreten bei der Geburt. Fünfundzwanzig Prozent der Neugeborenen mit HIE entwickeln schweren und dauerhaften neuropsychologischen Spätfolgen, darunter geistige Retardierung, Zerebralparese und Epilepsie. Die Ergebnisse der HIE sind verheerend und permanent, so dass es kritisch zu identifizieren und zu entwickeln, therapeutische Strategien zu Hirnverletzungen bei Neugeborenen reduzieren mit HIE. Zu diesem Zweck hat die neugeborenen Rattenmodell für hypoxisch-ischämischen Hirn-Trauma wurde entwickelt, um diese conditio humana Modell. Die HIE-Modell wurde erstmals von Vannucci et al 1 validiert und ist seitdem intensiv genutzt, um Mechanismen der Hirnschädigung durch perinatale Hypoxie-Ischämie 2 zu identifizieren und zu testen, mögliche therapeutische Interventionen 3,4. Die HIE-Modell ist ein zweistufiger Prozess und umfasst die Ligation der linken Arteria carotis communis durch die Exposition gegenüber einer hypoxischen Umgebung gefolgt. Zerebralen Blutflusses (CBF) in der Hemisphäre ipsilateral zur ligiert Halsschlagader nicht wegen der Sicherheit des Blutflusses über den Kreis der Willis Rückgang, allerdings mit geringeren Sauerstoff-Partialdruck nimmt die CBF in der ipsilateralen Hemisphäre deutlich und führt zu einseitigen ischämischen Schädigung . Die Verwendung von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) zu färben und zu identifizieren ischämische Hirngewebe wurde ursprünglich für die Erwachsenen-Modelle von Nagetier zerebraler Ischämie 5 entwickelt, und wird verwendet, um das Ausmaß der zerebralen infarctin zu frühen Zeitpunkten bewerten bis zu 72 Stunden nach dem ischämischen Ereignis 6. In diesem Video zeigen wir die hypoxisch-ischämischen Schädigung Modell in postnatalen Rattenhirn und der Auswertung der Infarktgröße mittels TTC-Färbung.
Protocol
Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Stanford University und hält sich an die National Institutes of Health Richtlinien für die Verwendung von Versuchstieren verabschiedet.
Neonatal Rat HIE-Modell
- Post-Natal-Tag (PND) 7 Sprague-Dawley Ratten Welpen (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) sind voll mit Isofluran (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL, 3-4% für Induktions-und 1-2% für Wartung).
- Durch einen kleinen Schnitt in den Hals gemacht (Extra Thin Iris Scissors # 14088-10, Fine Science Tools Inc, Foster City, CA) auf der linken Arteria carotis communis (CCA) aussetzen.
- Der CCA ist mit 5-0 Seidenfaden (5-0 Seide, Ethicon, Somer, NJ) ligiert.
- Der Schnitt wird mit Cyanacrylat-Klebstoff (Elmers Products Inc, Columbus, OH) geschlossen. Der Schnitt wird mit Klebeband abgedeckt und Anästhesie wird gestoppt. Die Welpen sind, um ihre Mutter zurück und lässt 1-2 Stunden erholen.
- Welpen sind dann in einer hypoxischen Kammer, die 8% Sauerstoff mit 92% Stickstoff für 100 Minuten bei 37 ° C. ausgewogenen enthält platziert 8% oxygen/92% Stickstoff (Airgas, Sacramento, CA) fließen über einen Schlauch in die Maus Käfig mit einer Kunststoffabdeckung ausgestattet. Der Deckel unternommen wird, um den Käfig fit und hat zwei Löcher von 2 cm im Durchmesser, ermöglicht eine davon mit dem Rohr verbunden, um die 8% Sauerstoff Gastank und anderen erhalten das Gas flowout. Die Kammer ist in ein Wasserbad gestellt und ist bis vor gewärmt zu bedienen und ein Thermometer im Inneren der muss 37 ° C vor Beginn der Hypoxie zu registrieren.
- Am Ende der 100 Minuten von Hypoxie, sind die Welpen wieder zu ihren Damm für die Verwertung zurückgegeben.
- 24 Stunden nach dem Ende der Hypoxie, sind Welpen durch tiefe Narkose mit Isofluran getötet. Hirngewebe wird mit kaltem physiologischer Kochsalzlösung perfundiert, gefolgt von einer Lösung aus kaltem 1% TTC in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 (Sigma Chemical Co, St Louis, MO). TTC muss immer vor Licht geschützt werden.
- Brains entfernt und gekühlt 1-2 Minuten auf dem Eis, und vier koronalen Abschnitte 3 mm auseinander (Ebenen 1-4) geschnitten werden, beginnend rostral auf der Ebene der opticchiasm und Infundibulum, entsprechend der Bregma 1,8 ~ 2,0 mm Höhe der adulten Maus Gehirn.
- Hirnschnitten werden in TTC-Lösung getaucht und bei 37 ° C für 8 Minuten, gefolgt von Fixierung in 4% Paraformaldehyd / PBS über Nacht. Da TTC lichtempfindlich ist, halten Scheiben fern von Licht in dieser Zeit.
- Der TTC gefärbten Schnitten werden gescannt und digitalisiert. Mit Bild-J (NIH, Bethesda, MD), die folgenden sind für jede Ebene gemessen: Bereich des Infarktes (ungefärbten Bereich), im Bereich der ipsilateralen Hemisphäre und im Bereich der kontralateralen Hemisphäre. Der prozentuale Infarktareal pro Scheibe wie folgt berechnet: (Bereich der Infarkt / Bereich der ipsilateralen Hemisphäre) oder A 1, A 2, A 3 und A 4. Der prozentuale Volumen des Infarkts ist als die Summe (A 1 + A 2 + A 3 + A 4) * 3mm berechnet. Bereiche der kortikalen oder striatalen Verletzungen können auch separat in einer ähnlichen Weise quantifiziert werden.
Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Vertreter HIE koronalen Ebenen 1-4 gefärbt mit TTC.
TTC gefärbten koronalen Abschnitte demonstrieren Bereich der Infarkt (in weiß).
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Discussion
Das Nagetier postnatale HIE-Modell ist ein etabliertes Modell, rekapituliert zerebralen Hypoxie in der perinatalen Periode bei Neugeborenen auftreten. Umfangreiche histologische und immunhistochemische Charakterisierung Studien haben gezeigt, dass die 7 Tage alte Nagetier der analogen Gehirn Reife zu einer dritten Trimester menschlichen Fötus 7 Modell hat. Das Nagetier HIE-Modell wurde sehr informativ für das Verständnis der Mechanismen der Hirnschädigung von perinatalen Hypoxie 2, wo Eingriffe wie Hypothermie wurde mit 3 validiert sind. Dieses Modell wurde zunächst in Ratten perfektioniert und in jüngerer Zeit an Mäusen 8 angepasst.
Es gibt bestimmte technische Details, die Erwähnung verdienen:
- Vor Ligation des CCA, achten Sie darauf, Bindegewebe und Vagus, die CCA verwickeln können, zu entfernen. Mit der erfolgreichen Ligation des CCA, sollte das Schiff Farbe über dem Ligationsstelle wiederum weiß. Alternativ ist es auch empfehlenswert, doppelt ligiert und schneiden in der Mitte von zwei Ligationsstelle. Decken Sie die Inzision über dem ligiert CCA mit Etikettenband, bevor Sie den Welpen wieder mit seiner Mutter.
- Eine maximale Dauer von nicht mehr als 10 Minuten der Anästhesie für jedes Jungtier ist optimal für die CCA-Ligation und Erfolg.
- Die Erholungsphase nach der CCA Ligation sollte 90-120 Minuten sein. Wenn kürzer, die Welpen weniger wahrscheinlich, um zu überleben, und wenn mehr wird es mehr Variabilität des Infarktes sein, Tendenz zu kleineren Infarkten.
- Die Temperatur ist von entscheidender Bedeutung. Immer Platz ein Thermometer in die Kammer und dass die Temperatur bei 37 ° C. Die Länge der Hypoxie kann 90 bis 120 Minuten, je nach Situation und Schwere der Verletzung die Sie erreichen wollen variieren.
- TTC-Färbung ist anwendbar für die Analyse von Infarktvolumen bis zu 72 Stunden nach HIE. Längere Überlebenszeit Punkte sollten durch Schneiden und Kresylviolett-Färbung, die Infarktgröße zu bestimmen beurteilt werden.
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Acknowledgments
Gefördert durch American Heart Association und March of Dimes.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley Rat Pups | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Isoflurane | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| 8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas | Surgery | Airgas | ||
| 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 |
References
- Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of neurology. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, R. C., Vannucci, S. J. Perinatal Hypoxic-Ischemic Brain Damage: Evolution of an Animal Model. Dev Neurosci. 27 (2-4), 81-86 (2005).
- Bona, E., Hagberg, H., Loberg, E. M. Protective effects of moderate hypothermia after neonatal hypoxia-ischemia: short- and long-term outcome. Pediatric research. 43 (6), 738-738 (1998).
- Trescher, W. H., Ishiwa, S., Johnston, M. V. Effects of hypothermia and hyperthermia on attentional and spatial learning deficits following neonatal hypoxia-ischemic insult in rats. Behavioural brain research. 151 (1-2), 209-209 (2004).
- Mishima, K., Ikeda, T., Yoshikawa, T. Brief post-hypoxic-ischemic hypothermia markedly delays neonatal brain injury. Brain development. 19 (5), 326-326 (1997).
- Young, R. S., Olenginski, T. P., Yagel, S. K. The effect of graded hypothermia on hypoxic-ischemic brain damage: a neuropathologic study in the neonatal rat. Stroke; a journal of cerebral circulation. 14 (6), 929-929 (1983).
- Bederson, J. B., Pitts, L. H., Germano, S. M., et al. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17 (6), 1304-1304 (1986).
- Cai, J., Kang, Z., Liu, W. W. Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Neuroscience letters. 441 (2), 167-167 (2008).
- Grow, J., Barks, J. D. Pathogenesis of hypoxic-ischemic cerebral injury in the term infant: current concepts. Clinics in perinatology. 29 (4), 585-585 (2002).
- Aden, U., Halldner, L., Lagercrantz , H., et al. Aggravated brain damage after hypoxic ischemia in immature adenosine A2A knockout mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 34 (3), 739-739 (2003).
