Summary
نموذج الفئران بعد الولادة لإصابات الدماغ بنقص الأكسجة الدماغية ، هو نموذج راسخة من اعتلال الدماغ بنقص الأكسجة الدماغية الولدان الإنسان (عجل). في هذه المقالة ، ونحن تصف نموذجا للعجل في الفئران الوليدة بعد الولادة.
Abstract
الدماغية ، الاعتلال ميتة (عجل) هو نتيجة لحدوث اختناق النظامية عند الولادة. خمسة وعشرون في المئة من الولدان المصابين عجل تطوير عقابيل عصبية شديدة ودائمة ، بما في ذلك التخلف العقلي والشلل الدماغي ، والصرع. نتائج مدمرة عجل ودائم ، مما يجعل من الأهمية بمكان لتحديد وتطوير الاستراتيجيات العلاجية للحد من إصابات الدماغ في الأطفال حديثي الولادة مع عجل. تحقيقا لهذه الغاية ، تم وضع نموذج الفئران حديثي الولادة لإصابات الدماغ بنقص الأكسجة الدماغية ، لنموذج هذا الشرط البشري. وكان أول من التحقق من صحة النموذج عجل بواسطة Vannucci وآخرون (1) ومنذ ذلك الحين يستخدم على نطاق واسع لتحديد آليات إصابات الدماغ الناجم عن نقص الأكسجين 2 - قبل الولادة ونقص التروية لاختبار التدخلات العلاجية المحتملة 3،4. نموذج عجل هو عملية من خطوتين وينطوي على ربط الشريان السباتي الأيسر المشتركة يليه التعرض للبيئة ميتة. تدفق الدم الدماغي (البرازيلي) في نصف الكرة المماثل لالشريان السباتي ligated لا يتناقص بسبب ضمانات تدفق الدم عبر دائرة ويليس ، ولكن مع خفض التوتر الأكسجين ، والبرازيلي في نصف الكرة المماثل يقلل بشكل ملحوظ ونتائج الإصابة الدماغية في جانب واحد . وضعت أصلا للاستخدام triphenyltetrazolium 2،3،5 - كلوريد (TTC) لتحديد وصمة عار ونقص تروية أنسجة المخ لنماذج البالغين من نقص تروية الدماغ القوارض 5 ، ويستخدم لتقييم مدى infarctin الدماغي عند نقاط وقت مبكر يصل إلى 72 بعد ساعات من الحدث الدماغية 6. في هذا الفيديو ، ونحن لشرح النموذج الاصابة بنقص الأكسجة الدماغية ، في المخ الفئران بعد الولادة ، وتقييم حجم احتشاء باستخدام TTC تلطيخ.
Protocol
وتمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان اللجنة استخدم في جامعة ستانفورد وتلتزم المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية لاستخدام حيوانات التجارب.
الولدان نموذج الجرذ عجل
- آخر يوم الولادة (PND) 7 الفئران الوليدة سبراغ داولي (مختبرات نهر تشارلز ، شركة ، ويلمنجتون ، MA) يتم تخدير الكامل مع isoflurane (Aerrane ، باكستر ، ديرفيلد ، IL ؛ 3-4 ٪ لتحريض و 1-2 ٪ لل الصيانة).
- يتم إجراء شق صغير في الرقبة (إضافي رقيقة إيريس مقص # 14088-10 الجميلة العلوم أدوات المؤتمر الوطني العراقي ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا) لفضح الشريان السباتي الأيسر المشترك (CCA).
- هو ligated التقييم القطري المشترك مع خياطة الحرير 5-0 (5-0 الحرير ، Ethicon ، سومر ، ونيو جيرسي).
- يتم إغلاق الشق بمادة لاصقة cyanoacrylate (إلميرز المنتجات المؤتمر الوطني العراقي ، كولومبوس ، أوهايو). تتناول الشق مع الشريط ويتوقف التخدير. وعاد السد الى الجراء ، وسمح لفترة نقاهة لمدة 1-2 ساعات.
- ثم توضع في غرفة الجراء نقص الأوكسجين الذي يحتوي على الأكسجين بنسبة 8 ٪ متوازنة مع النيتروجين 92 ٪ لمدة 100 دقيقة عند 37 درجة مئوية. 8 غاز النيتروجين oxygen/92 ٪ ٪ (Airgas ، سكرامنتو ، كاليفورنيا) عبر أنبوب تدفق في قفص الماوس تجهيزه بغطاء بلاستيكي. يتكون الغطاء لائقا لالقفص ، واثنين من الثقوب 2 سم في القطر ، واحدة منها لاستقبال الأنبوب متصلا خزان الأوكسجين الغاز بنسبة 8 ٪ وآخر يسمح للغاز لflowout. وضعت الغرفة في حمام مائي واستعد قبل الاستخدام ومقياس الحرارة من الداخل يجب أن تسجل 37 درجة مئوية قبل بدء نقص الأكسجة.
- في نهاية 100 دقيقة من نقص الأكسجين ، وعاد مرة أخرى لالجراء السد من أجل الانتعاش.
- بعد 24 ساعة من نهاية نقص الأكسجين ، والموت الرحيم الجراء بواسطة التخدير العميق مع isoflurane. هو perfused أنسجة المخ بمحلول ملحي عادي الباردة ، تليها حل الباردة TTC 1 ٪ في الفوسفات مخزنة المالحة ، ودرجة الحموضة 7.4 (سيغما كميكال ، وسانت لويس ، MO). يجب أن يبقى TTC محمية من الضوء.
- تتم إزالة العقول وتبرد لمدة 1-2 دقائق على الجليد ، وأربعة أقسام الاكليلية 3 مم وبصرف النظر (المستويات 1-4) يتم قطع ، في بداية rostrally مستوى opticchiasm والقمع ، المقابلة لbregma ~ 1.8 مم 2.0 من مستوى مخ الفأر الكبار.
- مغمورة شرائح الدماغ في حل TTC والمحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق ، تليها في تثبيت بارافورمالدهيد 4 ٪ / PBS بين عشية وضحاها. لأن TTC خفيف الحساسة ، والحفاظ على شرائح بعيدا عن الضوء خلال هذا الوقت.
- يتم فحص الأجزاء ملطخة TTC والرقمية. J باستخدام الصور (المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا ، دكتوراه في الطب) ، ويتم قياس ما يلي لكل مستوى : مساحة احتشاء (منطقة غير ملوثين) ، ومنطقة نصف الكرة المماثل ، ومنطقة نصف الكرة الأرضية المقابل. احتشاء في المئة في المنطقة ويتم احتساب شريحة على النحو التالي : (منطقة احتشاء / منطقة نصف الكرة المماثل) أو A 1 ، A 2 ، A 3 و 4 A. يتم حساب حجم المئة من احتشاء كمجموع (A 1 + A 2 + A 3 + A 4) * 3mm. ويمكن أيضا مناطق الاصابة القشرية المخططية يمكن قياسها كميا ، أو بشكل منفصل بطريقة مماثلة.
ممثل النتائج
الشكل 1. ممثل عجل مستويات الاكليلية 1-4 ملطخة TTC.
أقسام TTC الاكليلية ملطخة تثبت مجال احتشاء (بيضاء).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نموذج القوارض عجل بعد الولادة هو نموذج يثبت أن يجمل نقص الأكسجة الدماغية التي تحدث في فترة ما بعد الولادة في المناطق القريبة من المواليد الجدد. وقد أظهرت دراسات واسعة وتوصيف النسيجي immunocytochemical أن القوارض 7 أيام العمر والنضج في المخ مماثلة لنموذج 1 / 3 7 الثلث الجنين البشري. لقد كان النموذج عجل القوارض مفيدة للغاية لفهم آليات إصابات الدماغ من شبه الولادة نقص الأكسجة 2 ، حيث تم التحقق من صحة مثل هذه التدخلات وانخفاض حرارة الجسم 3. في البداية كان الكمال هذا النموذج في الفئران ، ومؤخرا تتكيف مع الفئران 8.
هناك تفاصيل تقنية محددة تضمن أن نذكر :
- قبل ربط التقييم القطري المشترك ، يجب التأكد من إزالة النسيج الضام ، والعصب المبهم الذي قد يورط التقييم القطري المشترك. مع ربط النجاح في التقييم القطري المشترك ، ينبغي للسفينة اللون فوق موقع ربط بدوره البيض. بدلا من ذلك ، فمن المستحسن أيضا أن يتضاعف ligate وقطع في وسط موقع ربط اثنين. تغطية أكثر من شق في CCA ligated مع الشريط التسمية قبل وضع الظهر الجرو مع السد والخمسين.
- والحد الأقصى لمدة أكثر من 10 دقيقة ليست من التخدير لكل الجرو هو الأمثل لربط التقييم القطري المشترك ونتائج ناجحة.
- وينبغي أن فترة النقاهة بعد ربط CCA تكون 90-120 دقيقة. إذا كان أقصر ، الجراء هم أقل عرضة للبقاء على قيد الحياة ، وإذا كان أطول سيكون هناك المزيد من التقلبات من احتشاء ، وتميل نحو أصغر عوائق.
- درجة الحرارة الحرجة. دائما مكان ميزان حرارة في الغرفة والمحافظة على درجة حرارة بلغت 37 درجة مئوية. قد تختلف طول نقص الأكسجة 90-120 دقيقة اعتمادا على الوضع وشدة الإصابة تريد تحقيقه.
- TTC تلطيخ ينطبق على تحليل حجم احتشاء تصل إلى 72 ساعة بعد عجل. وينبغي تقييم تعد النقاط الزمنية التي sectioning بقاء وتلطيخ cresyl البنفسجي لتحديد حجم احتشاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
بتمويل من جمعية القلب الاميركية ومارس من الدايمات.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley Rat Pups | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Isoflurane | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| 8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas | Surgery | Airgas | ||
| 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 |
References
- Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of neurology. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, R. C., Vannucci, S. J. Perinatal Hypoxic-Ischemic Brain Damage: Evolution of an Animal Model. Dev Neurosci. 27 (2-4), 81-86 (2005).
- Bona, E., Hagberg, H., Loberg, E. M. Protective effects of moderate hypothermia after neonatal hypoxia-ischemia: short- and long-term outcome. Pediatric research. 43 (6), 738-738 (1998).
- Trescher, W. H., Ishiwa, S., Johnston, M. V. Effects of hypothermia and hyperthermia on attentional and spatial learning deficits following neonatal hypoxia-ischemic insult in rats. Behavioural brain research. 151 (1-2), 209-209 (2004).
- Mishima, K., Ikeda, T., Yoshikawa, T. Brief post-hypoxic-ischemic hypothermia markedly delays neonatal brain injury. Brain development. 19 (5), 326-326 (1997).
- Young, R. S., Olenginski, T. P., Yagel, S. K. The effect of graded hypothermia on hypoxic-ischemic brain damage: a neuropathologic study in the neonatal rat. Stroke; a journal of cerebral circulation. 14 (6), 929-929 (1983).
- Bederson, J. B., Pitts, L. H., Germano, S. M., et al. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17 (6), 1304-1304 (1986).
- Cai, J., Kang, Z., Liu, W. W. Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Neuroscience letters. 441 (2), 167-167 (2008).
- Grow, J., Barks, J. D. Pathogenesis of hypoxic-ischemic cerebral injury in the term infant: current concepts. Clinics in perinatology. 29 (4), 585-585 (2002).
- Aden, U., Halldner, L., Lagercrantz , H., et al. Aggravated brain damage after hypoxic ischemia in immature adenosine A2A knockout mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 34 (3), 739-739 (2003).
