Summary
Le modèle de rat postnatal pour une lésion cérébrale hypoxique-ischémique est un modèle bien établi de ressources humaines encéphalopathie néonatale hypoxique-ischémique (EHI). Dans cet article, nous décrivons le modèle de la HIE chez les bébés rats post-natale.
Abstract
Encéphalopathie hypoxique-ischémique (EHI) est la conséquence d'une asphyxie systémiques survenant à la naissance. Vingt cinq pour cent des nouveau-nés avec EHI développer des graves et permanents séquelles neuropsychologiques, notamment un retard mental, paralysie cérébrale, et l'épilepsie. Les résultats de l'EHI sont dévastatrices et permanentes, ce qui rend essentiel d'identifier et de développer des stratégies thérapeutiques visant à réduire les lésions cérébrales du nouveau-né avec HIE. À cette fin, le modèle du rat nouveau-né pour les lésions cérébrales hypoxiques-ischémiques a été développé pour modéliser cette condition humaine. Le modèle a d'abord été HIE validée par Vannucci et al 1 et a depuis été largement utilisée pour identifier les mécanismes de lésions cérébrales résultant d'hypoxie-ischémie périnatale 2 et de tester le potentiel des interventions thérapeutiques 3,4. Le modèle HIE est un processus en deux étapes et implique la ligature de l'artère carotide commune gauche suivie d'une exposition à un environnement hypoxique. Le débit sanguin cérébral (CBF) dans l'hémisphère ipsilatéral à l'artère carotide ligaturée ne diminue pas à cause de la circulation collatérale via le cercle de Willis, mais avec une tension en oxygène plus faible, la CBF dans l'hémisphère ipsilatéral diminue de manière significative et les résultats dans les lésions ischémiques unilatérale . L'utilisation de 2,3,5-chlorure de triphényltétrazolium (TTC) à la tache et d'identifier le tissu cérébral ischémique a été initialement développé pour les modèles adultes de l'ischémie cérébrale chez les rongeurs 5, et est utilisé pour évaluer l'étendue de infarctin cérébrale à des moments au début jusqu'à 72 heures après l'événement ischémique 6. Dans cette vidéo, nous démontrons le modèle de lésion hypoxique-ischémique dans le cerveau de rat postnatal et l'évaluation de la taille de l'infarctus utilisant une coloration TTC.
Protocol
Ce protocole a été approuvé par le soin des animaux et du Comité institutionnel Utiliser à l'Université Stanford et respecte les National Institutes of Health des lignes directrices pour l'utilisation des animaux de laboratoire.
Néonatale modèle HIE Rat
- Message jours natale (DPN) 7 bébés rats Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Inc, Wilmington, MA) sont pleinement anesthésiés à l'isoflurane (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL, 3-4% pour l'induction et 1-2% pour d'entretien).
- Une petite incision est faite dans le cou (extra mince Ciseaux Iris # 14088-10, Beaux-Sciences Tools Inc, Foster City, CA) pour exposer l'artère carotide commune gauche (CCA).
- Le CCA est ligaturé avec un fil de suture de soie 5-0 (5-0 soie, Ethicon, Somer, NJ).
- L'incision est fermée avec de la colle cyanoacrylate (Produits Elmers Inc, Columbus, OH). L'incision est recouverte d'un ruban et d'anesthésie est arrêté. Les chiots sont retournés à leur barrage et a permis de récupérer pendant 1-2 heures.
- Les chiots sont alors placés dans une chambre hypoxique qui contient 8% d'oxygène avec l'azote équilibrée de 92% pendant 100 minutes à 37 ° C. 8% d'azote gazeux oxygen/92% (Airgas, Sacramento, CA) des flux via un tube dans la cage de souris équipée d'un couvercle en plastique. La couverture est faite pour s'adapter à la cage et a deux trous de 2 cm de diamètre, dont l'un pour recevoir le tube relié à la cuve de gaz 8% d'oxygène et une autre permet au gaz de flowout. La chambre est placée dans un bain d'eau et est réchauffé avant d'utiliser et d'un thermomètre à l'intérieur de celui-ci doit s'inscrire à 37 ° C avant le début de l'hypoxie.
- A la fin de 100 minutes d'hypoxie, les chiots sont retournés de nouveau à leur mère pour la récupération.
- 24 heures après la fin de l'hypoxie, les chiots sont euthanasiés par une anesthésie profonde à l'isoflurane. Le tissu cérébral est perfusée avec du sérum physiologique froid, suivie par une solution de froid 1% TTC en tampon phosphate salin à pH 7,4 (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO). TTC doivent être conservés abri de la lumière.
- Les cerveaux sont retirés et refroidis pendant 1-2 minutes sur la glace, et quatre coupes coronales de 3 mm d'intervalle (niveaux 1-4) sont réduits, à compter rostralement au niveau de l'infundibulum et opticchiasm, correspondant au bregma 1,8 ~ 2,0 mm au niveau des le cerveau de souris adulte.
- Tranches de cerveau sont immergés dans une solution de TTC et incubées à 37 ° C pendant 8 minutes, suivie d'une fixation au paraformaldéhyde à 4% / PBS nuit. Parce que TTC est sensible à la lumière, garder des tranches abri de la lumière pendant ce temps.
- Les sections colorées TTC sont scannés et numérisés. Utiliser l'image J (NIH, Bethesda, MD), les suivantes sont mesurées pour chaque niveau: zone de l'infarctus (zone non coloré), la zone de l'hémisphère ipsilatéral, et la zone de l'hémisphère controlatéral. La zone infarcie pour cent par tranche est calculé comme suit: (zone de l'infarctus / domaine de l'hémisphère ipsilatéral) ou A 1, A 2, A 3 et A 4. Le volume pour cent de l'infarctus est calculé comme la somme (A 1 + A 2 + A 3 + A 4) * 3mm. Domaines de blessures corticales ou striatales peuvent aussi être quantifiées séparément, d'une manière semblable.
Les résultats représentatifs
Figure 1. Représentant HIE niveaux coronale 1-4 tachés avec TTC.
TTC teinté coupes coronales montrent zone de l'infarctus (en blanc).
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Discussion
Le rongeur modèle postnatale HIE est un modèle établi que l'hypoxie cérébrale récapitule survenant dans la période péri-natale chez les nouveau-nés. De vastes études de caractérisation histologique et immunocytochimique ont démontré que les rongeurs 7 jours anciens a la maturité cérébrale analogue à un modèle 7 du troisième trimestre fœtus humain. Le modèle de rongeur HIE a été très instructive pour comprendre les mécanismes des lésions cérébrales de l'hypoxie périnatale 2, où les interventions telles que l'hypothermie ont été validés 3. Ce modèle a été initialement perfectionné chez le rat et, plus récemment, adaptée à la souris 8.
Il existe des détails techniques qui méritent d'être mentionnés:
- Avant la ligature de la CCA, n'oubliez pas d'enlever le tissu conjonctif et nerf vague qui peut embrouiller la CCA. Avec la ligature réussie de la CCA, la couleur des navires au-dessus du site de ligature doit tourner blanc. Alternativement, il est également recommandé de doubler ligaturer et couper au milieu de deux site de ligature. Couverture de l'incision sur la ligature du CCA avec du ruban d'étiquettes avant de les placer à l'arrière chiot avec sa mère.
- Une durée maximale d'au plus 10 minutes de l'anesthésie pour chaque chiot est optimal pour la ligature des CCA et le succès.
- La période de récupération après ligature du CCA devrait être 90-120 minutes. Si plus courtes, les chiots sont moins susceptibles de survivre, et si plus il y aura une plus grande variabilité de l'infarctus, tendant vers plus petits infarctus.
- La température est critique. Toujours placer un thermomètre dans la chambre et maintenir la température à 37 ° C. La durée de l'hypoxie peut varier de 90 à 120 minutes en fonction de la situation et la gravité des blessures que vous voulez atteindre.
- Coloration TTC est applicable pour l'analyse du volume de l'infarctus de 72 heures après HIE. Plus de points le temps de survie doit être évaluée par sectionnement et coloration violet de crésyl pour déterminer la taille de l'infarctus.
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Acknowledgments
Financé par l'American Heart Association et Mars of Dimes.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley Rat Pups | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Isoflurane | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| 8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas | Surgery | Airgas | ||
| 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 |
References
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