Summary
Hipoksik-iskemik beyin hasarı için postnatal sıçan modelinde, insan yenidoğan hipoksik iskemik ensefalopati (HIE) köklü bir model. Bu makalede, doğum sonrası sıçan Yavrularda HIE modeli açıklanmaktadır.
Abstract
Hipoksik-İskemik Ensefalopati (HIE), doğum sırasında oluşan sistemik asfiksi sonucu. HIE olan yenidoğanlarda yirmi beş oranında zeka geriliği, serebral palsi, ve epilepsi dahil olmak üzere, ciddi ve kalıcı nöropsikolojik sekeller gelişir. HIE sonuçları HIE yeni doğanlarda beyin hasarı azaltmak için tedavi stratejileri belirlemek ve geliştirmek için kritik yapma, yıkıcı ve kalıcı değildir. Bu amaçla, hipoksik-iskemik beyin hasarı için yenidoğan sıçan modelinde bu insanlık durumunun model geliştirilmiştir. HIE modeli ilk Vannucci ve ark 1 doğrulanmış oldu ve o zamandan beri yoğun perinatal hipoksi-iskemi 2 kaynaklanan beyin hasarının mekanizmaları belirlemek ve potansiyel terapötik müdahaleler 3,4 test etmek için kullanılır olmuştur. HIE modeli, iki adımdan oluşan bir süreçtir ve hipoksik ortama maruz sol karotis arter ligasyonu içerir. Yarımkürede bağlanan karotis arteri ipsilateral serebral kan akımı (CBF), çünkü Willis daire ile kollateral kan akımı azalması değil; ancak düşük oksijen basıncı ile ipsilateral yarımkürede CBF önemli ölçüde azaltır ve tek taraflı iskemik hasar sonuçları . 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) iskemik beyin dokusu leke ve tanımlamak için kullanımı başlangıçta kemirgen serebral iskemi 5 yetişkin modeller için geliştirilen ve 72 adete kadar erken zaman noktalarında serebral infarctin ölçüde değerlendirmek için kullanılır. iskemik olay 6 saat sonra. Bu video, postnatal sıçan beyin hipoksik-iskemik yaralanma modeli TTC boyama kullanarak infarkt değerlendirilmesi göstermektedir.
Protocol
Bu protokol, deney hayvanlarının kullanımı için sağlık kuralları Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından, Stanford Üniversitesi ve uymaktadır Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylandı.
Yenidoğan Rat HIE modeli
- Indüksiyonu için% 3-4 ve% 1-2; Post-natal gün (PND) 7 Sprague-Dawley sıçan yavrular (Charles River Laboratuvarları, Inc, Wilmington, MA), (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL izofluran ile tam anestezi bakım).
- Küçük bir kesi (Ekstra İnce Iris Makas # 14.088-10, Güzel Bilim Araçlar A.Ş., Foster City, CA), boyun sol karotis arter (CCA) ortaya çıkarmak için yapılır.
- CCA, 5-0 ipek sütür (5-0 ipek, Ethicon, Somer, NJ) ile bağlandı.
- Kesi siyanoakrilat yapıştırıcı (Elmers Products Inc, Columbus, OH) ile kapatılır. Kesi bant ile kaplanmıştır ve anestezi durdurulur. Yavrular baraj döndü ve iyileşmek için 1-2 saat izin verilir.
- Pups sonra% 8, 37, 100 dakika boyunca% 92 azot ile dengeli oksijen içeren bir hipoksik odasına ° C yerleştirilir % 8 oxygen/92% azot gazı (Airgas, Sacramento, CA), plastik bir kapak ile donatılmış fare kafes içine tüp yoluyla akış. Kapak kafesine uygun yapılan ve 2 cm çapında iki delik vardır, biri,% 8 oksijen gaz tankı ve başka bir bağlı tüpü almak için hangi gaz flowout sağlar. Odasının bir su banyosuna yerleştirilir ve kullanmadan önce ısıtılır ve içinde bir termometre 37 ° C hipoksi başlamadan önce kaydetmeniz gerekir.
- Hipoksi 100 dakika sonunda yavrular kurtarma için baraj tekrar iade edilir.
- Hipoksi sona ermesinden sonra 24 saat, yavrular izofluran ile derin anestezi ile ötenazi. Beyin dokusu, tuzlu, pH 7.4 (Sigma Chemical Co, St Louis, MO) tamponlu fosfat soğuk% 1 TTC bir çözüm, soğuk serum fizyolojik ile perfüze. TTC ışıktan koruyarak saklanmalıdır.
- Brain kaldırılır ve 1-2 dakika, buz ve dört koronal bölümler dışında 3 mm (seviye 1-4) soğutulur opticchiasm ve infundibulum bregma 1.8 'e karşılık gelen düzeyde rostrally başlayarak kesilir ~ 2.0 mm seviyesinde yetişkin bir farenin beyin.
- Beyin dilim TTC çözüm dalmış ve% 4 paraformaldehid / gecede PBS fiksasyonu takiben, 8 dakika 37 ° C inkübe. TTC ışığa duyarlı olduğundan, bu süre içinde, ışıktan dilimleri uzak tutun.
- TTC boyanan kesitler taranır ve dijital. Enfarktüs alanı (lekesiz alan), ipsilateral yarımkürede alanında ve kontralateral yarımkürenin alanı: Resim J (NIH, Bethesda, MD), aşağıdaki her seviye için ölçülür. A 1, A 2, A 3, A 4 (infarkt alanı / ipsilateral yarımkürede alan) ya da yüzde dilim ortalama alanı olarak hesaplanır enfarkte. Enfarkt yüzde hacmi toplamı (A 1 + A 2 + 3 + 4) * 3mm olarak hesaplanır. Kortikal veya striatal yaralanma alanları da benzer bir şekilde ayrı ayrı belirlenebilir.
Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1. TTC Temsilcisi HIE koronal seviyeleri 1-4 boyandı.
TTC lekeli koronal bölümleri infarkt alanı (beyaz) göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Özetlediği serebral hipoksi yenidoğanlarda peri-natal dönemde meydana gelen kemirgen postnatal HIE modeli oluşturulmuş bir model. Kapsamlı histolojik ve immünositokimyasal karakterizasyon çalışmaları 7 gün eski kemirgen, üçüncü trimester insan fetus 7 modeli için analog beyin olgunluğa sahip olduğunu göstermiştir . Kemirgen HIE modeli böyle bir hipotermi gibi müdahaleler 3 valide edilmiş peri-natal hipoksi 2, beyin hasarı mekanizmaları anlamak için çok bilgilendirici olmuştur . Bu model başlangıçta sıçanlarda mükemmel ve daha yakın fareler 8 adapte oldu.
Söz emri özel teknik ayrıntılar vardır:
- CCA ligasyonu önce, bağ dokusu ve CCA ayağına dolanan, vagus nervus kaldırmak için emin olun. CCA başarılı ligasyonu ile ligasyonu sitesi üzerinde geminin rengi beyaz açmalısınız. Alternatif olarak, aynı zamanda Arter çift ve iki ligasyonu sitenin ortasında kesmek için tavsiye edilir. Olan baraj ile yavru geri yerleştirmeden önce bağlanan CCA üzerinde kesi etiket bant ile kaplayın.
- Maksimum anestezi her yavru için 10 dakikadan fazla bir süre CCA ligasyonu ve başarılı bir sonuç için en uygunudur.
- CCA ligasyonu sonrası nekahat süresi 90-120 dakika olmalıdır. Kısa olursa, yavrular hayatta kalmak için daha az olasıdır, ve eğer uzun küçük infarktlar doğru eğilimi, enfarktüs daha fazla değişkenlik olacak.
- Sıcaklık kritik. Her zaman odasında bir termometre ve sıcaklık 37 ° korumak ° C Hipoksi uzunluğu elde etmek istediğiniz yaralanma durumu ve şiddetine bağlı olarak 90 ila 120 dakika arasında değişebilir.
- TTC boyama HIE sonra 72 saat kadar infarkt hacmi analiz için uygulanabilir. Daha uzun yaşam süresi noktaları infarkt boyutunu belirlemek için kesit ve cresyl menekşe boyama değerlendirilmesi gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Amerikan Kalp Derneği ve March of Dimes tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley Rat Pups | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Isoflurane | Surgery | Baxter Internationl Inc. | ||
| 8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas | Surgery | Airgas | ||
| 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 |
References
- Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of neurology. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, R. C., Vannucci, S. J. Perinatal Hypoxic-Ischemic Brain Damage: Evolution of an Animal Model. Dev Neurosci. 27 (2-4), 81-86 (2005).
- Bona, E., Hagberg, H., Loberg, E. M. Protective effects of moderate hypothermia after neonatal hypoxia-ischemia: short- and long-term outcome. Pediatric research. 43 (6), 738-738 (1998).
- Trescher, W. H., Ishiwa, S., Johnston, M. V. Effects of hypothermia and hyperthermia on attentional and spatial learning deficits following neonatal hypoxia-ischemic insult in rats. Behavioural brain research. 151 (1-2), 209-209 (2004).
- Mishima, K., Ikeda, T., Yoshikawa, T. Brief post-hypoxic-ischemic hypothermia markedly delays neonatal brain injury. Brain development. 19 (5), 326-326 (1997).
- Young, R. S., Olenginski, T. P., Yagel, S. K. The effect of graded hypothermia on hypoxic-ischemic brain damage: a neuropathologic study in the neonatal rat. Stroke; a journal of cerebral circulation. 14 (6), 929-929 (1983).
- Bederson, J. B., Pitts, L. H., Germano, S. M., et al. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17 (6), 1304-1304 (1986).
- Cai, J., Kang, Z., Liu, W. W. Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model. Neuroscience letters. 441 (2), 167-167 (2008).
- Grow, J., Barks, J. D. Pathogenesis of hypoxic-ischemic cerebral injury in the term infant: current concepts. Clinics in perinatology. 29 (4), 585-585 (2002).
- Aden, U., Halldner, L., Lagercrantz , H., et al. Aggravated brain damage after hypoxic ischemia in immature adenosine A2A knockout mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 34 (3), 739-739 (2003).
