Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Å skape utenomromosomale DNA-arrayer ved mikroinjeksjon - den enkleste metoden for å generere transgene ormstammer - resulterer i genetiske elementer som ikke er stabilt overført under celledeling og derfor viser variable arvehastigheter og uttrykksnivåer. Målet med å integrere matrisen i et kromosom er å redusere denne genetiske ustabiliteten og variasjonen.
For å gjøre det, start med en alderssynkronisert befolkning av L4 transgene ormer, som bærer en ekstrakroosomal matrise som tidligere ble introdusert av mikroinjeksjon og lar dem vokse til gravide voksne. Overfør disse voksne til nye plater og la dem legge egg til det er minst 30 egg på hver tallerken. Fjern de voksne og la eggene vokse opp til de når L4-scenen. Deretter bestråler ormene med UV-lys. Dette forårsaker tilfeldige dobbeltstrengsbrudd i det genomiske DNA-et der ormene DNA-reparasjonsmaskiner kan vilkårlig innlemme matrisen.
Etter en gjenopprettingsperiode over natten teller du antall overlevende ormer. En liten prosentandel av døde ormer indikerer effektiv bestråling. Observer etterfølgende generasjoner for å isolere homozygote integrerte transgene linjer. I eksempelprotokollen vil vi integrere en høy overføringshastighet utenomromosomal matrise med en fluorescerende koinjeksjonsmarkør uttrykt i svelget.
- Evaluer overføringshastigheten til den transgene linjen som skal integreres. For hver transgene linje, velg 10 fluorescerende gravide voksne på 10 separate kulturplater under et fluorescerende stereoskop. Kultur dyrene i en orminkubator satt ved en temperatur som er tillatt for reproduksjon av den genetiske bakgrunnen.
Overvåk avkom hver dag for å vurdere hvilket utviklingsstadium co-injeksjonsmarkøren uttrykkes og best kan observeres. Bruk fluorescerende stereoskopi, evaluer overføringshastigheten til avkom ved å bestemme prosentandelen fluorescerende avkom. For transgene integrasjonen, velg den transgene linjen med høyest overføringshastighet.
Få en populasjon av transgene dyr synkronisert på L4 larvalstadiet for integrering. Velg 30 fluorescerende gravide voksne på fem kulturplater. Etter at ormene har lagt egg i tre til fire timer ved 15 grader Celsius, sjekk om det er minst 30 egg etter tallerken, og fjern deretter de voksne fra platene.
Kultur Dyrene i en orminkubator til avkommet når L4 larvalstadiet. Plasser hver plate som inneholder 15 til 20 fluorescerende transgene L4-dyr i en UV-krysskobling med lokkene fjernet.
For utvinning, inkubere de bestrålede ormene over natten ved 15 grader Celsius. Sjekk for antall dyr som er i live. I våre hender er en overlevelsesrate på rundt 80% til 90% adaptiv for en effektiv bestråling.
