Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Att skapa extrakromosomala DNA-matriser genom mikroinjektion - den enklaste metoden för att generera transgena maskstammar - resulterar i genetiska element som inte överförs stabilt under celldelning och därför uppvisar varierande arvsfrekvenser och uttrycksnivåer.
För att göra det, börja med en ålderssynkronerad population av L4 transgena maskar, som bär en extrakroosommatris som tidigare introducerades genom mikroinjektion och tillåter dem att växa till gravida vuxna. Överför dessa vuxna till nya tallrikar och låt dem lägga ägg tills det finns minst 30 ägg på varje tallrik. Ta bort de vuxna och låt äggen växa upp tills de når L4-stadiet. Bestråla sedan maskarna med UV-ljus.
Efter en återhämtningsperiod över natten, räkna antalet överlevande maskar. En liten andel döda maskar indikerar effektiv bestrålning. Observera efterföljande generationer för att isolera homozygous integrerade transgena linjer. I exempelprotokollet kommer vi att integrera en hög överföringshastighet extrakroosomal array som bär en fluorescerande co-injection markör uttryckt i svalget.
- Utvärdera överföringshastigheten för den transgena linje som ska integreras.
Övervaka avkomman varje dag för att utvärdera vilket utvecklingsstadium saminsprutningsmarkören uttrycks och kan bäst observeras. Med hjälp av fluorescerande stereoscopy, utvärdera avkommans överföringshastighet genom att bestämma procentandelen fluorescerande avkomma.
Få en population av transgena djur synkroniserade på L4 larvstadiet för integration. Välj 30 fluorescerande gravida vuxna på fem odlingstallrikar.
Odla djuren i en maskinkubator tills avkomman når larvstadiet L4. Placera varje platta som innehåller 15 till 20 fluorescerande transgena L4-djur i en UV-tvärlänk med locken borttagna.
För återhämtning, inkubera de bestrålade maskarna över natten vid 15 grader Celsius. Kontrollera antalet djur som lever. I våra händer är en överlevnadsgrad på cirka 80% till 90% adaptiv för en effektiv bestrålning.
