Irradiación UV: Un método para integrar matrices extracromosómicas

- La creación de matrices de ADN extracromosomal por microinyección - el método más simple para generar cepas de gusanos transgénicos - da como resultado elementos genéticos que no se transmiten de forma estable durante la división celular y, por lo tanto, exhiben tasas de herencia variables y niveles de expresión. El objetivo de integrar la matriz en un cromosoma es disminuir esta inestabilidad genética y variabilidad.

Para ello, comience con una población sincronizada por edades de gusanos transgénicos L4, que llevan un conjunto extracromosomal previamente introducido por la microinyección y les permiten crecer en adultos lívidos. Transfiera a estos adultos a nuevas placas y les permita poner huevos hasta que haya al menos 30 huevos en cada plato. Retire a los adultos y permita que los huevos crezcan hasta llegar a la etapa L4.

Después de un período de recuperación nocturno, cuente el número de gusanos sobrevivientes. Un pequeño porcentaje de gusanos muertos indica una irradiación eficiente. Observe las generaciones posteriores para aislar las líneas transgénicas integradas homocigóus.

- Evaluar la velocidad de transmisión de la línea transgénica a integrar. Para cada línea transgénica, elija 10 adultos gravid fluorescentes en 10 placas de cultivo separadas bajo un estereoscopio fluorescente.

Monitoree la progenie cada día para evaluar qué etapa de desarrollo se expresa el marcador de co-inyección y se puede observar mejor. Usando estereoscopia fluorescente, evaluar la velocidad de transmisión de la progenie determinando el porcentaje de progenie fluorescente. Para la integración del transgénero, seleccione la línea transgénica con la tasa de transmisión más alta.

Obtener una población de animales transgénicos sincronizados en la etapa larvaria L4 para su integración. Elija 30 adultos fluorescentes gravid en cinco placas de cultivo. Después de que los gusanos hayan puesto huevos durante tres a cuatro horas a 15 grados Centígrados, compruebe la presencia de al menos 30 huevos por plato, y luego, elimine a los adultos de las placas.

Cultiva a los animales en una incubadora de gusanos hasta que la progenie llegue a la etapa larvaria L4. Coloca cada placa que contenga de 15 a 20 animales L4 transgénicos fluorescentes en un reticulador UV con las tapas removidas.

Para la recuperación, incubar los gusanos irradiados durante la noche a 15 grados centígrados. Compruebe el número de animales vivos. En nuestras manos, una tasa de supervivencia de entre el 80% y el 90% es adaptativa para una irradiación eficiente.