Montage d’agar : une méthode de base pour monter des embryons vivants de poisson zèbre pour l’imagerie à long terme

- Commencez par ajouter de l’agarose moyenne à faible point de fusion E3 et le chauffage jusqu’à ce que l’agarose se dissolve complètement. Refroidir l’agarose à 37 degrés Celsius et ajouter la solution tricaine. Ensuite, anesthésier les embryons en ajoutant de la tricaine à une boîte de Pétri contenant des embryons dans le milieu E3. Tourbillonner la boîte de Pétri pour recueillir les embryons au milieu.

À l’aide d’une pipette de transfert, dresser un embryon avec une quantité minimale de milieu. Maintenez la pipette en position verticale et faites rebondir l’embryon pour le positionner à l’extrémité de la pipette. Placez maintenant l’embryon dans la solution agarose sans ajouter de milieu excédentaire, ce qui diluerait l’agarose et empêcherait le gelling. Mélangez doucement l’embryon à l’intérieur de l’agarose et transférez la solution dans le puits d’une plaque d’imagerie à l’aide de la pipette.

Placer la plaque au microscope et utiliser une pointe de pipette pour positionner l’embryon dans l’orientation désirée. Une fois que l’agarose se solidifie, versez un milieu E3 contenant de la tricaine sur le dessus pour garder l’agar hydraté et l’image de l’embryon. Dans un protocole d’exemple, nous monterons des embryons de poisson zèbre parabiotic pour l’imagerie et l’analyse.

Pour acquérir des images des embryons fusionnés, préparez un point de fusion faible de 0,8 %. aliquot un millilitre de l’agarose en tubes de microfuge de 1,5 millilitre réglés dans un bloc chauffant de 37 degrés Celsius. Anesthésier les embryons parabiotic en ajoutant 1 millilitre de 4 milligrammes par millilitre pH 7,0 tricaine aux 25 millilitres de milieu E3 contenant les embryons. Tourbillonnez doucement le plat de sorte que les embryons piscine au milieu.

Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert en plastique à bout large, dresser les embryons dans le moins de liquide possible. Ensuite, tournez la pipette droite et faites rebondir doucement les embryons afin qu’ils s’installent au fond de la pipette. Puis transférez les embryons à un aliquot de 1 millilitre de point de fusion faible agarose en touchant légèrement la pointe de pipette à la surface de l’agarose. Disposez tout excès de liquide de la pipette et utilisez la pipette pour mélanger doucement les embryons dans l’agarose.

Ensuite, avec la pipette, transférer l’agarose et les embryons au puits d’une plaque de six puits de fond en verre. Au microscope stéréo, utiliser une pointe de chargement de gel fixée à l’extrémité d’une aiguille à taquineries pour positionner les embryons près du verre de couverture et dans l’orientation désirée pour l’imagerie. Une fois que l’agarose s’est réglée et moyennement avec de la tricaine a été ajoutée aux puits, utilisez un microscope confocal à balayage laser à balayage laser ou filature inversé pour acquérir des images.

Pour tout un champ de vision embryonnaire, utilisez un 4x subjectif. Utilisez un objectif 20x pour visualiser un tissu spécifique. Traiter les images selon le protocole du texte.