Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Enjeksiyondan bir gece önce iki dişi ve iki erkek balığı bölünmüş bir üreme tankına yerleştirin. Ertesi sabah, bölücüyü çıkarın ve tankın dibinde yumurtaları gözlemleyene kadar balığın üremesine izin verin. Yumurtaları toplayın ve bir mantar ilacı olan metilen mavisi içeren E3 ortamı ile yıkayın. Yumurtaları mikroskop altında gözlemleyin ve döllenmemiş yumurtaları çıkarın. Döllenmemiş yumurtalar açık bir yumurta sarısı zarı, döllenmiş yumurtalar ise koyu sarısı bir zara sahiptir.
10 embriyosu ayrı bir Petri kabında gizli kontroller olarak saklayın. Bir transfer pipeti kullanarak, embriyoları oda sıcaklığında bir mikroenjeksiyon plakasının oluğuna hizalayın ve mikroskop altına yerleştirin. Mikroenjeksiyon iğnesini yavaşça koroyondan sarısına itin ve fenol kırmızısı gibi bir belirteç içeren bir ilgi bileşiği yavaşça enjekte edin. Sitoplazmik akış, bileşiğin embriyonik hücrelere yayılmasına izin verir.
Enjeksiyondan sonra, embriyoları 28 santigrat derecede metilen mavisi ile E3 ortamında büyütün. Embriyoların sağlığını kontrol etmeye devam edin. Ölü veya anormal gelişmekte olan embriyoları çıkarın ve ortamı günlük olarak değiştirin. Aşağıdaki protokolde, zebra balığı embriyolarına bir ribonucleoprotein veya RNP kompleksini teslim etmek için mikroenjeksiyon kullanacağız.
- İlk olarak, zebra balığı konularını metin protokolünde açıklandığı gibi enjeksiyonları yapmadan önceki gece üreme için hazırlayın. Daha sonra Cas9 proteini ve sgRNA'yı ikiye bir oranında birleştirin. Cas9 ve sgRNA bir ribonikleoprotein kompleksi oluştururken çözeltiyi beş dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkalayın. Ardından beş mikrolitrelik son bir hacim elde etmek için yeterli RNase içermeyen suya% 2,5 fenol kırmızı çözeltisinin 0,5 mikrolitresini ekleyin.
Enjeksiyon iğnesini hazırlamak için, bir milimetrelik cam kılcal damarı çekmek için bir mikropipette çekme kullanın. Sonra elde edilen cam iğnenin ucunu açılı bir açıklık elde etmek için jiletle kesin. İğneyi bir mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre yerleştirin. Hafif bir mikroskop kullanarak, iğne petri kabına sürekli olarak bir nanolitre çözelti enjekte edene kadar enjeksiyon basıncını ayarlayın.
- Embriyo mikroenjeksiyonu yapmadan önce, iğne hazırlama ve kontrol embriyolarını sadece boya çözeltisi kullanarak enjekte etme alıştırması yapın ve 24 saatlik gelişimden sonra sağkalımını kaydedin.
- Daha sonra, kontrol popülasyonu olarak 10 ila 15 embriyo seçin ve ayrı bir etiketli Petri kabına yerleştirin. Transfer pipeti kullanarak, kalan embriyoları oda sıcaklığı enjeksiyon plakasına dikkatlice hizalayın. Diseksiyon mikroskobu altında, çözeltinin bir nanoliterini her embriyonun yumurta sarısı kesesine enjekte edin. Daha sonra enjekte edilen embriyoları etiketli bir Petri kabına geri koyun ve metilen mavisi ile 1X E3 medya ile örtün. Enjekte edilen embriyoları 24 saat boyunca 28 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.
