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 JoVE Immunology and Infection

L'uso di diacetato Carboxyfluorescein succinimidile Ester (CFSE) per monitorare la proliferazione dei linfociti

1, 1

1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

Article
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    Summary

    CFSE etichette covalentemente molecole intracellulari di lunga durata con il colorante fluorescente, carboxyfluorescein. Come tale, quando una cellula si divide CFSE marcato, la sua progenie sono la metà della quantità di fluorescenza, che può così essere utilizzato per valutare la divisione cellulare. In questo articolo vengono descritte le procedure normalmente utilizzate per l'etichettatura dei linfociti mouse con CFSE.

    Date Published: 10/12/2010, Issue 44; doi: 10.3791/2259

    Cite this Article

    Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. J. Vis. Exp. (44), e2259, doi:10.3791/2259 (2010).

    Abstract

    Carboxyfluorescein succinimidile estere (CFSE) è un mezzo efficace e popolare per il monitoraggio dei linfociti divisione 1-3. CFSE etichette covalentemente molecole intracellulari di lunga durata con il colorante fluorescente, carboxyfluorescein. Così, quando una cellula si divide CFSE marcato, la sua progenie sono dotati di metà il numero di carboxyfluorescein-tagged molecole e quindi ogni divisione cellulare può essere valutata misurando la corrispondente diminuzione della fluorescenza cellulare tramite citometria a flusso. La capacità di CFSE di etichettare popolazioni di linfociti con fluorescenza ad alta intensità di variazione eccezionalmente basso, insieme alla sua bassa tossicità delle cellule, ne fanno un colorante ideale per misurare la divisione cellulare. Dal momento che si tratta di un colorante a base di fluorescina è anche compatibile con una vasta gamma di fluorocromi altri che lo rende applicabile a più colori citometria a flusso. In questo articolo vengono descritte le procedure normalmente utilizzate per l'etichettatura dei linfociti del mouse al fine di monitorare fino a 8 divisioni cellulari. Queste cellule marcate possono essere utilizzati sia in vitro e in vivo.

    Protocol

    1) installazione reagente

    1.1) CFSE soluzione madre

    Il colorante CFSE viene acquistato come carboxyfluorescein succinimidile estere diacetato (CFDA, SE) (MW 557,47 g / mole), tipicamente in 25 fiale mg. Sciogliere il 25 mg a 8,96 ml di DMSO per una soluzione madre finale di 5 mM (negozio di 50-100 microlitri aliquote a -20 ° C per diversi mesi). CFDA, SE reagirà con soluzione acquosa ed è quindi fondamentale che tale esposizione essere evitati durante la conservazione.

    1,2) Linfociti

    Isolare i linfociti da milza e nei linfonodi o da topi e risospendere in 1 ml di terreno di coltura (es. RPMI) con 5% di siero (HI) di siero fetale bovino (FCS), con una concentrazione di cellule tra 0,5 x 06-10 ottobre x 10 7 / mL.

    2) CFSE Etichettatura

    2.1) metodo di routine:

    1. Accuratamente risospendere le cellule nel volume 1 ml di medie e posto con cura sul fondo di una nuova (non bagnate) tubo da 10 ml.
    2. Posare il tubo orizzontale (con una non a contatto col tubo impedirà l'1 ml di cellule sospensione dal movimento e prematuramente miscelazione con l', CFDA SE soluzioni).
    3. Aggiungere con cautela 110 ml di PBS a non a contatto col porzione di plastica nella parte superiore del tubo di garantire non fa contatto con la soluzione della cella.
    4. Risospendere 1,1 l di stock 5 mm di CFDA, SE nei 110 microlitri di PBS.
    5. Rapidamente tappo e capovolgere il tubo e agitare bene per ottenere uniforme rapida miscelazione delle soluzioni. Si noti che il colorante CFSE è ad una concentrazione finale di 5 mM, tuttavia, la concentrazione ottimale può essere determinato per ciascun lotto preparato, e poi controllato ogni 6 mesi per assicurarsi che sia efficace.
    6. Incubare le cellule per 5 minuti a temperatura ambiente. Si noti che al momento della conversione del CFDA, SE CFSE (vedi la discussione) il colorante diventa fluorescente e quindi incline a sbiancamento da eccessiva esposizione alla luce. Quindi, è consigliabile proteggere il tubo dalla luce da questo punto in poi, ad esempio coprendolo con un foglio di alluminio.
    7. Lavare le cellule diluendo in 10 volumi di 20 ° C PBS contenente il 5% HI FCS, sedimenta per centrifugazione a 300 xg per 5 min a 20 ° C e scartare il surnatante. Ripetere il lavaggio altre due volte.

    2.2) metodo alternativo, che è anche adatto per numero di cellule superiore (10 - 30 x 10 7):

    1. Preparare un 2 x (10 mM) CFDA, soluzione SE aggiungendo 2 ml di stock 5 mm a 1 ml di PBS e aggiungere rapidamente questo a 1 ml di cellule completamente risospeso, poi rapidamente tappo e capovolgere il tubo e agitare bene per ottenere uniforme rapida miscelazione.
    2. Incubare le cellule per 5 minuti a temperatura ambiente e lavare come nei passi 2.1 (f) e 2.1 (g).

    2.3) Le celle possono poi essere applicato a un protocollo di interesse per l'induzione della divisione cellulare. Cellule marcate possono essere utilizzati in vitro e in vivo.

    2.4) Al termine del test di proliferazione, le cellule vengono raccolte e analizzate mediante citometria di flusso (vedi sotto per esempi rappresentativi).

    3) Rappresentante Risultati

    Per valutare la proliferazione dei linfociti per diluizione CFSE, è utile conoscere la fluorescenza delle cellule indivisa (ovvero un massimo di fluorescenza) e non etichettati cellule (minimo cioè fluorescenza). Pertanto, il disegno sperimentale dovrebbe prendere in considerazione questi controlli. Qui di seguito sono esempi di in vitro e in vivo, utilizzando CFSE per misurare la divisione delle cellule CD8 + T mediante citometria di flusso.

    3.1) In stimolazione in vitro

    La figura 1 mostra i profili di CFSE CFSE marcato ovalbumina (OVA)-specifici recettori delle cellule T CD8 + transgenici OT-I T cellule dopo coltura 3 giorni con cellule dendritiche pulsate con varie quantità di OVA. Cellule T CD8 + purificate dai nodi linfatici della milza e OT-I topi sono stati etichettati con CFSE e 1 x 10 5 cellule in coltura con 3,3 x 10 4 CC. DC dove pulsata con OVA per 1 ora a 37 ° C e lavati due volte prima di cultura. Dopo 3 giorni, in cui le cellule raccolte ed etichettato con anti-CD8-APC anticorpi e Hoechst 33258 e quindi analizzati mediante citometria di flusso (50.000 eventi raccolti). Live (Hoechst 33258 -) CD8 + sono mostrati. Come controlli, le cellule CD8 + T in coltura da solo, mostra l'intensità CFSE di non-diviso le cellule, mentre le cellule non etichettati mostra l'auto-fluorescenza delle cellule e dei limiti di divisioni cellulari rilevabili. Si noti che 4 picchi CFSE può essere visto in ognuno dei pannelli in questo esempio, indicando che le cellule hanno subito fino a 3 divisioni.

    3.2) In stimolazione vivo

    La Figura 2 mostra i profili di CFSE CFSE marcato OVA specifici recettori delle cellule T CD8 + transgenici OT-I cellule T dopo 3 giorni in vivo in la presenza di 20 mcg OVA. Cellule T CD8 + purificate dai nodi milza e dei linfonodi CD45.1 congenic OT-I topi sono stati etichettati con CFSE e 5 x 10 6 cellule iniettate iv nella vena della coda laterale C56BL/6J (CD45.2 +) topi. Dopo 2 ore i topi sono stati iniettati iv con 20 mg di OVA. Dopo 3 giorni, milza di topi sono stati raccolti, trasformati in una sospensione di cellule singole, etichettate con anti-B220-PerCP, anti-CD8-APC-Cy7 e anti-CD45.1-PE-Cy7 anticorpi e Hoechst 33258 e poi analizzati mediante citometria di flusso (1.000.000 eventi raccolti). Live (Hoechst 33258 -) B220-cellule vengono mostrati nel pannello a sinistra e gated CD8 + + CD45.1 cellule mostrato nel pannello di destra. Come controlli, non stimolate CFSE marcati cellule T CD8 +, mostra l'intensità CFSE di non-diviso le cellule, mentre i non-etichetta cellule mostra l'auto-fluorescenza delle cellule e dei limiti di divisioni cellulari rilevabili. Si noti che l'uso della differenza CD45 allotypic è di vitale importanza per risolvere la trasferiti cellule T CD8 + da host, in quanto sono un sottoinsieme minore del totale cellule T CD8 + (pannello di sinistra). Si noti che la maggior parte delle cellule cadono entro 7 picchi CFSE in questo esempio (pannello di destra), indicando che le cellule hanno subito fino a 6 divisioni.

    Figura 1
    Figura 1. Capacità di CFSE marcato ovalbumina (OVA)-specifica delle cellule T del recettore transgenico CD8 + OT-I linfociti T di rispondere in vitro di DC pulsate con diverse concentrazioni di OVA, i dati riportati sono dopo 3 cultura giorni. Nota non diviso popolazione di CD8 + T cellule in assenza di antigene (luce istogramma grigio) e auto-fluorescenza della popolazione non etichettati (istogramma grigio scuro). La figura mostra cellule T CD8 + che hanno diviso 1-3 volte sulla base di cime di diluizione CFSE, con più cellule T che divide alle concentrazioni dell'antigene superiori.

    Figura 2
    Figura 2. Capacità di CFSE marcato ovalbumina (OVA)-specifica delle cellule T del recettore transgenico CD8 + OT-I linfociti T, quando adoptively trasferite in topi C57BL / 6 per rispondere alle OVA, dati indicata 3 giorni dopo il trasferimento adottivo pannello sinistro. CD8 +, CD45. 1 le cellule + OT-1 T nei topi destinatario. Pannello di destra: la proliferazione profilo CFSE. Nota non diviso popolazione di cellule T CD8 + nei topi destinatario non riceve l'antigene (luce istogramma grigio) e auto-fluorescenza di non etichettati linfociti (istogramma grigio scuro). La figura mostra cellule CD8 + T che hanno diviso 1-6 volte sulla base di cime di diluizione CFSE.

    Figura 3
    Figura 3. Una rappresentazione dei vari eventi molecolari che si verificano durante l'etichettatura di cellule con diacetato carboxyfluorescein succinimidile estere (CFDA, SE). Per i dettagli del processo si veda il testo di discussione. Nota: 'CFSE' La sigla generica e non CFDA, SE, è usato per descrivere il reagente etichettatura e la procedura di etichettatura in generale. Figura basata su Parrocchia 4.

    Discussion

    Al fine di apprezzare come funziona e perché CFSE etichettatura uniforme, rapido è richiesto per il suo utilizzo in analisi proliferazione, è utile per capire le basi molecolari di etichettatura CFSE cellulare. Questo può essere suddiviso in due fasi, 1) di cella e 2) l'etichettatura delle proteine ​​(Figura 3). 1) iscrizione Cell: Entrata del colorante per la cellula è mediato dalla forma diacetilati del colorante, carboxyfluorescein succinimidile estere diacetato (CFDA, SE). Il acetati fare la tintura permeanti membrana altamente permettendo il suo flusso rapido attraverso la membrana plasmatica. Esterasi, presente all'interno della cellula, fendere l'acetati da CFDA, SE e quindi dar luogo alla forma CFSE del colorante che è molto meno permeanti membrana, concentrando così il colorante all'interno della cellula. 2) l'etichettatura delle proteine: Mentre entrambi CFDA, SE e CFSE sono amino-reattiva catene laterali succinimidile, solo il CFSE è fluorescente. L'alta concentrazione intracellulare di CFSE facilita l'etichettatura rapida e alto livello intracellulare di proteine. Etichettatura CFSE di cellule deve essere eseguita velocemente in modo da ottenere una popolazione omogenea di cellule etichettate, che è fondamentale per risolvere le cellule che hanno subito le divisioni diverse, come mostrato nei risultati di rappresentanza (Figura 1 e 2).

    Disclosures

    Nessun conflitto di interessi dichiarati.

    Acknowledgements

    Il lavoro riportato in questo articolo è stato supportato da una National Health and Medical Research Council (NHMRC) dell'Australia Grant Program (CRP) e di un progetto NHMRC Grant (CRP e BJCQ). Anche BJCQ è un NHMRC Peter Doherty Postdoctoral Fellow.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    CFDA,SE Molecular Probes, Life Technologies
    DMSO Cambridge Isotope Laboratories
    Lymphocytes eg mouse or human
    RPMI GIBCO, by Life Technologies
    FCS SAFC Global
    10-15ml conical tubes Falcon BD
    PBS GIBCO, by Life Technologies
    Aluminium foil Capral Aluminium
    Vortex Scientific Industries Inc.
    Centrifuge Eppendorf
    Flow cytometer BD Biosciences

    References

    1. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).
    2. Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. (2009).
    3. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).
    4. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).

    Comments

    13 Comments

    I've noticed that sometimes I don't get distinct peaks and I haven't figured out why that is the case. I've been thinking that perhaps viewing the cells under the microscope often after the cells have been stained could possibly alter the CFSE fluorescence. Do you have any tips to ensure distinct resolution of the proliferating cells? Thanks.
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 18, 2011, 11:01 AM

    One of the most important steps to get good resolution of fluorescence division peaks is to ensure you label cells as quickly as possible. Keep in mind that some cell populations give better resolution of fluorescence division peaks than others (eg B cells can give poorer resolution than T cells and homogeneous cell population have better resolution than heterogeneous populations). Viewing the cells briefly under a (light) microscope generally dŒs not drastically alter the resolution of fluorescence division peaks. If you need further help, please feel free to email me directly. Ben Quah
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 20, 2011, 6:10 PM

    CFSE stained cells were acquired at ohr and then ²4 hr and 36 hr.
    The mean at 0hr was arnd ²700 where as after ²4 hrs was aorund 1000.
    Y sucha drastic shift in the intensity of the CFSE population at the same voltages and the non labelled control.
    Plesae explain....
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 4, 2012, 7:19 AM

    It is normal for CFSE-labeled cells to have a loss in fluorescence intensity over the initial ²4hrs. This loss stabilizes after the first day, although there still is a reduction in fluorescence intensity over time. Several factors might be responsible for this eg, loss of dye molecules from cells that are not attached to long lived proteins, turnover of labeled proteins ...etc
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 5, 2012, 9:41 PM

    can CFSE be also used for analyzing the proliferation of any other cells like endothelial cells.
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 18, 2012, 3:49 PM

    Yes, other cells have been shown to be amenable to CFSE-based proliferation analysis (e.g. hemopietic stem cells (Nordon, R.E., et al. British journal of haematology 1997; 98(3): 5²8-39.), myeloid leukemic progenitors (Holyoake, T., et al. Blood 1999; 94(6): ²056-64.) and bacteria (Ueckert, J.E., et al. Letters in applied microbiology 1997; ²5(4): ²95-9.)). CFSE labelling is essentially dependent on membrane permeability, intracellular esterase activity and amine reactivity so any cell meeting these requirements should label.

    However, the more heterogenous the population of cells is (endothelial cells for eg are quite heterogenous relative to lymphocytes), the more variable the initial fluorescence intensity is (ie the %CV of undivided cells for CFSE will be large (SD of >30% of MFI for eg)). This will make it very difficult to get clearly resolved division peaks with each successive division. So in this case you would get a general decrease in CFSE intensity as cells divide not discrete peaks, which still maybe useful to you (?).

    Good luck!

    Ben
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 18, 2012, 7:55 PM

    Hi, I am a bioinformatician and I work on an algorithm to fit peaks over a CFSE/PKH²6 proliferation tracking experiments. Something similar to the ModFit software but openSource and Free. To complete the work I need some example files with CFSE and PKH²6 on lymphocytes. It is possible to get and use the experimental results from the Jove presentation (I need the FCS files).

    Best Regards.

    Davide Rambaldi (ieo.eu)
    Reply

    Posted by: Davide R.January 10, 2013, 11:15 AM

    i have a same problem whch already discussed here,i cant get the distinct peaks of cfse dye.how i got these peaks
    Reply

    Posted by: rabiya m.January 27, 2013, 4:15 AM

    Hi Rabiya,

    Sorry for the late reply, I have had issues logging on to this site.

    As mentioned above, one of the most important aspects to CFSE labeling for distinct peaks is to get rapid uniform labeling labeling of cells when CFDA, SE is first added to your cell suspension. The video here shows one way in which to achieve this (there are of course many others). If you are still getting problems with this, perhaps there are some other areas where something could be improved. Please read our Nature Protocols or Current Protocols in Immunology articles for more information on potential trouble shooting.

    I hope this helps,

    Ben
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 7, 2013, 1:39 AM

    Hello,
    I an not geting proper peek with uniform peak for my samples. either I get two population or sometimes very low intensity. I dont understant what is the reason for this non-uniformity. I read somewhere that freezing-thawing the CFDE,SE stock destabilize it and so I feel that since I am using same stock every time, there might be some problem with CFDE,SE stock.. can please suggest me if I am right.
    Reply

    Posted by: farha m.March 8, 2013, 11:41 AM

    Hi Farha,

    Sorry for the late reply, I have had issues logging on to this site.

    I have been using freeze thawed stocks for some time now and I have not had any major issues with changes in uniformity of labeling. However, I am very careful not to let condensation form inside the stock vial since CFDA, SE will react in aqueous solution (i.e., make sure the stock vial equilibrates to room temperature before opening the vial and make sure your stock vials are sealed tightly, ideally with a screw top lid with a rubber seal).

    I hope this help,

    Ben
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 7, 2013, 1:33 AM

    I want to know for how much time dŒs the staining could be detected and if this staining could diffused to other tissues.

    Reply

    Posted by: Lucia B.June 2, 2013, 1:26 PM

    Hi Lucia,

    CFSE labeled lymphocyte do decrease fluorescence over time, particularly after the first few days post labeling. After this period, however, the labeling is quite stable and loss may reflect the natural turn-over of proteins (and associated loss of the CFSE label). As a result, CFSE fluorescence can be detected weeks and even months after initial labeling, depending on how high your initial labeling concentration is.

    CFSE, typically, will not diffuse to significant levels to other tissues or cells (there is more on this in our recent paper published in the Journal of Immunological Methods Volume 379, Issues 1- ², Pages 1-14.)

    I hope this help,

    All the best,

    Ben
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 7, 2013, 1:20 AM

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