L'uso di diacetato Carboxyfluorescein succinimidile Ester (CFSE) per monitorare la proliferazione dei linfociti

Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. J. Vis. Exp. (44), e2259, doi:10.3791/2259 (2010).

Carboxyfluorescein succinimidile estere (CFSE) è un mezzo efficace e popolare per il monitoraggio dei linfociti divisione ^1-3. CFSE etichette covalentemente molecole intracellulari di lunga durata con il colorante fluorescente, carboxyfluorescein. Così, quando una cellula si divide CFSE marcato, la sua progenie sono dotati di metà il numero di carboxyfluorescein-tagged molecole e quindi ogni divisione cellulare può essere valutata misurando la corrispondente diminuzione della fluorescenza cellulare tramite citometria a flusso. La capacità di CFSE di etichettare popolazioni di linfociti con fluorescenza ad alta intensità di variazione eccezionalmente basso, insieme alla sua bassa tossicità delle cellule, ne fanno un colorante ideale per misurare la divisione cellulare. Dal momento che si tratta di un colorante a base di fluorescina è anche compatibile con una vasta gamma di fluorocromi altri che lo rende applicabile a più colori citometria a flusso. In questo articolo vengono descritte le procedure normalmente utilizzate per l'etichettatura dei linfociti del mouse al fine di monitorare fino a 8 divisioni cellulari. Queste cellule marcate possono essere utilizzati sia in vitro e in vivo.

1) installazione reagente

1.1) CFSE soluzione madre

Il colorante CFSE viene acquistato come carboxyfluorescein succinimidile estere diacetato (CFDA, SE) (MW 557,47 g / mole), tipicamente in 25 fiale mg. Sciogliere il 25 mg a 8,96 ml di DMSO per una soluzione madre finale di 5 mM (negozio di 50-100 microlitri aliquote a -20 ° C per diversi mesi). CFDA, SE reagirà con soluzione acquosa ed è quindi fondamentale che tale esposizione essere evitati durante la conservazione.

1,2) Linfociti

Isolare i linfociti da milza e nei linfonodi o da topi e risospendere in 1 ml di terreno di coltura (es. RPMI) con 5% di siero (HI) di siero fetale bovino (FCS), con una concentrazione di cellule tra 0,5 x ^06-10 ottobre x 10 ⁷ / mL.

2) CFSE Etichettatura

2.1) metodo di routine:

1. Accuratamente risospendere le cellule nel volume 1 ml di medie e posto con cura sul fondo di una nuova (non bagnate) tubo da 10 ml.
2. Posare il tubo orizzontale (con una non a contatto col tubo impedirà l'1 ml di cellule sospensione dal movimento e prematuramente miscelazione con l', CFDA SE soluzioni).
3. Aggiungere con cautela 110 ml di PBS a non a contatto col porzione di plastica nella parte superiore del tubo di garantire non fa contatto con la soluzione della cella.
4. Risospendere 1,1 l di stock 5 mm di CFDA, SE nei 110 microlitri di PBS.
5. Rapidamente tappo e capovolgere il tubo e agitare bene per ottenere uniforme rapida miscelazione delle soluzioni. Si noti che il colorante CFSE è ad una concentrazione finale di 5 mM, tuttavia, la concentrazione ottimale può essere determinato per ciascun lotto preparato, e poi controllato ogni 6 mesi per assicurarsi che sia efficace.
6. Incubare le cellule per 5 minuti a temperatura ambiente. Si noti che al momento della conversione del CFDA, SE CFSE (vedi la discussione) il colorante diventa fluorescente e quindi incline a sbiancamento da eccessiva esposizione alla luce. Quindi, è consigliabile proteggere il tubo dalla luce da questo punto in poi, ad esempio coprendolo con un foglio di alluminio.
7. Lavare le cellule diluendo in 10 volumi di 20 ° C PBS contenente il 5% HI FCS, sedimenta per centrifugazione a 300 xg per 5 min a 20 ° C e scartare il surnatante. Ripetere il lavaggio altre due volte.

2.2) metodo alternativo, che è anche adatto per numero di cellule superiore (10 - 30 x 10 ^7):

1. Preparare un 2 x (10 mM) CFDA, soluzione SE aggiungendo 2 ml di stock 5 mm a 1 ml di PBS e aggiungere rapidamente questo a 1 ml di cellule completamente risospeso, poi rapidamente tappo e capovolgere il tubo e agitare bene per ottenere uniforme rapida miscelazione.
2. Incubare le cellule per 5 minuti a temperatura ambiente e lavare come nei passi 2.1 (f) e 2.1 (g).

2.3) Le celle possono poi essere applicato a un protocollo di interesse per l'induzione della divisione cellulare. Cellule marcate possono essere utilizzati in vitro e in vivo.

2.4) Al termine del test di proliferazione, le cellule vengono raccolte e analizzate mediante citometria di flusso (vedi sotto per esempi rappresentativi).

3) Rappresentante Risultati

Per valutare la proliferazione dei linfociti per diluizione CFSE, è utile conoscere la fluorescenza delle cellule indivisa (ovvero un massimo di fluorescenza) e non etichettati cellule (minimo cioè fluorescenza). Pertanto, il disegno sperimentale dovrebbe prendere in considerazione questi controlli. Qui di seguito sono esempi di in vitro e in vivo, utilizzando CFSE per misurare la divisione delle cellule CD8 + T mediante citometria di flusso.

3.1) In stimolazione in vitro

La figura 1 mostra i profili di CFSE CFSE marcato ovalbumina (OVA)-specifici recettori delle cellule T CD8 + transgenici OT-I T cellule dopo coltura 3 giorni con cellule dendritiche pulsate con varie quantità di OVA. Cellule T CD8 + purificate dai nodi linfatici della milza e OT-I topi sono stati etichettati con CFSE e 1 x 10 ⁵ cellule in coltura con 3,3 x 10 ⁴ CC. DC dove pulsata con OVA per 1 ora a 37 ° C e lavati due volte prima di cultura. Dopo 3 giorni, in cui le cellule raccolte ed etichettato con anti-CD8-APC anticorpi e Hoechst 33258 e quindi analizzati mediante citometria di flusso (50.000 eventi raccolti). Live (Hoechst 33258 -) CD8 + sono mostrati. Come controlli, le cellule CD8 + T in coltura da solo, mostra l'intensità CFSE di non-diviso le cellule, mentre le cellule non etichettati mostra l'auto-fluorescenza delle cellule e dei limiti di divisioni cellulari rilevabili. Si noti che 4 picchi CFSE può essere visto in ognuno dei pannelli in questo esempio, indicando che le cellule hanno subito fino a 3 divisioni.

3.2) In stimolazione vivo

La Figura 2 mostra i profili di CFSE CFSE marcato OVA specifici recettori delle cellule T CD8 + transgenici OT-I cellule T dopo 3 giorni in vivo in la presenza di 20 mcg OVA. Cellule T CD8 + purificate dai nodi milza e dei linfonodi CD45.1 congenic OT-I topi sono stati etichettati con CFSE e 5 x 10 ⁶ cellule iniettate iv nella vena della coda laterale C56BL/6J (CD45.2 +) topi. Dopo 2 ore i topi sono stati iniettati iv con 20 mg di OVA. Dopo 3 giorni, milza di topi sono stati raccolti, trasformati in una sospensione di cellule singole, etichettate con anti-B220-PerCP, anti-CD8-APC-Cy7 e anti-CD45.1-PE-Cy7 anticorpi e Hoechst 33258 e poi analizzati mediante citometria di flusso (1.000.000 eventi raccolti). Live (Hoechst 33258 -) B220-cellule vengono mostrati nel pannello a sinistra e gated CD8 + + CD45.1 cellule mostrato nel pannello di destra. Come controlli, non stimolate CFSE marcati cellule T CD8 +, mostra l'intensità CFSE di non-diviso le cellule, mentre i non-etichetta cellule mostra l'auto-fluorescenza delle cellule e dei limiti di divisioni cellulari rilevabili. Si noti che l'uso della differenza CD45 allotypic è di vitale importanza per risolvere la trasferiti cellule T CD8 + da host, in quanto sono un sottoinsieme minore del totale cellule T CD8 + (pannello di sinistra). Si noti che la maggior parte delle cellule cadono entro 7 picchi CFSE in questo esempio (pannello di destra), indicando che le cellule hanno subito fino a 6 divisioni.

Figura 1. Capacità di CFSE marcato ovalbumina (OVA)-specifica delle cellule T del recettore transgenico CD8 + OT-I linfociti T di rispondere in vitro di DC pulsate con diverse concentrazioni di OVA, i dati riportati sono dopo 3 cultura giorni. Nota non diviso popolazione di CD8 + T cellule in assenza di antigene (luce istogramma grigio) e auto-fluorescenza della popolazione non etichettati (istogramma grigio scuro). La figura mostra cellule T CD8 + che hanno diviso 1-3 volte sulla base di cime di diluizione CFSE, con più cellule T che divide alle concentrazioni dell'antigene superiori.

Figura 2. Capacità di CFSE marcato ovalbumina (OVA)-specifica delle cellule T del recettore transgenico CD8 + OT-I linfociti T, quando adoptively trasferite in topi C57BL / 6 per rispondere alle OVA, dati indicata 3 giorni dopo il trasferimento adottivo pannello sinistro. CD8 +, CD45. 1 le cellule + OT-1 T nei topi destinatario. Pannello di destra: la proliferazione profilo CFSE. Nota non diviso popolazione di cellule T CD8 + nei topi destinatario non riceve l'antigene (luce istogramma grigio) e auto-fluorescenza di non etichettati linfociti (istogramma grigio scuro). La figura mostra cellule CD8 + T che hanno diviso 1-6 volte sulla base di cime di diluizione CFSE.

Figura 3. Una rappresentazione dei vari eventi molecolari che si verificano durante l'etichettatura di cellule con diacetato carboxyfluorescein succinimidile estere (CFDA, SE). Per i dettagli del processo si veda il testo di discussione. Nota: 'CFSE' La sigla generica e non CFDA, SE, è usato per descrivere il reagente etichettatura e la procedura di etichettatura in generale. Figura basata su Parrocchia ^4.

Al fine di apprezzare come funziona e perché CFSE etichettatura uniforme, rapido è richiesto per il suo utilizzo in analisi proliferazione, è utile per capire le basi molecolari di etichettatura CFSE cellulare. Questo può essere suddiviso in due fasi, 1) di cella e 2) l'etichettatura delle proteine ​​(Figura 3). 1) iscrizione Cell: Entrata del colorante per la cellula è mediato dalla forma diacetilati del colorante, carboxyfluorescein succinimidile estere diacetato (CFDA, SE). Il acetati fare la tintura permeanti membrana altamente permettendo il suo flusso rapido attraverso la membrana plasmatica. Esterasi, presente all'interno della cellula, fendere l'acetati da CFDA, SE e quindi dar luogo alla forma CFSE del colorante che è molto meno permeanti membrana, concentrando così il colorante all'interno della cellula. 2) l'etichettatura delle proteine: Mentre entrambi CFDA, SE e CFSE sono amino-reattiva catene laterali succinimidile, solo il CFSE è fluorescente. L'alta concentrazione intracellulare di CFSE facilita l'etichettatura rapida e alto livello intracellulare di proteine. Etichettatura CFSE di cellule deve essere eseguita velocemente in modo da ottenere una popolazione omogenea di cellule etichettate, che è fondamentale per risolvere le cellule che hanno subito le divisioni diverse, come mostrato nei risultati di rappresentanza (Figura 1 e 2).

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il lavoro riportato in questo articolo è stato supportato da una National Health and Medical Research Council (NHMRC) dell'Australia Grant Program (CRP) e di un progetto NHMRC Grant (CRP e BJCQ). Anche BJCQ è un NHMRC Peter Doherty Postdoctoral Fellow.

1. Lyons, A. B. & Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods 171, 131-137 (1994).
2. Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., & Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology / edited by John E. Coligan ... [et al. Chapter 4, Unit 4 9 (2009).
3. Quah, B. J., Warren, H. S., & Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols 2, 2049-2056 (2007).
4. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol 77, 499-508 (1999).

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