JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Russian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

Расширение масштабов культуры клеток млекопитающих использованием новых многослойных Колба

1, 1, 1, 1, 1, 1

1BD Biosciences

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Клетки играют важную и все возрастающую роль в научных исследованиях, и открытие и разработку новых методов лечения. При этом растущая потребность в большем количестве клеток нам необходимо более эффективное и эффективные способы для выращивания и сбора урожая привязанности зависимые ячейки. Многослойные колбу с правом особенности могут служить этой цели.

    Date Published: 12/05/2011, Issue 58; doi: 10.3791/3418

    Cite this Article

    Abraham, E. J., Slater, K. A., Sanyal, S., Linehan, K., Flaherty, P. M., Qian, S. Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask. J. Vis. Exp. (58), e3418, doi:10.3791/3418 (2011).

    Abstract

    Все большее число клеточных приложения требуют большого количества клеток. Использование одного слоя T-колб, которые являются адекватными во время мелкие расширения, может стать громоздким, трудоемким и длительным, когда большое количество клеток не требуется. Чтобы удовлетворить эту потребность, производительность новой многослойной судна культуры клеток для облегчения расширения клеток из одного слоистого T-колб будет обсуждаться. Колбы испытания доступны в 3 - и 5-слойная формат и включить культуру и полное восстановление три и пять раз превышает число клеток, соответственно, по сравнению с Т-175 флаконов. Ключевой особенностью BD Multi-колбе смесь / уравновешивания порт, который позволяет быстро, в-сосуд смешивания, а также равномерное распределение клеток и реагентов внутри и между слоями каждое судно и постоянно производить клетки, которые можно культивировать в среде, которая сравнимо с Т-175 флаконов.

    Дизайн этих Multi-Колбы также позволяет сonvenient доступ пипетки для добавления реагентов и клеток непосредственно в колбах, а также эффективное восстановление ценных клеток и реагентов и уменьшает риск загрязнения в результате заливки. Для приложений, где проливной предпочтительнее, чем пипетки, конструкция позволяет минимальной остаточной удержанию жидкости в целях снижения потерь ценных клеток и реагентов.

    Protocol

    1. Протокол использовать Multi-Колбы для клеточных культур

    1. Подготовка судов и добавлением суспензии клеток
      1. Подготовка средний рост клеток по мере необходимости.
      2. Выстроить Multi-Колба вертикально на боку с крышкой вверх на рабочую поверхность (стерильные ламинарном боксе).
        1. Эти колбы доступны в 3 и 5-слойная форматов и использования подобной работы-картины течения, как T-175 колбу.
      3. Ослабить и снять шапки. Добавить необходимое количество подогретого среды в колбе с использованием 50 или 100 мл пипетки или путем заливки.
        1. Пипетки, которые ≤ 10 мл может достигать дна сосуда, когда на нескольких Колбы помещают вертикально с крышкой вверх. Пипетки ≥ 10 мл может достигать в сосуд сразу прошлом логотип на Multi-колбу, тем самым обеспечивая удобный портал для добавления большего объема средств массовой информации для судна.
      4. Чтобы избежать пузырьков среды, позволяют поток жидкости на этвл вдоль внутренней стенки Multi-колбу крышкой (логотип стороне).
      5. Добавить клеточной суспензии из концентрированного фондовом клетки в питательной среде через верхний слой с помощью 10 мл пипетки и крышка фляги.

        Советы:

        - Транспорт на нескольких контейнерах на корзину на сайте инкубатора и выполнить оставшиеся шаги.
        - Плотность клеток посева будет варьироваться в зависимости от типа клеток, средних и необходимости культуры продолжительности. Начните с плотностью посева и средств массовой информации объем, который используется в стандартной Т-175 колб и умножить на 3 или 5 в зависимости от Multi-Колба формат.

    2. Смешивание клеток
      1. Смешайте позицию: Держите Multi-Колба вертикально с логотипом к себе и повернуть против часовой стрелки, чтобы под углом 45 ° с микс порт к себе.
      2. Холдинг под тем же углом, слегка наклонять Multi-Колба спереди назад (шея от себя), пока жидкость в верхнем слое стоков полностью downwarDS через смесь порт. Pivot на смесь левого борта.
      3. Точно так же осторожно встряхнуть Multi-колбу от задней стенки к передней (шеи по направлению к вам), пока средний стоков полностью от нижнего слоя к вершине через смесь порт. Повторите шаги 1.2.2 и 1.2.3 еще раз, чтобы обеспечить надлежащее смешивание.
      4. Принесите Multi-колбу обратно смешать позицию (шаг 1.2.1) и перейдите к шагу 1,3
      5. Кроме того, клеточная суспензия может быть подготовлен внешне от Multi-колбы и клеточной суспензии могут быть добавлены в сосуд с помощью пипетки или нежный заливки.
        1. Смешайте порт позволяет в сосуд смешивания клеток со средствами массовой информации и избавляет от необходимости делать большие объемы клеточные суспензии, внешне.
        2. Она также позволяет СМИ выравнивания поперек слоев Multi-Колба
    3. Уравновешивание жидкости
      1. После смешивания / добавление суспензии клеток, место Multi-Колба вертикально на ровную рабочую поверхность для выравнивания объема жидкости уравнениеlly во всех слоях.
    4. Раздела жидкость в каждом слое
      1. Держите Multi-Фляга с логотипом к себе и повернуть по часовой стрелке на 45 градусов для разделения жидкости в каждом из слоев.

        Совет:

        - Для достижения наилучших результатов, важно использовать ровную рабочую поверхность для Шаги 1.3-1.4

    5. Транспорт
      1. После среды, содержащие суспензии клеток разбито, транспорт Multi-колбу, в то же углом 45 ° (по часовой стрелке), как в шаге 1.4.1 со средствами массовой информации от сочетания порта в инкубаторе. Эта позиция подходит также при извлечении колбы из инкубатора для просмотра на микроскоп.
    6. Размещение нескольких колбу на полке инкубатора
      1. Холдинг Multi-колбу на 45 ° (по часовой стрелке, вдали от микс-порт), осторожно поверните его горизонтально на поверхность инкубатора (с использованием углу от смеси портвращения). Положите Multi-колба с логотипом вверх.
        1. Сокол Multi-Колба конструкция позволяет судам для штабелирования и удерживает их на месте с помощью надежное штабелирование ребра.
    7. Распределение клеток и реагенты
      1. После размещения Multi-Колба квартира на рабочую поверхность, аккуратно рок вперед-назад и из стороны в сторону, чтобы распространять клетки равномерно на поверхности культуры, стараясь не пролить жидкость из каждого слоя. Стек колб.
        1. Это колба выполнена из оптически прозрачного материала и клеток на последний слой можно легко просматривать на микроскоп.
    8. Медиа-обмен
      1. Аспирацию в то время как наклон Multi-Колба влево (смесь левого борта) с логотипом к себе.
      2. Затем наклон, Multi-Колба вправо, продолжая аспирации всех остаточных средств массовой информации.
      3. Добавить соответствующее количество средств массовой информации и выполните шаги 1.3-1.7

    2.Сбор клетки Multi-Колбы

    1. Чтобы отделить клетки, выстраиваются на нескольких колб вертикально и принести каждому из них Mix позицию (шаг 1.2.1). Аккуратно инвертировать колбы с шеи к себе с тем чтобы средства массовой информации отводится в верхний слой Multi-Flask.
    2. Вставьте 5 или 10 мл аспирационных наконечник через шею, пока не достигнете уровня жидкости вблизи смесь порт. Аспирируйте исчерпаны среды.
    3. Добавить диссоциации реагента / промывочного буфера и довести до Mix позиции, как в шаге 1.2.1, а затем приступить и выполните шаги 1.3-1.7. Нейтрализовать со средним ростом / нейтрализующим агентом и залить клеточной суспензии в приемной трубки или инвертировать колбу так, что клетки стекать Верхний слой судна и собрать клетки с помощью 10 мл пипетки.

      Совет: Для улучшения восстановления клеток или реагенты, довести Multi-Колба смешивать позицию (шаг 1.2.1), инвертировать с шеи по отношению к оператору, чтобы полный дренаж СМИ от др. л слоев для верхнего слоя. Затем наклоните Multi-колбу по часовой стрелке на 45 градусов (от сочетания порта), а Multi-Колба остается перевернутой. Используйте пипетку (1-10 мл), чтобы собрать все оставшиеся реактивы.

    3. Рекомендуемый рабочий объем в Соколе Multi-Колбы

    Рост средств массовой информации

    3-слой: 75-150 мл на Multi-Колба
    5-слой: 125-250 мл на Multi-Колба

    Диссоциация агент

    3-слой: ≥ 15 мл на Multi-Колба
    5-слоя: ≥ 25 мл на Multi-Колба

    Совет: Начните со средним объемом используется в стандартных Т-175 колб и умножить на 3 или 5 раз в зависимости от Multi-Колба формате оценивается таким образом, чтобы мл на единицу площади поверхности остается той же.

    4. Представитель Результаты:

    1. Дизайн Сокол Multi-Колба

    files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/>
    . Рисунок 1: Multi-Колба судов культуре клеток доступны в 3 - и 5-слойная стекируемых формат для расширения масштабов предоставления клетки 525 и 875 см 2 площади поверхности роста, соответственно. Внесите доступа облегчает добавление и удаление клеток и реагентов в-и из сосуда. Наличие микс-порт позволяет быстро в сосуд смешивания и выравнивания СМИ во всех слоях Multi-Flask.

    2. Сотовые Доходность использованием Multi-Колба:

    Эти суда доступны в 3-слойный и 5-слойная форматов, которые соответствуют 3 и 5 раз площадь поверхности Т-175 флаконов. Соответственно, ≥ 3 и 5 раз (130 ± 6,8 х 10 6 и 218 ± 23,6 х 10 6 клеток, соответственно) число ВНК-21 (ребенок почек хомяка) клетки были выращены и оправился от Multi-Колба по сравнению с Т-175 колбы (43,2 ± 3,5 х 10 6 клеток; рис.2а). Сотовые урожайность унит площадь была эквивалентна в 3 - и 5-слойная Multi-Колбы и Т-175 контейнеров для ВНК-21, LNCaP (аденокарциномы предстательной железы человека линии клеток), Нер-G2 (линии клеток человека гепатокарциномы), ECOPACK 2-293 (человека линии клеток почек) культивировали в течение периода 48-96ч (рис.2б) в питательной среде (35 мл на слой) в соответствии с рекомендациями по мобильному поставщика (АТСС, Sigma и / или Clontech). Клетки были перечислены на автоматизированных Vi-CELL счетчик (1).

    Рисунок 2А
    Рисунок 2А: три и в пять раз число ВНК-21 клетки были выращены и оправился от 3 ​​- и 5-слойная Multi-Колбы по сравнению с Т-175 флаконов. Ожидаемая доходность определялась с помощью Средняя урожайность ячейки из-под контроля Т-175 колб, умноженному на три и в пять раз по 3 - и 5-слойная Multi-Колбы соответственно (п = 4 колб / формат).

    Рисунок 2B/> Рисунок 2B: Сотовый выход на см 2 была эквивалентна в 3 - и 5-слойная Multi-Колбы и Т-175 контейнеров для ВНК-21, LNCaP, HepG2 и EcoPack2-293 клеток. Каждая полоса представляет среднем от 4 до 6 колб. ВНК-21 клеток (11000 cells/cm2) культивировали в течение 72 часов, LNCaP клеток (20000 cells/cm2) и EcoPack2-293 клеток (~ 35000 cells/cm2) культивировали в течение 96 часов и HepG2 клетках (25 000 клеток / см 2 ) культивировали в течение 48 часов до сбора урожая.

    3. Медиа распределения между слоями Multi-Колба

    Сотовые культуральной среде (DMEM; Invitrogen) был добавлен в 5-слойной Multi-колбы (250 mL/5-layer судна) и разбивается на слои в соответствии с протоколом, описанных выше. Медиа распределение измерялось сверления отверстий в каждом слое и СМИ откачивается из отдельных слоев. Вес жидкости оправился от каждого слоя оказалось относительно равномерным от слоя к слою, как показано на рис 3. Они заключаются в следующем: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (г).

    Рисунок 3
    Рисунок 3. Равномерное распределение средств массовой информации в каждой из пяти слоев 5-слойной Multi-Flask. Среду клеточной культуры был добавлен в Multi-колбы (250 ml/5-layer судна), уравновешенной и разделена на отдельные слои. СМИ откачивается через отверстия, просверленные в отдельных пластов и переход жидкости вес был зафиксирован из каждого слоя (п = 6 колб).

    4. Сотовые распределения между слоями Multi-Колба

    Клетки могут быть добавлены и смешанной в пределах нескольких Flask. Мы моделировали распределение клеток между слоями Multi-Колба использованием бисера (10 мкм; PolySciences Inc) близки по размерам к клеткам. Бусы суспензии добавляют в Multi-Колба судна с помощью 10 мл пипетки через верхний слой и смешанные со средствами массовой информации в сосуде, как по убываниюribed в протоколе выше. Бусы распределение измерялось сверления отверстий в каждом слое и жидкости, содержащей бусинку суспензия откачивается из отдельных слоев. Бусы концентрации оправился от каждого слоя было зачитано от счетчика Coulter и зарегистрированы. Ниже приведены эквивалентные межуровневых бусинка распределений в 3-х слойные Multi-колбы (рис.4а). Микс-порт дает возможность равномерного распределения клеток и реагентов между Multi-Колба слоев.

    На рисунке 4а
    Рисунок 4а: Bead распределения в каждой из трех слоев 3-слойный Multi-Flask. Подвески из бисера (3,6 х10 6 / мл) добавляют к среде разливали в Multi-колбы (шарик подвеска: медиа объем составляет 1:10, т.: т.) и смешанные, а затем равновесия и разделов действия, используя протокол, описанный. Бусы концентрации оправился от каждого слоя (перекачиваемой жидкости через отверстия, просверленные на каждом слое) было зачитано от Coulter графаэр и зарегистрированы. Ниже приведены эквивалентные межуровневых бусинка распределений в 3 - слой Multi-колбы (п = 5 колб)

    Ниже приведены представитель образы Ecopack 2-293 окрашивания моделей клеток, выращенных на> 80% от слияния 3-х слойные Multi-Колбы в средствах массовой информации дополнены роста. Сотовые монослои фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым и мульти-Колба слои затем вырезать и отсканированные изображения (2). Обратите внимание, сотовые структурирование была однородной по всем слоям Multi-Колба (Fig.4B). Аналогичные результаты были получены с несколькими типами клеток оценивали (данные не представлены).

    Рис 4B
    Рис 4B: Этот рисунок иллюстрирует однородные роста клеток между слоями Multi-колбы. Ecopack-2-293 клеток, выращенных на> 80% слияния в 3-х слойные Multi-Колбы и Т-175 были зафиксированы и окрашивали фиолетовый кристалл. Multi-Колба суда были вырезаны, и каждый окрашенный слой был отсканирован.

    5 Подача воздуха в Multi-Flask.:

    Анализ провел носитель с помощью BioProfile FLEX анализатор (3,4) (Nova биомедицинских) от EcoPack2-293 клетки культивировали в течение 96 часов не выявили различий в воздухе насыщение клеток, выращенных в 5-слойной Multi-Колбы по сравнению с Т-175 колб (81,03 ± 1,9 против 83,4 ± 5,8% окружающего O 2).

    Рисунок 5
    Рисунок 5: Air насыщения (% окружающего O 2) отработанного СМИ были одинаковыми в предварительно смешанных средств массовой информации из 5-слойной Multi-Колбы по сравнению с Т-175 флаконов. EcoPack2-293 клетки высевали при плотности 35000 клеток / см 2 и культивировали в течение 96 часов до анализа СМИ (п = 3 фляги).

    Discussion

    Данное исследование демонстрирует увеличение производительности, что Multi-Колба дизайн предлагает исследователям. Хотя важно следовать шаги, описанные выше, для достижения оптимальной производительности при использовании Multi-Колбы, Есть несколько важных шагов в этом протоколе, которые считаются наиболее существенными. К ним относятся (я) смешивание клеток и реагенты использованием смеси порт в сосуд (II) транспортировки Multi-колбу на 45 ° по часовой стрелке после перегородки жидкости в каждом из слоев (III), укладка Multi-Колба плоские разбиения на сообщение инкубатора.

    Правильное использование Multi-колба приводит к производству однородной популяции клеток внутри каждого судна, которое культивировали в среде, которая сравнима с Т-175 колб (5). Эти суда предоставить 3 и 5 раз больше клеток в аналогичный след, как T-175 колбу. 3 и 5-слойная судна обеспечивает 525 и 875cm 2 роста области, соответственно, и предлагают как пространство и труда сavings для пользователей. Тканевой культуры Обработка поверхности сравнима с колбами стандартного что позволяет масштабов без необходимости повторной оптимизации существующих условиях культуры или ущерба для качества, однородности или производительность клеток (6, 7). Это также обеспечивает сопоставимость с ранее собранными данными. Эти суда могут быть также покрыта реагентов, таких как коллаген, фибронектин, поли-D-лизина предоставить специализированные субстратом для прикрепления, роста и дифференциации определенных типов клеток, таких как гепатоциты 8, 9 kertainocytes, стволовые клетки, выращенные в бессывороточной СМИ формулировках. Покрытие решения могут быть удалены с минимальной остаточной удержанию жидкости в целях снижения потерь ценных реагентов, а также эффективное удаление раствор для покрытия до культивирования клеток. Рекомендуется оптимальный объем средств массовой информации к культуре клеток в нескольких колб от 0.142-0.287 мл / см 2, которые переводят на 25-50 мл на один слой. В отличие от другого многослойные колбу, тсвой продукт предлагает микс-порт судно, которое позволяет быстро, в-сосуд смешивания, а также равномерное распределение клеток и реагентов внутри и между слоями каждого судна. Разнообразные клеточные линии, первичных культур и стволовые клетки были расширены эффективного использования Multi-колбы. Эти сосуды особенно выгодно в приложениях, требующих большого количества клеток, например, в высокой пропускной способности отбор, производство вакцин, вирусной трансфекции вектора и клеточной терапии.

    Экономия времени, пространства, труда и снижение отходов являются ключевыми выигрыш Multi-Колба по сравнению с обычными культурами в однослойных сосудах. Мы можем культуры примерно в три раза превышает число клеток, полученных из 5, Т-175 колб в том же пространстве, используя 3, 5-слоя Multi-колбы. Это преимущество в экономии пространства, не ограничивается только на Т-175, но может быть распространено и на другие суда: стандартный аппарат бутылки ролик, который вписывается в общие лабораторные инкубаторы домов ~ 4 ROLлер бутылки (2200 мл), каждый из которых обеспечивает 850cm 2 площади поверхности. В этом же районе, ~ 20, 5-слойной Multi-Колбы могут быть размещены таким образом обеспечивая пятикратный рост поверхности к культуре клеток. Кроме того, с увеличением "Go-зеленой" общественности, что позволит уменьшить образование отходов является весьма желательным. В этом отношении, есть 38% (5, Т-175 колб весом ~ 640G в то время как один, 5-слойной Multi-Колба весит ~ 400 г) уменьшение образования отходов использованием Multi-Колбы по сравнению с Т-175 колб и эти преимущества ведут к снижению хранения и захоронения отходов затрат и привести к экономии средств для пользователя.

    Disclosures

    Все авторы являются сотрудниками Becton Dickinson, Biosciences сегмента, Discovery лабораторные группы.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    3-layer Tissue Culture-treated 525cm2 BD Biosciences 353143
    5-layer Tissue Culture-treated 875cm2 BD Biosciences 353144
    100ml pipette BD Biosciences 357600
    10 ml pipette BD Biosciences 357551
    5 ml aspirating pipette BD Biosciences 357501
    50 ml Polypropylene conical tube BD Biosciences 352070
    T-175 flask Tissue Culture-treated BD Biosciences 353028
    Gram Crystal Violet BD Biosciences 212525
    DMEM Invitrogen 11885
    GMEM Sigma-Aldrich G5154
    RPMI-1640 ATCC 30-2001
    MEM ATCC 30-2003
    Trypsin-EDTA Lonza Inc. CC-5012
    Fetal Bovine serum Invitrogen 16000-044
    Tryptose Phosphate Broth Sigma-Aldrich T8159
    BHK-21 cells Sigma-Aldrich 85011433
    Hep-G2, LnCAP ATCC
    Ecopack 2-293 Clontech Laboratories
    Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
    Polystyrene Bead Polysciences, Inc. 24628-20
    Bio-Profile Flex Analyzer Nova BioMedical

    References

    1. Szabo, S.E., Monroe, S.L., Fiorino, S., Bitzan, J., & Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab. Hematol. 10, 109 (2004).
    2. Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity. Arch. Dermatol. Res. 281, 487 (1989).
    3. Sengupta, N., Rose, S.T., & Morgan, J.A. Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase. Biotechnol. Bioeng. 108, 83 (2010).
    4. Zhu, M.M., Goyal, A., Rank, D.L., & Gupta, S.K. Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study. Biotechnol. Prog. 21, (2005).
    5. Ryan, J.M., Sharf, B.B., & Cristofalo, J. The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts. Exp Cell Res 91, 389 (2004).
    6. Flaherty, P. Tips and Techniques for enhancing your cell culture. http://www.bdbiosciences.com/hotlines/webinars/ondemand/index.jsp (2009).
    7. Sanyal, S., Abraham, E.J, Slater, K., Cai A., Lacey B., Hartshorn C., Flaherty, P., McHugh B., & Qian S. Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. http://www.bdbiosciences.com/documents/multiflasks-SBSposter.pdf (2011).
    8. DiPersio, C.M., Jackson, D.A., & Zaret, K.S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Mol. Cell. Biol. 11, 4405 (1991).
    9. Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F.M., Fassler, R., Brakebusch, W.S. A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair. Dev. 129, 2303 (2002).

    Comments

    2 Comments

    The video did not display. Sound was fine.
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 1, 2012, 4:53 PM

    The video and sound did not run.
    Reply

    Posted by: AnonymousMarch 20, 2012, 8:30 AM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter