Creación de fracturas rígidamente estabilizados para la evaluación de osificación intramembranosa, la distracción osteogénica, o la curación de los defectos críticos de tamaño

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales de UCSF Institucional y el empleo Comisión y se ajustan a las directrices nacionales.

1. Preparación de los fijadores antes de la cirugía

1. Antes de crear una fractura estabilizada, es necesario montar el dispositivo de diseño personalizado de la fijación externa. Los marcos de fijación especialmente diseñados externos consta de dos anillos de aluminio estabilizados por tres de acero inoxidable # 0/56 varillas roscadas, 8 # 2/56 tuercas hexagonales y 17 tornillos a juego (Pequeña Parte Inc., de Miami Lakes, FL ^3).
2. Dos anillos de aluminio se necesitan por fractura. Para montar un anillo de 4 º 2/56 tuercas hexagonales (pequeña pieza Inc., de Miami Lakes, FL) y los pernos que coinciden en los agujeros correspondientes, éstos deben quedar sueltos. Este será el anillo proximal. Para montar el anillo distal 3 tuercas y tornillos, una vez más no apriete por completo.

2. Anestesia, fractura la Creación, y la aplicación del fijador

1. Los ratones (edad, sexo, y el cuerpopeso se determinó por el usuario) se anestesiaron por inyección intraperitoneal de 50mg/ml ketamina, 0,5 mg / ml de medetomidina (0,03 ml / ratón).
2. Aplicar lubricante ocular para los ojos de los ratones y colocar un pedazo de cinta adhesiva en su cabeza para proteger sus ojos durante el procedimiento.
3. El animal se coloca sobre una almohadilla de calentamiento durante el resto del procedimiento.
4. Transfix las metáfisis proximal y distal de la tibia izquierda por medio de cuatro pernos 0,25 mm de los insectos estériles (Anticorro: Tool Science Fine, Foster City, CA), uniendo los pines a una herramienta de Dremel y la perforación a través del hueso.
5. Pasadores están orientadas perpendicularmente al eje longitudinal de la tibia, y 90 ° entre sí. Al menos 10 mm entre los pasadores proximal y distal.
6. Coloque el primer anillo por encima de los pernos proximales con las tuercas hacia adentro, hacia las patillas. Asegure los pasadores para el anillo de mantenimiento de la tibia posición central dentro del anillo de aluminio.
7. Coloque el segundo anillo por debajo de la dipines Stal y asegurar los pasadores para el anillo con las tuercas hexagonales, como antes. Añadir la cuarta tuerca de perno en combinación para la parte distal del fijador.
8. Crear la fractura transversal por tres puntos de flexión con un dispositivo adecuado. Utilizamos el sistema de gravedad de Bonnarens Einhorn y ^4. Coloque la superficie posterolateral de la tibia a través de los bloques, aumentar el peso a una altura predeterminada a lo largo del brazo de la gota y dejar caer el peso de modo que entra en contacto con la cara anterolateral de la tibia para producir la fractura contundente. La altura del peso se deja caer desde necesita ser determinado para cada cepa de ratón para asegurar una fractura solo exclusivamente de la tibia.
9. Fractura se confirma por rayos-X.
10. Después de confirmar la fractura, tres de acero inoxidable # 0/56 varillas roscadas están unidos a los anillos. Comenzando desde el extremo distal insertar la varilla y enhebrar una tuerca en el anillo distal para bloquear la barra. A continuación, dicho de otra tuerca en la varilla, el anillo proximal se sentará en la parte superior de esta nut. Asegúrese de que los dos anillos se llevará a cabo a la misma distancia y no forzar las clavijas. Fijar el anillo proximal a las barras con una tuerca tercero.
11. Las inyecciones subcutáneas de buprenorfina (1,0 mg / kg) para la analgesia se administró inmediatamente después de la cirugía y los animales se vigilan para el dolor y la buprenorfina dado, según sea necesario.
12. La anestesia se revierte mediante la administración de atipamezol, y los animales son monitoreados hasta que son sensibles y deambular.

3. Osteogénesis por distracción (ver también: ^12,13)

Para modificar este procedimiento para dar cabida a distracción osteogénica es sencillo. Los anillos se mantienen en posición por varillas roscadas, y girando las tuercas que sujetan las varillas en su lugar los anillos se pueden mover de separación.

1. Latencia: Para la distracción osteogénica estándar de uso de este modelo de los fijadores se colocan en la tibia y se fue solo por un período de latencia de 5 días.
2. Distracción: osteog distracciónENESIS puede llevarse a cabo girando las tuercas de las barras estabilizadoras de giro de ¼ (0,25 mm) cada día 7 días.
3. Maduración: Bony puente se observa en 10 días y la consolidación completa se observa por 27 días después de la finalización de distracción.

4. Creación de un defecto crítico Empresas

Para crear un defecto de tamaño crítico los fijadores externos se aplican como se ha descrito anteriormente con las siguientes modificaciones.

1. Antes de comenzar el procedimiento de la piel se limpia con un 70% de etanol.
2. Los fijadores se aplican completamente antes de crear el defecto.
3. El ratón se coloque bajo el microscopio de disección para visualizar la tibia medial y una incisión (5-7 mm) se hace con una cuchilla # 10 en un bisturí.
4. El músculo se secciona suavemente y separados para exponer la mitad de diáfisis de la tibia.
5. Un segmento de 3 mm del hueso se retira entonces de la tijera mediados de diáfisis utilizando. Uso de tque señalar de las tijeras, el hueso se cortó lentamente lejos y fragmentos de hueso se eliminan con pinzas si es necesario. Se debe tener cuidado con las puntas de las tijeras para evitar el desplazamiento de la tibia con una gran fuerza mecánica.
6. Examinar el sitio quirúrgico para asegurar que no existen fragmentos de hueso, ya que podrían promover la curación.
7. Vuelva a colocar el músculo alrededor de los extremos romos de la tibia.
8. Cierre de la incisión en la piel con 2-3 suturas de monofilamento de poliaminas 6-0.
9. La anestesia se invierte y los animales control se elegirán para el dolor y dado analgésicos como se describió previamente.

5. Los resultados representativos

Cuando se aplica correctamente, los fijadores externos proporcionan una mayor estabilidad rígida de la fractura cerrada de tibia con una excelente reducción (Figuras 1, 2). Sin embargo, en algunos casos la reducción inadecuada (una diferencia obvia y grande entre los extremos de los huesos o fracturas múltiples se producen (Fig. 3 (fig. 4). En contraste, si la fractura no se estabiliza un callo grande cartílago está formado en el hueco de la fractura (fig. 5), y este es sustituido por hueso a través del proceso de osificación intramembranosa.

Figura 1. Radiografías que ilustran un dispositivo de fijación externo que se utiliza para estabilizar una fractura tibial. Radiografía tomada después de la fractura que muestra algunos de los segmentos óseos bien alineados (punta de flecha).

Figura 2. Imagen de un ratón después el fijador se ha aplicado.

Figura 3. Radiografía tomada después de la fracture muestra los segmentos de hueso desalineado y fragmentado (punta de flecha).

Figura 4. Fractura estabilizada a través de cura osificación intramembranosa. Tinción tricrómica de fractura estabilizada muestra un poco de hueso nuevo (b) en el sitio de fractura. Barras de escala = 500 micras.

Figura 5. No estabilizado fractura se cura a través de la osificación endocondral. Tinción tricrómica de fractura no estabilizada muestra cartílago (c) y hueso (b) en lugar de la fractura. Barras de escala = 500 micras.

Los huesos se curan en dos modalidades diferentes en función de la estabilidad mecánica (revisado en ^14). Cuando se deja que se forme una gran inestabilidad de la plantilla del cartílago en la línea de fractura que es reemplazado por hueso para cubrir los dos extremos del hueso roto. Proximal y distal a la rotura, el hueso se forma directamente por la osificación intramembranosa en el periostio y endostio. En contraste, en la curación de fracturas estable se produce exclusivamente a través de osificación intramembranosa ^3. Sin embargo, los mecanismos específicos que regulan el cambio entre estos dos procesos son desconocidos. Existe evidencia de que el destino de células madre en respuesta al ambiente mecánico está controlado genéticamente y puede ser alterado. En los ratones que carecen de MMP9 formas de cartílago en el sitio de la fractura de las fracturas estables que sugieren que MMP9 está involucrado en las decisiones de madre destino celular durante la reparación de la fractura ^5. El cartílago también pueden ser inducidas a formar en las fracturas estables si la proteína morfogenética ósea(BMP) vía de señalización se activa durante la reparación de fracturas ^8,9. Con el fin de sacar estas conclusiones proporcionar la estabilización rígida durante las primeras etapas de la curación es importante, porque estas decisiones el destino de células madre se realizan durante los primeros días después de la lesión ^11.

Nuestro método de fijación externa, cuando se aplica correctamente puede ser utilizado para estabilizar el hueso para evaluar osificación intramembranosa durante la curación de la fractura. Nuestro método crea una fractura, junto con otras lesiones de las extremidades que se producen en un impacto de alta velocidad. En contraste, los modelos de perforación de agujeros que se utilizan para evaluar osificación intramembranosa puede no reflejar el trauma en los pacientes. Además, el método descrito aquí se cierra, por lo que las complicaciones asociadas con una lesión abierta no confundir la interpretación de los resultados. Otro método común para la estabilización utiliza la colocación de un clavo intramedular previo a la fractura (por ejemplo ^4). Esta técnica es ampliamente utilizada, y la colocación de THe pin es simple y eficiente. Si bien este enfoque produce estabilización lateral que no proporciona la estabilidad rotacional. La lesión resultante se cura principalmente a través de osificación endocondral que se puede lograr sin estabilización en absoluto ^3. Fijación chapado también se ha utilizado para conseguir la estabilización de fracturas en ratones ^15. Aquí una fractura abierta se crea y especialmente diseñados fijadores internos se unen al hueso después de una osteotomía se hace. Al igual que en nuestro enfoque del método de fijación interna proporciona la estabilidad y la curación se produce a través de osificación intramembranosa. No observamos complicaciones significativas, infecciones de las vías de alfiler, u otras co-morbilidades asociadas con este procedimiento, y los animales son capaces de moverse alrededor de sus jaulas con facilidad. Los principales inconvenientes están en la longitud de tiempo que se tarda en alcanzar la competencia en este método, el tiempo necesario para completar el procedimiento, y la exigencia de equipos de dos personas para realizar el procedimiento. Yon con la combinación de las manipulaciones genéticas o fisiológicas a los ratones, comparando estabilizado para la curación de fracturas no estabilizada aporta un mayor conocimiento sobre los mecanismos que regulan el destino de las células madre en la curación de fracturas ^5, y ha permitido una investigación de la osteogénesis por distracción ^14, mientras que también nos proporciona un modelo de no-unión ^13.