Creación de fracturas rígidamente estabilizados para la evaluación de osificación intramembranosa, la distracción osteogénica, o la curación de los defectos críticos de tamaño

El objetivo general de este procedimiento es crear una tibia fijada externamente que pueda utilizarse para el análisis de la cicatrización de fracturas estabilizadas, la distracción, la osteogénesis y la reparación de un defecto por pérdida de segmento. Primero, se colocan los anillos del fijador y se mantienen en su lugar insertando agujas estériles para insectos en la porción proximal y distal de la tibia, y luego se aseguran los anillos a las agujas estériles para insectos. A continuación, se crea una fractura u osteotomía en la diáfisis media de la tibia. En la etapa final del procedimiento, se inserta la tercera varilla roscada para estabilizar completamente los anillos proximal y distal.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren los mecanismos de curación de fracturas, distracción, osteogénesis y engraftamiento óseo mediante análisis histológicos, moleculares y radiográficos. El procedimiento será demostrado por investigadores senior, la Dra. Diane, Y Yuu y la investigadora posdoctoral Dra. Chelsea Baney, del Instituto de Trauma Ortopédico del Hospital General de San Francisco, Universidad de California en San Francisco. Laboratorio de regeneración esquelética. Comience por armar el dispositivo de fijación externa de diseño personalizado.

Los marcos de fijación están hechos de dos anillos de aluminio estabilizados por tres varillas roscadas de acero inoxidable, ocho tuercas hexagonales y 17 pernos compatibles. Se necesitan dos anillos de aluminio por fractura para fabricar el anillo proximal, enroscando sueltamente cuatro tuercas hexagonales y pernos compatibles en los orificios adecuados. Para fabricar el anillo distal, enroscar de nuevo cuatro tuercas y pernos sin apretar completamente, luego colocar dos de las varillas roscadas largas que estabilizarán el fijador en el anillo distal en los orificios ubicados a las 12 y a las seis, y fijar con dos tuercas hexagonales.

Sedue un ratón de la edad y sexo deseados mediante una inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina. Confirme la anestesia completa utilizando una prueba de pellizco en el dedo del pie. Después de eliminar el pelo y lavar con antiséptico, aplique un lubricante ocular y luego coloque al ratón sobre una almohadilla calefactora durante el resto del procedimiento.

Coloque el anillo proximal en la pata con las tuercas orientadas en dirección distal y desplace el anillo por encima de la articulación de la rodilla. Fije las metáfisis proximal y distal de la tibia izquierda utilizando cuatro pasadores estériles para insectos de 0,25 milímetros, sujetando los pasadores a una taladradora y perforando a través del hueso. Oriente los pasadores perpendicularmente al eje longitudinal de la tibia y en ángulo de 90 grados entre sí, dejando al menos 10 milímetros de separación entre los pasadores proximal y distal.

Sujete los clavos al anillo proximal, manteniendo la tibia posicionada centralmente dentro del anillo de aluminio. Coloque el segundo anillo debajo de los clavos distales. Sujete las dos varillas al anillo proximal y luego fije los clavos al anillo utilizando las tuercas hexagonales.

Como antes, cree la fractura transversal mediante flexión de tres puntos con un dispositivo adecuado. Coloque la superficie lateral posterior de la tibia sobre los bloques. Eleve el peso hasta una altura predeterminada a lo largo del brazo de caída y suelte el peso para que impacte en la cara anterolateral de la tibia.

Para producir la fractura recta, confirme la fractura mediante radiografía. A continuación, fije la última varilla roscada de acero inoxidable a los anillos comenzando desde el extremo distal. Introduzca la varilla y enrosque una tuerca en el anillo distal para asegurar la varilla.

Luego coloque otra tuerca en la varilla de modo que el anillo proximal quede posicionado en la parte superior. Asegúrese de que los dos anillos se mantengan a distancias iguales y de que no ejerzan tensión sobre los pasadores. Sujete el anillo proximal a las varillas con una tercera tuerca.

Agregue aamaz all para revertir la anestesia y buprenorfina para analgesia, y supervise a los animales hasta que estén reactivos y puedan caminar. Luego administre inyecciones subcutáneas de buprenorfina para analgesia y nuevamente, cuatro horas después, para la distracción osteogénica estándar. Utilizando este modelo, coloque los fijadores sobre la tibia, cree una fractura y déjelos en reposo durante un período de latencia de cinco días.

Después de cinco días, realice la osteogénesis por distracción girando las tuercas de los tornillos de estabilización. Un cuarto de vuelta cada día durante siete días. Los animales se vigilan estrechamente después de la cirugía para determinar la necesidad de analgesia adicional.

Se observa la formación de puente óseo a los 10 días, y la consolidación completa se observa a los 27 días después de finalizar la distracción. Después de administrar anestesia, eliminar el vello con un agente depilatorio y limpiar la piel con antiséptico, coloque los fijadores como se describió previamente. Coloque al ratón bajo el microscopio estereoscópico para visualizar la tibia medial y luego realice una incisión de cinco a siete milímetros con una hoja número 10 en un escalpelo.

Seccione y separe suavemente el músculo para exponer la diáfisis media de la tibia. Utilizando la punta de un par de tijeras, corte lentamente un segmento de tres milímetros de la tibia, teniendo cuidado de no desplazar el hueso con una fuerza mecánica excesiva. Luego, retire cualquier fragmento óseo residual con pinzas.

Después de examinar el sitio quirúrgico en busca de fragmentos óseos, reponga el músculo alrededor de los extremos romos de la tibia. Cierre la incisión en la piel con dos o tres puntos de sutura de polipropileno monofilamento 6.0, e inserte luego la tercera varilla para estabilizar el fijador externo. Como se mostró anteriormente, invierta la anestesia, administre analgésicos y continúe monitoreando a los animales en busca de dolor.

Como se describió previamente, cuando se aplica correctamente, los fijadores externos proporcionan una estabilidad altamente rígida de la fractura tibial cerrada con una excelente reducción, tal como se muestra en esta radiografía tomada tras la fractura, donde los segmentos óseos bien alineados se indican mediante las flechas. Las fracturas estabilizadas mediante este método sanan principalmente mediante ossificación intramembranosa; aquí se muestra, usando tinción tricrómica, que la fractura estabilizada presenta algo de hueso nuevo en el sitio de la fractura. En contraste, si la fractura no se estabiliza, se forma un gran callo de cartílago en el espacio de la fractura, y este es reemplazado por hueso a través del proceso de ossificación endocondral tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ortopedia exploraran los mecanismos de curación estable de fracturas en ratones.