The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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1Department of Botany, University of British Columbia - UBC, 2Department of Chemistry, University of British Columbia - UBC
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Samuels, L., DeBono, A., Lam, P., Wen, M., Jetter, R., Kunst, L. Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis. J. Vis. Exp. (16), e709, doi:10.3791/709 (2008).
मैं दृश्य स्क्रीन और रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण छल्ली म्यूटेंट को पहचानें.
मॉडल संयंत्र Arabidopsis thaliana में छल्ली म्यूटेंट "eceriferum" म्यूटेंट, जो "मोम असर नहीं" का मतलब है कहा जाता है. वे दृश्य स्क्रीन में जा सकता है कि, उत्परिवर्ती पर देख कर आप देख सकते हैं कि जंगली प्रकार के पौधों के पुष्पक्रम स्टेम सफेद है जबकि म्यूटेंट हरी अंधेरे चमकदार उपजी है. म्यूटेंट कि दृश्य स्क्रीन के इस प्रकार में अलग किया गया था यह एक है, कहा जाता है eceriferum4 या cer4 है.
एक रिवर्स आनुवंशिकी दृष्टिकोण के साथ दिलचस्प छल्ली म्यूटेंट की खोज का एक अन्य तरीका है चुनने के ब्याज की उम्मीदवार जीन और फिर अध्ययन है कि जीन के साथ संयंत्र लाइनों बाधित. इन म्यूटेंट TDNA हित के जीन में बाधा पहुँचा है, इस मामले में, कि अब हम MAH1 कॉल साइटोक्रोम P450.
पीसीआर परिणाम (वीडियो में दिखाया गया है एक तरह) की पुष्टि कर सकते हैं कि TDNA सम्मिलन हित के जीन में है. जब दो जीन विशेष - प्राइमरों जंगली प्रकार डीएनए बढ़ाना करने के लिए उपयोग किया जाता है, हम एक उत्पाद देखते हैं, लेकिन अगर TDNA यह बीच में आता है, के रूप में इस उत्परिवर्ती, वहाँ कोई उत्पाद है. इसके विपरीत, TDNA और जीन के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करते हुए, एक उत्पाद केवल उत्परिवर्ती में देखा जाता है. हम homozygous उत्परिवर्ती लाइनों, जहां जीन की दोनों प्रतियां मातृ और पैतृक बाधित कर रहे हैं के लिए देखो. यदि जीन की एक प्रति TDNA द्वारा बाधित है और अन्य प्रतिलिपि अभी भी जंगली प्रकार, पीसीआर परिणाम मिश्रित कर रहे हैं.
द्वितीय. गैस क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करने के लिए Cutlicle वैक्स की रासायनिक संरचना का निर्धारण.
हम गैस क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर मोम की रासायनिक संरचना का विश्लेषण. सबसे पहले, घुलनशील मोम यौगिकों संयंत्र सतह से क्लोरोफॉर्म में सूई के द्वारा हटा रहे हैं.
फिर, नमूने गैस क्रोमैटोग्राफी कॉलम में इंजेक्ट कर रहे हैं, जहां वे गर्म हो जाएगा और गैस की एक धारा पर के माध्यम से भेजा. स्तंभ की दीवारों के लिए विभिन्न यौगिकों और अधिक या कम छड़ी, यौगिकों को अलग, और वे बाहर स्तंभ के दूसरे छोर पर अन्य के बाद एक आते हैं. फिर, के रूप में यौगिकों लौ ionization डिटेक्टर से अधिक से गुजरती है, हम चोटियों देखते हैं. प्रत्येक चोटी की अवधारण समय विभिन्न यौगिकों के लिए विशेषता है और मास स्पेक्ट्रोमेट्री से, हम Arabidopsis मोम के घटकों में से प्रत्येक की पहचान की है. प्रमुख चोटियों वर्तमान alkane C29, C29 ketone और C29 माध्यमिक शराब के हैं. मामूली चोटियों माध्यमिक alcohols, फैटी एसिड, aldehydes और एस्टर हैं. चोटियों के तहत क्षेत्र, मानक के सापेक्ष हमें बताता है कितना प्रत्येक परिसर के मौजूद है.
जब इन छल्ली म्यूटेंट से गैस chromatograms पर देख, एक नोटिस कर सकते हैं कैसे cer4 प्राथमिक alcohols और एस्टर का अभाव है, जबकि mah1 माध्यमिक एल्कोहल और ketones का अभाव है. इन phenotypes हमारे संयंत्र में रुचि के जीन के समारोह के बारे में एक बहुत कुछ बता सकते हैं. उदाहरण के लिए, पहले हमें पता था कि जो जीन cer4 लाइन में mutated, phenotype हमें बताया है कि वहाँ biosynthetic मार्ग का प्राथमिक शराब शाखा में एक समस्या थी. के बाद कि जीन की पहचान आणविक Kunst प्रयोगशाला में अध्ययन किया गया था, यह पाया गया कि यह फैटी एसाइल reductases के एक जीन परिवार है, जो इस रसायन phenotype के साथ अच्छी तरह से फिट बैठता है का हिस्सा है.
III. क्रायो SEM का उपयोग करने के लिए छल्ली कण की संरचना निर्धारित
जब हम Arabidopsis छल्ली म्यूटेंट अध्ययन, हम देख सकते हैं अगर वे गहरे हरे रंग की, चमकदार phenotype या जंगली प्रकार के स्टेम पर सफेद उपस्थिति है. हम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए संयंत्र की सतह पर छल्ली पर देखो और दृश्य फेनोटाइप के आधार की पहचान. हम क्रायो - SEM उपयोग करते हैं, पौधों को ठंड और उन्हें तरल नाइट्रोजन तापमान में देखने के क्रम में छल्ली को बरकरार रखें क्योंकि SEM वैक्यूम संचालित की आवश्यकता है और उन्हें जमे हुए रखने के बिना, नमूने बाहर सूखी और गिर जाएगी.
यहाँ cer4 और mah1 नमूने, जंगली प्रकार के नियंत्रण के साथ साथ dissected, और SEM ठूंठ पर जमे हुए हैं. जब नमूने माइक्रोस्कोप की ठंड चरण के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं, तो आप देख सकते हैं कि जंगली प्रकार Arabidopsis स्टेम छल्ली की सतह के क्रिस्टल के साथ कवर किया जाता है. यह प्रकाश है कि उन क्रिस्टल बिखरने है कि स्टेम अपनी सफेद उपस्थिति देता है. यहाँ cer4 स्टेम है, याद है यह चमकदार देखा? यह सतह पर क्रिस्टल का अभाव है.
लोग प्रयोग किया है जहां वे एक संयंत्र की छल्ली से एक शुद्ध मोम यौगिक अलग करने और जब वे इसे प्रयोगशाला में recrystallize, क्रिस्टल पौधों पर पाए जाने वाले के रूप में एक ही आकार के रूप में. Arabidopsis में, हम का मानना है कि क्रिस्टल यौगिकों का एक मिश्रण के बने होते हैं और स्थिति और अधिक जटिल है. उदाहरण के लिए, रासायनिक विश्लेषण हमें पता चलता है कि cer4 में, केवल प्राथमिक alcohols और उनके व्युत्पन्न एस्टर के छोटे घटक याद कर रहे हैं, अभी तक CE के पर क्रिस्टलr4 स्टेम गए हैं. Mah1 के मामले में, कि साइटोक्रोम P450 एंजाइम में उत्परिवर्तन के प्रभाव है कि उत्परिवर्ती पौधों मोम, माध्यमिक एल्कोहल और ketones के दो प्रमुख घटक कमी है, अभी तक mah1 पौधों पर क्रिस्टल सामान्य फार्म.
Arabidopsis छल्ली म्यूटेंट के बारे में अधिक जानने के लिए कृपया जाओ संयंत्र जीवविज्ञान की वार्षिक समीक्षा .
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I can't say enough how much I love what you have done. This work is extremely beneficial for generating interest in the research and the benefits of the research techniques involved. I hope this is shown in highschools and undergraduate programs all around the world (what a great teaching tool). Kudos to the foresight and the insight the authors have in taking the time to produce and publish this. Good luck in your future endeavours.
PS. I love Allan's hair and impeccable sense of direction.
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ReplyPosted by: Stephen GreerJune 14, 2008, 1:32 PM