使用拟南芥eceriferum突变体探索植物角质层的生物合成

植物角质层是植物上的蜡质外层覆盖物，在节水方面起主要作用，但也是防止病原微生物进入的重要屏障。角质层由一种称为角质的坚韧交联聚合物和密封植物表面的保护蜡层组成。角质层的蜡质层在许多植物上很明显，在常春藤叶上表现为有光泽的薄膜，或在葡萄或卷心菜叶表面表现为尘土飞扬的外层。

多亏了蜡中存在的光散射晶体，因为角质层是植物对陆地环境的重要适应。了解参与植物角质层形成的基因在农业和林业中都有应用。今天，我们将展示通过正向和反向遗传学方法鉴定的植物角质层 MUS 的分析。

嗨，我叫 Patricia Lam，来自 UVC 机器人系 Lyrica Kunz 实验室。今天，我和其他人将向您展示如何研究这些植物 AB 可以了解植物如何制造特定的蜡。我是来自 UVC Brain Heart Jet 实验室的 Meen，我将向您展示如何使用气相色谱法分析表皮蜡的化学成分。

我是来自 UBC 的 Lacey Samuels 实验室的 Alan Dub Bono，我将向您展示我们如何使用冷冻扫描电子显微镜分析视镜表面的晶体结构。我们的总体目标是了解植物如何获取 16 或 18 个碳的普通脂肪酸，并将它们扩展到 26 到 34 个碳的非常长的链。然后将它们修饰成我们在植物表面发现的保护性脂质。

那么让我们开始吧，我将向您展示如何使用正向和反向遗传方法识别特定的蜡意味着什么。您好。所以这里我们有一个快速 opis 的 Cut 突变体，我们称之为 sro，意思是不带蜡。

视觉筛选用于 OCI 隔离这些突变体，这意味着它们是通过视觉识别的。当你观察突变体时，你可以看到井型植物的流入和茎是白色的，而突变体有深绿色有光泽的茎。在 Martin K 和他的同事完成的这种视觉筛选中分离出的突变体之一被称为 is from four 或 SIR 4。

发现 cuco 突变体的另一种方法是使用逆向遗传方法选择候选基因，然后研究在这些突变体中破坏该基因的 PLA 系，TDNA 用于破坏目标基因。TD NA 是自然界中农杆菌肿瘤粪便插入植物的 DNA 片段转移。这种细菌感染 TNA 是其感染过程的一部分，但科学家们已经解除了细菌的武装，使其不会致病，并用作将 DNA 转移到植物中的工具。

在我们研究角质层的这个案例中，我们使用 TDNA 来破坏细胞色素 P 4 50 酶的基因，我们现在称之为 M1.In 为了确认我们的 TDA 插入破坏了 M1 基因，我们进行了 PCR。此处显示的 PCR 凝胶证实 TDA 插入位于目标基因中。当使用两个基因特异性引物扩增孔型 DNA 时，我们会看到该泳道中的条带显示产物，但 TD 会像在突变体中一样中断它。

相反，没有使用对 TDNA 和基因具有特异性的引物的产品。产品仅在突变体中可见。我们通常寻找基因的母系和父系拷贝都被破坏的纯合突变系。

然而，当基因的一个拷贝被 TDNA 破坏而另一个拷贝仍然是好型时，PCR R 结果会像这样混合。现在我已经向您展示了如何识别角质层突变体 surf four ml one me，我将向您展示如何使用气相色谱法识别化学成分。谢谢 Patricia。

好了，让我们在进行气相色谱之前分析角质层 I。必须通过在氯仿中加深来从植物表面去除可溶性蜡化合物。氯仿完全去除了植物中的可溶性蜡和角质。

溶解蜡成分后，将氯仿蜡混合物注入气相色谱柱，在那里加热并加热传感器。蜡混合物中的不同化合物或多或少地粘附在分离化合物的塔壁上，并且它们一个接一个地从塔的另一端出来。然后，当化合物通过火焰离子化检测器时，我们会看到峰。

每个峰的保留时间是不同化合物的特征，并使用质谱法。我们已经确定了 ADOS 蜡的每种成分。查看野生型植物的色谱图，我们可以看到对应于仲醇中 29 碳杂散链 LK 酮的主峰。

小峰是初级醇的析出高度，作为峰下相对于标准品的面积告诉我们每种化合物的含量。以下是 Patricia 刚刚向我们展示的植物品系的色谱图。请注意伯醇和酯类的缺乏，而 马 一类醇类缺乏仲醇和酮类。

这些表型可以告诉我们很多关于植物中目标基因的功能。例如，在我们知道 pho 系中的哪个基因发生突变之前，表型告诉我们生物合成途径的初级酒精分支存在问题。在 consta 实验室研究该基因的分子身份后，发现它是脂肪酸还原酶基因家族的一部分，与这种化学表型非常吻合。

我们现在可以将这些基因放在通路上，显示植物如何制造蜡的这一成分。好的，这就是我们分析角质层突变体的化学成分的方法。现在，Alan 将向我们展示如何使用扫描电子显微镜检查角质层的结构。谢谢。

有人想看一些漂亮的角质层图片吗？让我们开始工作吧。当我们通过肉眼研究 Rapid opsys 正弦突变体时，我们可以看到它们具有深绿色的光泽表型。

当我们研究野生型植物时，我们可以看到茎上呈白色，以确定我们肉眼可以看到的这些表型的基础。扫描电子显微镜用于观察植物表面的角质层结构。由于我们从气相色谱工作中了解了蜡的化学成分，因此我们可以看到化学成分与蜡晶体的结构有何关系。

这些晶体将是昆虫或病原体降落在茎表面的第一个东西。所以它们是角质层藻类的重要组成部分。进行冷冻 SEM 时，植物必须冷冻。

在液氮中，植物在观察期间保持在零下 150 到 100 摄氏度之间。在该范围内，极低的温度对于保持细胞完整至关重要，因为 SEM 需要真空才能运行，如果它们不是冷冻的，样品会变干和塌陷。现在我们准备剖析 surfer four 和 mah one 样本以及野生类型控件。

我首先从这些植物中去除了花和 CLIC，然后从野生型和突变体中剪下发育匹配的茎段。然后我将它们安装到 SEM 步骤上。当样品被转移到显微镜的冷阶段并进行观察时，您可以看到野生 hyper avid opsis 茎角质层的表面覆盖着晶体。

这些晶体发出的光使茎呈现出白色的外观。现在回想一下茎在突变体上看起来是有光泽的。您可以在 SEM 图像中看到它表面没有晶体。

那么这些晶体是由什么制成的，是什么赋予了它们有趣的形状呢？答案是不同的。蜡化学成分产生不同形状的晶体。

在从植物角质层中分离出单个纯蜡化合物并重新结晶的实验中，晶体形成的形状与植物上发现的形状相同。在兔子 opsis 中，我们认为晶体是由化合物的混合物组成的，情况要复杂得多。例如，MEO 所做的化学分析表明，在 surf four 中，只有伯醇的次要成分及其衍生物酯缺失。

然而，冲浪四杆上的晶体已经消失了。在 M1 的情况下，细胞色素 P four 50 酶突变的影响是突变植物缺乏蜡的两个主要成分，仲醇和酮。然而，MAH 一株植物上的晶体是正常形成的。

所以你看到没有光散射晶体，这给了 SRA 突变体。它们的光泽表型总是与角质层组成的变化呈正相关。然而，使用这种方法永远不会发现像 mah one 这样的突变体，因为尽管气相色谱法揭示了化学表型的变化，但它的晶体是正常的。

因此，还需要反向遗传学方法来识别已知基因家族中的角质层基因。我们刚刚表明，正向和反向遗传学都允许我们识别 rub dous 角质层突变体。使用气相色谱法对突变体表型进行化学分析有助于我们了解植物如何制造保护性角质层脂质 Cryo SEM 向我们展示了当角质层的化学性质发生变化时，植物表面的晶体是如何变化的。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。