Name: Verwendung von Arabidopsis-Mutanten zu eceriferum Kutikula Biosynthese entdecken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-31T22:16:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Entdecken Sie die Analyse von Arabidopsis-Kutikula-Mutanten zur Erforschung der Wachsbiosynthese. Diese Methode zeigt, wie genetische Ansätze zur Untersuchung von Pflanzenoberflächen und Pathogenabwehr eingesetzt werden.

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I. Visuelle Screens und genetische Ansätze zur Identifizierung Cuticle Mutanten. Cuticle Mutanten in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana werden als &quot;eceriferum&quot; Mutanten, was bedeutet, &quot;die nicht mit Wachs&quot;. Sie können in Sichtschutz sein, das heißt, indem man sich einfach die Mutante, können Sie sehen, dass der Blütenstand Stamm von Wildtyp-Pflanzen weißlich wird, während die Mutanten dunkelgrün glänzende Stängel haben. Einer der Mutanten, die in dieser Art von Sichtschutz isoliert wurde, ist dieser, als eceriferum4 oder cer4. Eine weitere Möglichkeit der Entdeckung interessanter Nagelhaut Mutanten ist mit einem reversen Genetik Ansatz: Auswahl Kandidatengene von Interesse und dann studieren Anlage Zeilen mit, dass Gen unterbrochen. Diese Mutanten haben tDNA Störung des Gens von Interesse, in diesem Fall ein Cytochrom P450, dass wir heute MAH1. PCR-Ergebnisse (wie in dem Video zu sehen) kann bestätigen, dass die tDNA Insertion in das Gen von Interesse ist. Wenn zwei Gen-spezifische Primer verwendet werden, um Wildtyp-DNA verstärken, sehen wir ein Produkt, aber wenn die tDNA unterbricht sie, wie in dieser Mutante, gibt es kein Produkt gibt. Umgekehrt unter Verwendung von Primern spezifisch für die tDNA und Gen ist ein Produkt nur in der Mutante zu sehen. Wir suchen homozygot mutierten Linien, bei denen sowohl die mütterlichen und väterlichen Kopien des Gens gestört sind. Wenn eine Kopie des Gens durch tDNA gestört ist und die andere Kopie ist immer noch wild-type, werden die PCR-Ergebnisse gemischt. II. Mittels Gaschromatographie auf die chemische Zusammensetzung der Cutlicle Wax Bestimmen. Wir analysieren die chemische Zusammensetzung des Wachses mit Hilfe der Gaschromatographie. Zunächst werden die löslichen Wachsverbindungen aus der Anlage Oberfläche durch Eintauchen in Chloroform entfernt. Dann werden die Proben in die Gas-Chromatographie-Säule injiziert, wo sie erhitzt und geschickt durch auf einem Gasstrom. Verschiedene Verbindungen stick mehr oder weniger an den Wänden der Säule, die Trennung der Verbindungen, und sie kommen aus einer nach dem anderen am anderen Ende der Spalte. Dann, als die Verbindungen über den Flammenionisationsdetektor passieren, sehen wir die Gipfel. Die Verweildauer der einzelnen Peaks ist charakteristisch für die verschiedenen Verbindungen und von Massenspektrometrie, haben wir jede der Komponenten von Arabidopsis Wachs identifiziert. Die wichtigsten Peaks vorhanden sind, dass der C29-Alkan, das C29-Keton und die C29 sekundärer Alkohol. Der kleinere Gipfel sind die sekundären Alkohole, Fettsäuren, Aldehyde und Ester. Die Fläche unter den Peaks, bezogen auf Standard, erzählt uns, wie viel von jeder Verbindung vorhanden ist. Bei der Betrachtung Gaschromatogramme von diesen Nagelhaut Mutanten, kann man feststellen, wie cer4 die primären Alkohole und Ester fehlt, während MAH1 fehlt sekundäre Alkohole und Ketone. Diese Phänotypen können uns viel über die Funktion des Gens von Interesse in der Anlage. Zum Beispiel, bevor wir wussten, welche Gen wurde in die cer4 Linie mutiert, sagte der Phänotyp uns, dass es ein Problem in der primären Alkohol Zweig der Biosyntheseweg. Nach der molekularen Identität des Gens in der Kunst-Labor untersucht wurde, wurde festgestellt, dass es Teil einer Genfamilie von Fettacyl Reduktasen, die gut mit dieser chemischen Phänotyp ist. III. Mit Cryo-SEM, um die Struktur der Kutikula Kristalle bestimmen Wenn wir das Arabidopsis-Mutanten Nagelhaut studieren, können wir sehen, ob sie den dunkelgrünen, glänzenden Phänotyp oder der Wildtyp-weißliches Aussehen auf dem Vorbau zu haben. Wir verwenden das Rasterelektronenmikroskop an der Kutikula auf der Oberfläche der Pflanze suchen und identifizieren anhand der visuellen Phänotyp. Wir verwenden Kryo-SEM, das Einfrieren der Pflanzen und betrachten bei der Temperatur flüssigen Stickstoffs in Ordnung zu halten die Schuppenschicht intakt, weil die SEM erfordert ein Vakuum zu bedienen und ohne halten sie gefroren, die Proben würden austrocknen und zerfallen. Hier cer4 und MAH1 Proben, zusammen mit dem Wildtyp-Kontrollen sind präpariert und eingefroren auf dem SEM Stummel. Als die Proben zu den kalten Stufen des Mikroskops übertragen werden, können Sie sehen, dass die Oberfläche des Wildtyp-Arabidopsis Stammzellen Nagelhaut mit Kristallen bedeckt ist. Es ist das Licht, Streuung an ist die Kristalle, die die Stammzellen gibt seinen weißliches Aussehen. Hier ist die cer4 Stammzellen; erinnern sah es glänzend? Es fehlt die Kristalle auf der Oberfläche. Die Menschen haben Experimente gemacht, wo sie ein reines Wachs Verbindung aus der Kutikula einer Pflanze und zu isolieren, wenn sie es rekristallisieren im Labor bilden die Kristalle die gleiche Form wie die auf den Pflanzen gefunden. In Arabidopsis, glauben wir, dass die Kristalle bestehen aus einer Mischung von Verbindungen hergestellt und die Situation ist komplizierter. Zum Beispiel zeigt die chemische Analyse uns, dass in cer4, nur die kleinere Komponente des primären Alkohole und ihre Derivate Ester fehlen, doch die Kristalle auf der cer4 Stammzellen sind weg. Im Falle von MAH1, ist der Effekt der Mutation in das Cytochrom-P450-Enzym, das die mutierte Pflanzen zwei Hauptkomponenten des Wachses, sekundäre Alkohole und Ketone Mangel, doch die Kristalle auf der MAH1 Pflanzen bilden in der Regel. Wenn Sie mehr über Arabidopsis-Mutanten Kutikula finden Sie unter <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.arplant.59.103006.093219" target="_blank">Annual Review of Plant Biology</a> .

verwendung von arabidopsis-mutanten zu eceriferum kutikula biosynthese entdecken

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

Die Kutikula ist eine wachsartige Außenhaut auf Pflanzen, die eine primäre Rolle in Wasserschutzgebieten hat, ist aber auch eine wichtige Barriere gegen das Eindringen von pathogenen Mikroorganismen. Die Kutikula besteht aus einem harten vernetzten Polymer namens &quot;Cutin&quot; und einer schützenden Wachsschicht, die Dichtungen der Anlage Oberfläche. Die Wachsschicht der Cuticula ist offensichtlich bei vielen Pflanzen, erscheint als glänzender Film auf der Efeublatt oder als eine staubige äußere Hülle auf der Oberfläche von einer Traube oder ein Kohlblatt dank Streuung Kristalle im Wachs Licht. Da die Kutikula ist eine wesentliche Anpassung der Anlagen an eine terrestrische Umwelt, das Verständnis der Gene in Kutikula-Bildung beteiligt hat Anwendungen in Land-und Forstwirtschaft. Heute zeigen wir die Analyse der Kutikula-Mutanten durch Forward-und Reverse Genetik Ansätze identifiziert.

Die Kutikula ist eine wachsartige Außenhaut auf Pflanzen, die eine primäre Rolle in Wasserschutzgebieten hat aber auch eine wichtige Barriere gegen das Eindringen von pathogenen Mikroorganismen. In diesem Video zeigen wir die Analyse der Kutikula-Mutanten durch Forward-und Reverse Genetik Ansätze identifiziert.

Verwendung von Arabidopsis-Mutanten zu eceriferum Kutikula Biosynthese entdecken

Die Pflanzenkutikula ist eine wachsartige Außenhülle von Pflanzen, die eine primäre Rolle bei der Wassereinsparung spielt, aber auch eine wichtige Barriere gegen das Eindringen von ... darstellt.

Der Pflanzenkutikula ist eine wachsartige äußere Schicht auf Pflanzen, die hauptsächlich der Wasserkonservierung dient, aber auch eine wichtige Barriere gegen das Eindringen pathogener Mikroorganismen darstellt. Die Kutikula besteht aus einem widerstandsfähigen vernetzten Polymer namens Cutin sowie einer schützenden Wachsschicht, die die Oberfläche der Pflanze versiegelt. Die wachsartige Schicht der Kutikula ist bei vielen Pflanzen deutlich sichtbar, etwa als glänzender Film auf dem Efeublatt oder als staubige äußere Schicht auf der Oberfläche einer Weintraube oder eines Kohlblatts.Dank lichtstreuender Kristalle, die im Wachs vorhanden sind, da die Cuticula eine wesentliche Anpassung der Pflanzen an eine terrestrische Umgebung darstellt. Das Verständnis der Gene, die an der Bildung der Pflanzencuticula beteiligt sind, hat Anwendungen sowohl in der Landwirtschaft als auch in der Forstwirtschaft. Heute werden wir die Analyse der Pflanzencuticula MUS zeigen, die durch Vorwärts- und Rückwärts-Genetik-Ansätze identifiziert wurde.Hallo, mein Name ist Patricia Lam aus dem Labor von Lyrica Kunz am Department of Bot an der UVC. Heute werden ich und andere Ihnen zeigen, wie diese Pflanzen AB do können untersucht werden, um zu verstehen, wie Pflanzen bestimmtes Wachs bilden. Ich bin Meen aus dem Labor von Brain Heart Jet an der UVC, und ich werde Ihnen zeigen, wie wir die chemische Zusammensetzung von kutikulärem Wachs mittels Gaschromatographie analysieren.Und ich bin Alan Dub Bono aus dem Labor von Lacey Samuels, ebenfalls an der UBC, und ich zeige Ihnen, wie wir die Kristallstruktur auf der Oberfläche von Opisis mittels Kryo-Rasterelektronenmikroskopie analysieren. Unser übergeordnetes Ziel ist es zu verstehen, wie Pflanzen gewöhnliche Fettsäuren mit 16 oder 18 Kohlenstoffatomen auf sehr lange Ketten mit 26 bis 34 Kohlenstoffatomen verlängern und sie anschließend zu schützenden Lipiden modifizieren, die wir an der Pflanzenoberfläche finden.Beginnen wir also, und ich zeige Ihnen, wie wir bestimmte Wachstypen mithilfe von Forward- und Reverse-Genetik-Ansätzen identifizieren. Hallo nochmals. Hier haben wir einen Cut-Mutanten von Rapid opis, den wir sro nennen, was „ohne Wachs“ bedeutet.Visuelle Tests wurden verwendet, um diese Mutanten aus OCI zu isolieren, was bedeutet, dass sie durch mikroskopische Beobachtung identifiziert wurden. Wenn man sich die Mutanten ansieht, erkennt man, dass die Inflorreszenzen und Stängel von Wildtyp-Pflanzen weißlich sind, während die Mutanten dunkelgrüne, glänzende Stängel aufweisen. Eine der Mutanten, die bei dieser Art visueller Testung von Martin K. und seinen Kollegen isoliert wurde, ist die sogenannte is from four oder SIR four.Eine weitere Möglichkeit, CUCO-Mutanten zu entdecken, ist ein reverser genetischer Ansatz, bei dem Kandidatengene ausgewählt und anschließend PLA-Linien untersucht werden, in denen diese Gene in den Mutanten unterbrochen sind. Zur Unterbrechung des gewünschten Gens wurde T-DNA verwendet. T-DNA ist ein übertragenes DNA-Segment, das in der Natur durch Agrobacterium tumefaciens in die Pflanze eingefügt wird. Dieses Bakterium infiziert Pflanzen als Teil seines Infektionsprozesses, doch Wissenschaftler haben das Bakterium entwaffnet, sodass es nicht mehr pathogen ist, und nutzen es als Werkzeug, um DNA in Pflanzen einzuschleusen.In diesem Fall unserer Untersuchung der Cuticula verwendeten wir die TDNA, um das Gen für ein Cytochrom-P450-Enzym zu unterbrechen, das wir nun M1 nennen. Um zu bestätigen, dass unsere TDA-Insertion das M1-Gen unterbrochen hat, führen wir eine PCR durch. Das hier gezeigte PCR-Gele bestätigt, dass die TDA-Insertion im Gen der Interesse liegt. Wenn zwei genspezifische Primer verwendet werden, um Wildtyp-DNA zu amplifizieren, beobachten wir ein Produkt, das durch das Band in dieser Spur angezeigt wird, doch die TD unterbricht es wie beim Mutanten.Umgekehrt wird kein Produkt mit einem Primer erzeugt, der spezifisch für die TDNA und das Gen ist. Ein Produkt ist nur im Mutanten sichtbar. Typischerweise suchen wir nach homozygoten Mutantenlinien, bei denen sowohl die mütterliche als auch die väterliche Kopie des Gens unterbrochen ist.Jedoch wenn eine Kopie des Gens durch die TDNA unterbrochen ist und die andere Kopie noch vom Wildtyp ist, sind die PCR-R-Ergebnisse wie folgt gemischt. Nachdem ich Ihnen nun gezeigt habe, wie man den Cuticula-Mutanten surf four ml one me identifiziert, werde ich Ihnen zeigen, wie man die chemische Zusammensetzung mittels Gaschromatographie bestimmt. Danke, Patricia.Okay, analysieren wir nun die Cuticula, bevor die Gaschromatographie durchgeführt wird. Die löslichen Wachskomponenten müssen durch Eintauchen in Chloroform von der Pflanzenoberfläche entfernt werden. Chloroform entfernt die löslichen Wachse vollständig, löst aber auch Cutin aus der Pflanze heraus.Nachdem die Wachskomponenten gelöst sind, wird das Chloroform-Wachs-Gemisch in die Gaschromatographiesäule injiziert, wo es erhitzt und auf einem Gasstrom geführt wird. Unterschiedliche Verbindungen des Wachsgemischs haften mehr oder weniger an den Wänden der Säule, wodurch die Trennung der Verbindungen erfolgt, und sie treten nacheinander am anderen Ende der Säule aus. Wenn dann die Verbindungen über den Flammenionisationsdetektor laufen, sehen wir die Peaks.Die Retentionszeit jedes Peaks ist charakteristisch für verschiedene Verbindungen und ermöglicht mithilfe der Massenspektrometrie die Identifizierung der einzelnen Bestandteile der ADOS-Wachse. Anhand des Chromatogramms einer Wildtyp-Pflanze können wir die Hauptpeaks erkennen, die einer 29-Kohlenstoff-geraden Kette aus LK-Keton und sekundärem Alkohol entsprechen.Die kleineren Peaks entsprechen den primären Alkoholen, und die Fläche unter den Peaks im Verhältnis zum Standard zeigt uns, wie viel von jeder Verbindung vorhanden ist. Hier sind die Chromatogramme für die Pflanzenlinien, die Patricia uns gerade gezeigt hat. Beachten Sie, wie die Linie „lacks“ die primären Alkohole und Ester nicht enthält, während die Linie „ma one“ sekundäre Alkohole und Ketone fehlen.Diese Phänotypen können uns viel über die Funktion des interessierenden Gens in der Pflanze verraten. Beispielsweise zeigte uns der Phänotyp bereits vor der Identifizierung des mutierten Gens in der pho-Linie, dass ein Problem im Bereich des primären Alkohols im biosynthetischen Weg vorlag. Nachdem die molekulare Identität dieses Gens im consta-Labor untersucht worden war, stellte sich heraus, dass es Teil einer Genfamilie von Fettsäurereduktasen ist, was gut zu diesem chemischen Phänotyp passt.Wir können diese Gene nun in den Weg einordnen, der zeigt, wie die Pflanze diese Wachskomponente herstellt. Gut, so analysieren wir die chemische Zusammensetzung unserer Cuticula-Mutanten. Nun wird uns Alan zeigen, wie wir die Struktur der Cuticula mittels Rasterelektronenmikroskopie untersuchen. Vielen Dank.Ow. Möchte jemand ein paar schöne Bilder der Cuticula sehen? Legen wir los. Wenn wir die Rapid opsys sine-Mutanten mit bloßem Auge untersuchen, können wir erkennen, dass sie ein dunkelgrünes, glänzendes Phänotyp aufweisen.Wenn wir Wildtyp-Pflanzen untersuchen, können wir ein weißliches Aussehen des Stängels erkennen, um die Grundlage dieser Phänotypen zu bestimmen, die wir mit bloßem Auge sehen können. Das Rasterelektronenmikroskop wird verwendet, um die Cuticula-Struktur an der Oberfläche der Pflanze zu untersuchen. Da wir die chemische Zusammensetzung des Wachses aus der Gaschromatographie kennen, können wir sehen, wie die Chemie mit der Struktur der Wachskristalle zusammenhängt.Diese Kristalle sind das Erste, was ein Insekt oder ein Pathogen beim Landen auf der Stammoberfläche trifft. Daher sind sie ein wichtiger Bestandteil der Cuticula-Algen. Bei der Durchführung von Kryo-REM müssen Pflanzen eingefroren werden.Bei der Betrachtung werden Pflanzen in flüssigem Stickstoff zwischen minus 150 und 100 Grad Celsius gehalten. Unter dem Mikroskop sind extrem niedrige Temperaturen unerlässlich, um die Zellen intakt zu halten, da das REM ein Vakuum zur Funktion benötigt und die Proben andernfalls austrocknen und kollabieren würden. Nun sind wir bereit, die Proben von surfer vier und mah eins zusammen mit den Wildtyp-Kontrollen zu präparieren.Zuerst entfernte ich die Blüten und CLICs von diesen Pflanzen und schnitt anschließend entwicklungsstadiumsgleiche Stängelabschnitte von dem Wildtyp und den Mutanten aus. Danach montiere ich sie auf die SEM-Stufe. Wenn die Proben auf die kalte Stufe des Mikroskops übertragen und visualisiert werden, kann man erkennen, dass die Oberfläche des Cuticula-Stammes des wilden Hyper-avidosys mit Kristallen bedeckt ist.Das Licht dieser Kristalle verleiht dem Stängel sein weißliches Aussehen. Erinnern Sie sich nun daran, wie der Stängel bei den Mutanten glänzend wirkte. In den REM-Aufnahmen ist erkennbar, dass die Kristalle auf der Oberfläche fehlen.Woraus bestehen diese Kristalle also und was verleiht ihnen ihre merkwürdigen Formen? Die Antwort ist unterschiedlich. Verschiedene chemische Bestandteile des Wachses führen zu unterschiedlichen Kristallformen.Bei Experimenten, bei denen eine einzelne reine Wachskomponente aus der Kutikula einer Pflanze isoliert und erneut kristallisiert wurde, bilden die Kristalle dieselben Formen wie die auf den Pflanzen vorkommenden. Bei der Kaninchen-Opsis gehen wir davon aus, dass die Kristalle aus einer Mischung von Verbindungen bestehen und die Situation weitaus komplizierter ist. Beispielsweise zeigt die chemische Analyse mittels MEO, dass in surf vier lediglich die minoritäre Komponente primärer Alkohole und ihrer derivatisierten Ester fehlt.Trotzdem sind die Kristalle auf den Stielen der surf vier-Pflanzen verschwunden. Im Fall von M1 bewirkt die Mutation im Cytochrom-P450-Enzym, dass die mutierten Pflanzen zwei Hauptbestandteile des Wachses, sekundäre Alkohole und Ketone, fehlen. Dennoch bilden sich die Kristalle auf den MAH1-Pflanzen normal aus.Sie sehen also das Fehlen von lichtstreuenden Kristallen, die die SRA-Mutanten charakterisieren. Ihr glänzendes Phänotyp ist stets positiv mit einer Veränderung der Cuticula-Zusammensetzung korreliert. Ein Mutant wie mah1 hätte jedoch niemals mit diesem Ansatz gefunden werden können, da seine Kristalle normal sind, trotz der Veränderungen im chemischen Phänotyp, wie sie durch Gaschromatographie aufgezeigt wurden.Daher sind auch Reverse-Genetik-Ansätze erforderlich, um Cuticula-Gene aus bekannten Genfamilien zu identifizieren. Wir haben gerade gezeigt, dass sowohl die Forward- als auch die Reverse-Genetik es uns ermöglichen, rub dous-Cuticula-Mutanten zu identifizieren. Die chemische Analyse des Mutantenphänotyps mittels Gaschromatographie hat uns geholfen zu verstehen, wie die Pflanzen die schützenden Cuticula-Lipide herstellen. Kryo-REM hat uns gezeigt, wie sich die Kristalle auf der Oberfläche der Pflanze verändern, wenn sich die Chemie der Cuticula verändert.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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