Verwendung von Arabidopsis-Mutanten zu eceriferum Kutikula Biosynthese entdecken

Die pflanzliche Kutikula ist eine wachsartige Außenhülle von Pflanzen, die eine primäre Rolle bei der Wasserkonservierung spielt, aber auch eine wichtige Barriere gegen das Eindringen pathogener Mikroorganismen darstellt. Die Kutikula besteht aus einem zähen Vernetzungspolymer namens Cutin und einer schützenden Wachsschicht, die die Oberfläche der Pflanze versiegelt. Die wachsartige Schicht der Kutikula ist bei vielen Pflanzen sichtbar und erscheint als glänzender Film auf dem Efeublatt oder als staubige äußere Hülle auf der Oberfläche einer Traube oder eines Kohlblattes.

Dank der Lichtstreuung sind im Wachs Kristalle vorhanden, da die Kutikula eine wesentliche Anpassung der Pflanzen an eine terrestrische Umgebung darstellt. Das Verständnis, dass Gene, die an der Bildung der Nagelhaut von Pflanzen beteiligt sind, sowohl in der Land- als auch in der Forstwirtschaft Anwendung finden. Heute zeigen wir die Analyse von pflanzlichen Kutikula MUS, die durch Vorwärts- und Rückwärtsgenetik identifiziert wurden.

Hallo, mein Name ist Patricia Lam aus dem Labor von Lyrica Kunz in der Abteilung für Bot an der UVC. Heute werden ich und andere Ihnen zeigen, wie diese Pflanzen untersucht werden können, um zu verstehen, wie Pflanzen bestimmtes Wachs herstellen. Ich bin Meen vom Labor von Brain Heart Jet an der UVC und zeige Ihnen, wie wir die chemische Zusammensetzung von Nagelhautwachs mit Hilfe der Gaschromatographie analysieren.

Und ich bin Alan Dub Bono aus dem Labor von Lacey Samuels, ebenfalls an der UBC, und ich zeige Ihnen, wie wir die Kristallstruktur auf der Oberfläche der Opsis mit Hilfe der Kryo-Rasterelektronenmikroskopie analysieren. Unser übergeordnetes Ziel ist es, zu verstehen, wie Pflanzen gewöhnliche Fettsäuren von 16 oder 18 Kohlenstoffatomen zu sehr langen Ketten von 26 bis 34 Kohlenstoffatomen erweitern. Dann modifizieren Sie sie in schützende Lipide, die wir an der Pflanzenoberfläche finden.

Fangen wir also an und ich zeige Ihnen, wie wir bestimmte Wachsmittel mit Hilfe von genetischen Vorwärts- und Rückwärtsansätzen identifizieren. Hallo nochmal. Hier haben wir also eine Cut-Mutante von rapid opis, die wir sro nennen, was bedeutet, dass sie kein Wachs trägt.

Visuelle Bildschirme wurden verwendet, um diese Mutanten OCI zu isolieren, was bedeutet, dass sie durch Sehen identifiziert wurden. Wenn man sich die Mutanten ansieht, kann man sehen, dass der Zufluss und die Stängel der Brunnenpflanzen weißlich sind, während die Mutanten dunkelgrün glänzende Stängel haben. Eine der Mutanten, die in dieser Art von visuellem Bildschirm von Martin K und seinen Mitarbeitern isoliert wurde, ist dieser, der als "Ist von vier" oder "SIR vier" bezeichnet wird.

Eine andere Möglichkeit, Cuco-Mutanten zu entdecken, ist ein umgekehrter genetischer Ansatz, bei dem Kandidatengene ausgewählt und dann PLA-Linien mit diesen Genen untersucht werden, die in diesen Mutanten gestört sind. TD NA ist ein übertragenes DNA-Segment, das durch den Kot von Agrobacterium-Tumoren in der Natur in die Pflanze eingefügt wird. Dieses Bakterium infiziert TNA als Teil seines Infektionsprozesses, aber Wissenschaftler haben das Bakterium entwaffnet, so dass es nicht pathogen wird und als Werkzeug zur Übertragung von DNA in Pflanzen verwendet wird.

In diesem Fall unserer Studie der Nagelhaut haben wir die TDNA verwendet, um das Gen für ein Cytochrom P vier 50-Enzym zu stören, das wir jetzt M1.In Um zu bestätigen, dass unsere TDA-Insertion das M1-Gen gestört hat, führen wir eine PCR durch. Das hier gezeigte PCR-Gel bestätigt, dass die TDA-Insertion im interessierenden Gen liegt. Wenn zwei genspezifische Primer verwendet werden, um DNA vom Well-Typ zu amplifizieren, sehen wir ein Produkt, das von der Bande in dieser Spur gezeigt wird, aber die TD unterbricht es wie in der Mutante.

Es gibt kein Produkt, das umgekehrt einen Primer verwendet, der spezifisch für die TDNA und das Gen ist. Ein Produkt ist nur in der Mutante zu sehen. In der Regel suchen wir nach homozygoten Mutantenlinien, bei denen sowohl die mütterliche als auch die väterliche Kopie des Gens gestört sind.

Wenn jedoch eine Kopie des Gens durch die TDNA gestört ist und die andere Kopie noch vom Well-Typ ist, werden die PCR-R-Ergebnisse auf diese Weise gemischt. Nachdem ich Ihnen nun gezeigt habe, wie Sie die Nagelhautmutante surf vier ml bei mir identifizieren können, zeige ich Ihnen, wie Sie die chemische Zusammensetzung mit Hilfe der Gaschromatographie identifizieren können. Danke Patricia.

In Ordnung, lassen Sie uns die Nagelhaut analysieren I Bevor Sie die Gaschromatographie durchführen. Die löslichen Wachsverbindungen müssen von der Pflanzenoberfläche entfernt werden, indem sie in Chloroform vertieft werden. Chloroform entfernt das lösliche Wachs, aber auch Cutin vollständig aus der Pflanze.

Nach der Solubilisierung der Wachskomponenten wird das Chloroform-Wachsgemisch in die Gaschromatographiesäule injiziert, wo es mit einem Gasstrom erhitzt und durchleuchtet wird. Verschiedene Verbindungen aus der Wachsmischung haften mehr oder weniger an den Wänden der Säule, die die Verbindungen trennt, und sie kommen nacheinander am anderen Ende der Säule heraus. Wenn die Verbindungen dann den Flammenionisationsdetektor passieren, sehen wir die Spitzen.

Die Retentionszeit jedes Peaks ist charakteristisch für verschiedene Verbindungen und mittels Massenspektrometrie. Wir haben jeden der Bestandteile des ADOS Wachses identifiziert. Wenn wir uns das Chromatogramm für eine Wildtyp-Pflanze ansehen, können wir die Hauptpeaks sehen, die einem 29-Kohlenstoff-Streuketten-LK-Keon in sekundärem Alkohol entsprechen.

Die kleinen Peaks sind die primären Alkohole außerhalb der Höhen, und da die Fläche unter den Peaks relativ zum Standard uns sagt, wie viel von jeder Verbindung vorhanden ist. Hier sind die Chromatogramme für die Pflanzenlinien, die Patricia uns gerade gezeigt hat. Beachten Sie, dass die primären Alkohole und Ester fehlen, während die ersten sekundären Alkohole und Ketone fehlen.

Diese Phänotypen können uns viel über die Funktion des Gens von Interesse in der Pflanze verraten. Bevor wir zum Beispiel wussten, welches Gen in der Pho-Linie mutiert war, sagte uns der Phänotyp, dass es ein Problem im primären Alkoholzweig des Biosynthesewegs gab. Nachdem die molekulare Identität dieses Gens im Consta-Labor untersucht wurde, wurde entdeckt, dass es Teil der Genfamilie der Fettsäurereduktasen ist, was gut zu diesem chemischen Phänotyp passt.

Wir können diese Gene nun auf dem Weg platzieren, der zeigt, wie die Pflanze diesen Bestandteil des Wachses herstellt. Okay, so analysieren wir die chemische Zusammensetzung unserer Nagelhautmutanten. Nun zeigt uns Alan, wie wir die Struktur der Nagelhaut mit Hilfe der Raster-Elektromikroskopie untersuchen. Danke.

Möchte jemand ein paar hübsche Bilder von der Nagelhaut sehen? Lasst uns an die Arbeit gehen. Wenn wir die Rapid opsys Sinus-Mutanten mit dem Auge untersuchen, können wir sehen, dass sie einen dunkelgrünen, glänzenden Phänotyp haben.

Wenn wir Wildtyp-Pflanzen untersuchen, können wir ein weißliches Aussehen am Stängel sehen, um die Grundlage dieser Phänotypen zu bestimmen, die wir mit bloßem Auge sehen können. Mit dem Rasterelektronenmikroskop wird die Kutikulastruktur auf der Oberfläche der Pflanze betrachtet. Da wir die chemische Zusammensetzung des Wachses aus der Gaschromatographie kennen, können wir sehen, wie die Chemie mit der Struktur der Wachskristalle zusammenhängt.

Diese Kristalle sind das erste, was ein Insekt oder ein Krankheitserreger auf der Stängeloberfläche antrifft. Sie sind also ein wichtiger Bestandteil der Nagelhautalgen. Bei der Durchführung von Kryo-REM müssen die Pflanzen eingefroren werden.

Bei flüssigem Stickstoff werden Pflanzen während der Betrachtung zwischen minus 150 und 100 Grad Celsius gehalten. Im Rahmen des Zielfernrohrs sind extrem niedrige Temperaturen unerlässlich, um die Zellen intakt zu halten, da das REM ein Vakuum benötigt, um zu funktionieren, und wenn es nicht gefroren wäre, würden die Proben austrocknen und kollabieren. Jetzt sind wir bereit, die Samples von Surfer Four und Mah One zusammen mit den Wildtype-Steuerelementen zu analysieren.

Ich habe zuerst die Blüten und CLICs von diesen Pflanzen entfernt und dann entwicklungsangepasste Stängelsegmente aus dem Wildtyp und den Mutanten herausgeschnitten. Dann montiere ich sie auf die REM-Stufe. Wenn die Proben in den kalten Tisch des Mikroskops überführt und sichtbar gemacht werden, kann man sehen, dass die Oberfläche der wilden Kutikula des Hyper-Avid-Opsis-Stammes mit Kristallen bedeckt ist.

Das Licht dieser Kristalle verleiht dem Stiel sein weißliches Aussehen. Erinnert euch nun daran, wie der Stiel auf den Mutanten glänzend aussah. Auf den REM-Bildern ist zu sehen, dass ihm die Kristalle auf der Oberfläche fehlen.

Woraus bestehen diese Kristalle und was gibt ihnen ihre seltsamen Formen? Die Antwort ist eine andere. Chemische Bestandteile von Wachs ergeben unterschiedliche Formen von Kristallen.

In Experimenten, in denen eine einzige reine Wachsverbindung aus der Kutikula einer Pflanze isoliert und wieder kristallisiert wurde, bilden die Kristalle die gleichen Formen wie auf den Pflanzen. Bei der Kaninchen-Opsis glauben wir, dass die Kristalle aus einer Mischung von Verbindungen bestehen und die Situation viel komplizierter ist. So zeigt die chemische Analyse von MEO, dass in Surf 4 nur die Nebenkomponente der primären Alkohole und ihrer derivativen Ester fehlt.

Doch die Kristalle auf dem Surf Four Stem sind verschwunden. Im Fall von M1 hat die Mutation im Cytochrom-P-Vier-50-Enzym zur Folge, dass den mutierten Pflanzen zwei Hauptbestandteile des Wachses fehlen, sekundäre Alkohole und Ketone. Dennoch bilden sich die Kristalle auf der MAH eins-Pflanze normal.

Sie sehen also das Fehlen von lichtstreuenden Kristallen, was die SRA-Mutanten ergibt. Ihr glänzender Phänotyp korreliert immer positiv mit einer Veränderung der Nagelhautzusammensetzung. Eine Mutante wie mah one wäre mit diesem Ansatz jedoch nie gefunden worden, da ihre Kristalle trotz der Veränderungen im chemischen Phänotyp, wie die Gaschromatographie zeigt, normal sind.

Daher sind auch reverse-genetische Ansätze erforderlich, um Kutikulagene aus bekannten Genfamilien zu identifizieren. Wir haben gerade gezeigt, dass sowohl die Vorwärts- als auch die Rückwärtsgenetik es uns ermöglichen, Mutanten der Reibungskutikula zu identifizieren. Die chemische Analyse des Phänotyps der Mutanten mittels Gaschromatographie hat uns geholfen zu verstehen, wie die Pflanzen die schützenden Kutikulalipide herstellen. Kryo-REM hat uns gezeigt, wie sich die Kristalle auf der Oberfläche der Pflanze verändern, wenn sich die Chemie der Kutikula ändert.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.