Name: confocal microscopy for protein localization
Uploaded: 2023-04-30T07:08:35.000Z
Duration: 13 min 13 s
Channel: JoVE

التلوين الفلوري متحد البؤر هو إجراء بسيط نسبيا ينتج عنه صور عالية الجودة للغاية للعينات التي يتم تحضيرها بطريقة مماثلة للفحص المجهري الفلوري التقليدي. باختصار ، يتم إصلاح العينات ، واختراقها ، ثم حظرها. يسمح للأجسام المضادة الأولية ضد البروتين أو البروتينات ذات الأهمية بالارتباط ، ثم يتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور لتصور التلوين. الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر له تطبيقات في العديد من مجالات البحث. على سبيل المثال ، من خلال تلطيخ علامات العضيات دون الخلوية جنبا إلى جنب مع البروتين ذي الأهمية ،...

الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر: تقنية لتحديد توطين البروتينات في الخلايا الليفية للفئران

Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

المصدر: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1 
 1 قسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة ، كلية الطب بجامعة ميريلاند ومركز مارلين وستيوارت جرينيباوم الشامل للسرطان ، بالتيمور ، ماريلاند 21201 
2 مركز الهندسة والتكنولوجيا الطبية الحيوية ، كلية الطب بجامعة ماريلاند ، بالتيمور ، ماريلاند 21201 
الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر هو تقنية تصوير تتيح زيادة الدقة البصرية مقارنة بالفحص المجهري التقليدي "واسع المجال". المجاهر متحدة البؤر قادرة على تحقيق دقة بصرية محسنة من خلال "المسح بالليزر" - عادة ما تكون مجموعة من المرايا التي يتم التحكم فيها بالجهد (الجلفانومتر أو مرايا "galvo") التي توجه إضاءة الليزر إلى كل بكسل من العينة في كل مرة. والأهم من ذلك ، أن المجاهر متحدة البؤر تحقق دقة محورية فائقة باستخدام ثقب لإزالة الضوء خارج التركيز البؤري المنشأ من المواقع غير الموجودة في المستوى z الذي يتم مسحه ضوئيا ، وبالتالي تمكين الكاشف من جمع البيانات من مستوى z محدد. نظرا لدقة z العالية التي يمكن تحقيقها في الفحص المجهري متحد البؤر ، من الممكن جمع الصور من سلسلة من المستويات z (تسمى أيضا z-stack) وإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد من خلال البرنامج. 
قبل مناقشة آلية المجهر متحد البؤر ، من المهم مراعاة كيفية تفاعل العينة مع الضوء. يتكون الضوء من فوتونات وحزم من الطاقة الكهرومغناطيسية. يمكن أن يتفاعل الفوتون الذي يصطدم بعينة بيولوجية مع الجزيئات التي تتكون منها العينة بإحدى الطرق الأربع: 1) الفوتون لا يتفاعل ويمر عبر العينة. 2) ينعكس الفوتون / مبعثر. 3) يمتص الجزيء الفوتون ويتم إطلاق الطاقة الممتصة كحرارة من خلال عمليات تعرف مجتمعة باسم الاضمحلال غير الإشعاعي ؛ و 4) يتم امتصاص الفوتون ثم يتم إعادة إصدار الطاقة بسرعة كفوتون ثانوي من خلال العملية المعروفة باسم التألق. يسمى الجزيء الذي يسمح هيكله بانبعاث التألق بالفلوروفور. تحتوي معظم العينات البيولوجية على فلوروفورات داخلية ضئيلة ؛ لذلك يجب استخدام الفلوروفورات الخارجية لتسليط الضوء على السمات ذات الأهمية في العينة. أثناء الفحص المجهري الفلوري ، تضيء العينة بضوء الطول الموجي المناسب لامتصاصه بواسطة الفلوروفور. عند امتصاص الفوتون ، يقال إن الفلوروفور "متحمس" ويشار إلى عملية الامتصاص باسم "الإثارة". عندما يتخلى الفلوروفور عن الطاقة على شكل فوتون ، تعرف العملية باسم "الانبعاث" ، ويسمى الفوتون المنبعث بالفلورة. 
يتم تركيز شعاع الضوء المستخدم لإثارة الفلوروفور بواسطة العدسة الموضوعية للمجهر ويتقارب عند "نقطة محورية" حيث يتم التركيز عليه إلى أقصى حد. بعد النقطة المحورية ، يتباعد الضوء مرة أخرى. يمكن تصور الحزم الداخلة والخارجة كزوج من المخاريط التي تلامس النقطة المحورية (انظر الشكل 1 ، اللوحة اليسرى). تفرض ظاهرة الحيود حدا على مدى إحكام تركيز شعاع الضوء - يركز الشعاع في الواقع على بقعة ذات حجم محدود. يحدد عاملان حجم البقعة البؤرية: 1) الطول الموجي للضوء ، و 2) قدرة العدسة الشيئية على جمع الضوء ، والتي تتميز بفتحة العدسة العددية . تمتد "البقعة" البؤرية ليس فقط في المستوى x-y ، ولكن أيضا في اتجاه z ، وهي في الواقع حجم بؤري. تحدد أبعاد هذا الحجم البؤري الحد الأقصى للدقة التي يمكن تحقيقها عن طريق التصوير البصري. على الرغم من أن عدد الفوتونات أكبر داخل الحجم البؤري ، إلا أن مسارات الضوء المخروطية أعلى وأسفل التركيز تحتوي أيضا على كثافة أقل من الفوتونات. وبالتالي يمكن إثارة أي فلوروفور في مسار الضوء. في الفحص المجهري التقليدي (واسع المجال) ، يساهم الانبعاث من الفلوروفورات أعلى وأسفل المستوى البؤري في التألق خارج نطاق التركيز ("خلفية ضبابية") ، مما يقلل من دقة الصورة والتباين ، كما هو موضح في الشكل 1 ، حيث يمثل المكعب الأحمر انبعاث الفلوروفور فوق المستوى البؤري (النجم الأحمر) الذي ينتج عنه مضان خارج نطاق التركيز (أعلى اليمين). يتم تحسين هذه المشكلة في الفحص المجهري متحد البؤر ، بسبب استخدام الثقب. (الشكل 2 ، أسفل اليمين). كما هو موضح في الشكل 3 ، يسمح الثقب للانبعاثات الناشئة عن المكان البؤري بالوصول إلى الكاشف (يسار) ، مع منع التألق خارج التركيز (يمين) من الوصول إلى الكاشف ، وبالتالي تحسين كل من الدقة والتباين. 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig1.jpg"> 
الشكل 1. الدقة البصرية للتألق مقابل الفحص المجهري متحد البؤر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. </a>
يتم تركيز شعاع الضوء المستخدم لإثارة الفلوروفور بواسطة العدسة الموضوعية للمجهر ويتقارب عند حجم بؤري ثم يتباعد (يسار). يمثل النجم الأحمر المستوى البؤري للعينة التي يتم تصويرها بينما يمثل المربع الأحمر انبعاث الفلوروفور فوق المستوى البؤري. عند التقاط صورة لهذه العينة باستخدام مجهر epifluorescent ، فإن الانبعاث من المربع الأحمر خارج نطاق التركيز سيكون مرئيا ويساهم في "خلفية ضبابية" (أعلى اليمين). تحتوي المجاهر متحدة البؤر على ثقب يمنع اكتشاف الضوء المنبعث خارج المستوى البؤري ، مما يلغي "الخلفية الضبابية" (أسفل اليمين). 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig2.jpg"> 
الشكل 2. تأثير الثقب في الفحص المجهري متحد البؤر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. </a>
على الرغم من أن أعلى شدة لضوء الإثارة تكون عند النقطة المحورية للعدسة (يسار ، بيضاوي أحمر) ، فإن أجزاء أخرى من العينة ليست في النقطة المحورية (اليمين ، النجم الأحمر) ستحصل على الضوء والفلور. لمنع الضوء المنبعث من هذه المناطق الخارجة عن التركيز البؤري من الوصول إلى الكاشف ، توجد شاشة بها ثقب أمام الكاشف. فقط الضوء في التركيز (على اليسار) المنبعث من المستوى البؤري قادر على السفر عبر الثقب والوصول إلى الكاشف. يتم حظر الضوء خارج التركيز البؤري (على اليمين) بالثقب ويفشل في الوصول إلى الكاشف. 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig3.jpg"> 
الشكل 3. المكونات الرئيسية لمجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. </a>
من أجل البساطة ، سيقتصر الوصف الميكانيكي للمجهر متحد البؤر على وصف نيكون Eclipse T i A1R. على الرغم من أنه قد تكون هناك اختلافات تقنية طفيفة بين المجاهر متحدة البؤر المختلفة ، إلا أن A1R يعمل بشكل جيد كنموذج جيد لوصف وظيفة المجهر متحد البؤر. ينعكس شعاع ضوء الإثارة ، الذي تنتجه مجموعة من ليزر الصمام الثنائي ، بواسطة المرآة الأساسية ثنائية اللون في الهدف ، والتي تركز الضوء على العينة التي يتم تصويرها. تعكس المرآة الأساسية ثنائية اللون بشكل انتقائي ضوء الإثارة مع السماح للضوء بأطوال موجية أخرى بالمرور من خلاله. ثم يواجه الضوء مرايا المسح الضوئي التي تكتسح شعاع الضوء عبر العينة بطريقة x-y ، وتضيء بكسل واحد ( x,y) بكسل واحد في كل مرة. يتم جمع التألق المنبعث من الفلوروفورات عند البكسل المضيء بواسطة العدسة الموضوعية ويمر عبر المرآة ثنائية اللون الأولية للوصول إلى مجموعة من أنابيب المضاعف الضوئي (PMTs). توجه المرايا ثنائية اللون الثانوية ضوء الانبعاث إلى PMT المناسب. ينعكس ضوء الإثارة الذي تنتشر بواسطة العينة مرة أخرى في الهدف بواسطة المرآة ثنائية اللون الأولية مرة أخرى نحو العينة ، وبالتالي يمنع من دخول مسار ضوء الكشف والوصول إلى PMTs (انظر الشكل 3). يسمح ذلك بقياس التألق الضعيف نسبيا دون تلوث بالضوء المنتشر من شعاع ضوء الإثارة ، والذي عادة ما يكون أكثر كثافة من التألق. نظرا لأن الثقب يحجب الضوء من خارج الحجم البؤري ، فإن الضوء الذي يصل إلى الكاشف يأتي من مستوى z ضيق ومحدد. لذلك ، يمكن جمع الصور من سلسلة من المستويات z المجاورة. غالبا ما يشار إلى هذه السلسلة من الصور باسم "z-stack". باستخدام البرنامج المناسب ، يمكن معالجة z-stack لإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد للعينة. ميزة خاصة للفحص المجهري متحد البؤر هي القدرة على التمييز بين التوطين تحت الخلوي للتلطيخ. على سبيل المثال ، التمايز بين تلطيخ الغشاء من التلوين داخل الخلايا ، وهو أمر يمثل تحديا كبيرا مع الفحص المجهري التقليدي للتألق (1 ، 2 ، 3). 
يعد تحضير العينة جانبا مهما من جوانب التصوير متحد البؤر. تتمثل قوة تقنيات الفحص المجهري البصري في المرونة في تصوير الخلايا الحية أو الثابتة. عند محاولة إنتاج صور ثلاثية الأبعاد ، نظرا لعدد الصور التي يجب الحصول عليها من أجل مكدس z ، وصعوبة الحفاظ على صحة الخلية ، وحركة الخلايا الحية وعضياتها ، فإن استخدام الخلايا الثابتة أمر نموذجي. يشبه إجراء تثبيت الخلايا وتلطيخها للتألق متحد البؤر ذلك المستخدم تقليديا في التألق المناعي. بعد الزراعة في شرائح الغرفة أو على أغطية ، يتم إصلاح الخلايا باستخدام بارافورمالدهيد للحفاظ على التشكل الخلوي. يتم حظر ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة باستخدام ألبومين مصل الأبقار أو الحليب أو المصل العادي. من أجل الحفاظ على خصوصية الأجسام المضادة الثانوية ، يجب ألا ينشأ المحلول المستخدم من نفس النوع الذي تم فيه إنشاء الأجسام المضادة الأولية. يتم تحضين الخلايا بأجسام مضادة أولية تربط المستضد محل الاهتمام. عند وضع علامات على العديد من الأهداف الخلوية ، يجب اشتقاق كل من الأجسام المضادة الأولية من نوع مختلف. ثم ترتبط الأجسام المضادة التي تضع علامة على مستضد بأجسام مضادة ثانوية مترافقة بالفلوروفور. يجب اختيار الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور بحيث تكون متوافقة مع الأطوال الموجية للإثارة بالليزر المتوفرة في المجهر متحد البؤر. عند تصور مستضدات متعددة ، يجب أن تختلف أطياف الإثارة / الانبعاث للفلوروفورات بدرجة كافية بحيث يمكن تمييز إشاراتها عن طريق التحليل المجهري. ثم يتم تثبيت العينة الملطخة على شريحة للتصوير. يتم استخدام وسيط التركيب لمنع التبييض الضوئي وتجفيف العينات. إذا رغبت في ذلك ، يمكن استخدام وسيط تركيب يحتوي على صبغة نووية مضادة (مثل DAPI أو Hoechst) (4). 
في البروتوكول التالي ، تم تلطيخ الخلايا الليفية الفئرانية المنقولة للتعبير عن CD1d (LCD1) بالأجسام المضادة التي تتعرف على CD1d و CD107a (LAMP-1). CD1d هو مستقبل رئيسي يشبه مركب التوافق النسيجي 1 (معقد التوافق النسيجي الكبير 1) موجود على سطح الخلايا العارضة للمستضد الذي يقدم مستضدات دهونية. LAMP-1 (بروتين الغشاء المرتبط بالليزوزومات -1) هو بروتين عبر الغشاء موجود بشكل أساسي في الأغشية الليزوزومية. من أجل عرض المستضد المناسب ، يتم نقل CD1d من خلال الحجرة الليزوزومية ذات الأس الهيدروجيني المنخفض ، لذلك يتم استخدام LAMP-1 كعلامة على الحجرة الليزوزومية لهذا البروتوكول. من خلال فحص خلايا LCD1 مع anti-CD1d و anti- LAMP-1 التي تم إنتاجها في أنواع مختلفة ، يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية ذات الفلوروفورات الفريدة لتحديد توطين كل بروتين في الخلية وما إذا كان CD1d موجودا في مقصورات الليزوزومات الإيجابية LAMP-1.

في هذه التجربة ، تم إصلاح الخلايا الليفية للفأر التي تعبر عن جين البروتين السكري السطحي CD1d ، وتلبغها المناعي وتصويرها على مجهر متحد البؤر. تظهر الصورة التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام البروتوكول أعلاه في الشكل 4. في اللوحة العلوية من A ، يتم عرض صور أحادية القناة توضح نمط التلوين لكل هدف على حدة. تشتمل هذه الصور على قسم واحد (شريحة) من z-stack التي تم التقاطها. تظهر اللوحة اليمنى تلطيخ DAPI لنوى الخلايا. تظهر الألواح المركزية CD1d ملطخا باللون الأحمر و LAMP-1 ، وهي علامة ليزوزومي...

Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine ...

الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر هو تقنية تصوير متخصصة لتوطين بروتين أو مستضد محل اهتمام في عينة خلية أو أنسجة عن طريق تسمية المستضد بصبغة فلورية مترافقة بالأجسام المضادة واكتشاف إشارة الفلورسنت. إنه يوفر دقة مكانية أعلى من الفحص المجهري الفلوري واسع المجال ، بمساعدة فتحتين موضوعتين في المستوى البؤري للعدسة الشيئية ، مما يمنحها الاسم الكونفوكيالي. إنه يمكن المستخدمين من تصور التلوين على المستوى تحت الخلوي ، مثل التمايز بين تلطيخ الغشاء السطحي من التلوين داخل الخلايا. يتبع المجهر متحد البؤر مبدأ أساسيا مشابها للمجهر الفلوري الكلاسيكي. ينعكس الشعاع من مصدر الضوء ، وعادة ما يكون ليزر للكونفوكال ، بواسطة مرآة ثنائية اللون ويركز بواسطة عدسة موضوعية على العينة. يثير هذا الضوء الفلوروفورات لتنبعث منها طول موجي مختلف ، والذي ينتقل مرة أخرى عبر العدسة الموضوعية والمرآة ثنائية اللون إلى الكاميرا أو العدسة. ترجع الدقة المحسنة للمجهر متحد البؤر بشكل أساسي إلى وجود فتحتين ، وهما فتحات صغيرة جدا لمرور الضوء على مسارات ضوء الإثارة والانبعاث. يتم وضع الثقوب بشكل استراتيجي في المستوى البؤري للعدسة الشيئية. الآن ، دعنا ننتقل إلى مخطط العرض الجانبي لترتيب المجهر لمراجعة مسار الضوء. بعد المرور عبر ثقب الإثارة ، يكون لشعاع ضوء الإثارة تأثير النشأة من نقطة محورية ، مما يمكن العدسة الموضوعية من تركيز الضوء بعد ذلك على نقطة على العينة أيضا. تتلاقى حزمة الانبعاث من هذه النقطة المحورية عند ثقب الانبعاث ، مما يسمح لها بالمرور. الآن أثناء الإثارة ، تكون الفلوروفورات داخل مسار الضوء ، أعلى وأسفل النقطة المحورية ، متحمسة قليلا أيضا. بينما يمر ضوء الانبعاث الناشئ من النقطة المحورية عبر الثقب ، تتلاقى الانبعاثات من النقاط الخارجة عن التركيز قبل أو بعد ثقب الانبعاث ، وبالتالي يتم حظرها ، مما يؤدي إلى تقليل تألق الخلفية. يجب تكرار دورة اكتشاف الإثارة والانبعاثات لكل نقطة تصوير في المنطقة محل الاهتمام ، والتي يمكن إجراؤها بعدة طرق مختلفة. على سبيل المثال ، يستخدم المسح بالليزر متحد البؤر مرايا مسح الجلفانومتر ، والتي تحرف ضوء الإثارة بزوايا مختلفة. ومن ثم ، كنس شعاع الضوء عبر العينة في المستوى XY. يستخدم قرص الغزل متحد البؤر قرصا به مجموعة من الثقوب ، والتي تدور لتغيير ترتيب الثقوب. يتيح ذلك للمستخدمين إضاءة نقاط تصوير صغيرة متعددة في العينة في كل مرة ، وتغطية المنطقة بأكملها تدريجيا أثناء دوران القرص. نتيجة للثقوب ، تمثل صورة XY في الكاشف مستوى Z ضيقا. لذلك ، يمكن جمع الصور من سلسلة من مستويات Z المتتالية ، والتي يشار إليها غالبا باسم مكدس Z. من هذه الصور ، يمكن للبرنامج المناسب إنشاء تصوير ثلاثي الأبعاد لنمط إشارة التألق في العينة. في هذا البروتوكول ، ستلاحظ تلغينا مناعيا للأرومات الليفية للفأر ، متبوعا بالتصوير على مجهر متحد البؤر لتصور بروتين سطح الخلية والبروتين الليزوزومي بشكل تفاضلي. للبدء ، باستخدام تقنيات معقمة ، قم بتعليق الخلايا ذات الأهمية في 500 ميكرولتر من وسائط النمو لكل بئر ، ثم قم بزرعها في آبار شريحة غرفة من أربعة آبار. هنا ، نستخدم الخلايا الليفية للفئران التي تم نقلها للتعبير عن الجزيء المقدم للمستضد ، CD1d. للسماح للخلايا بالالتصاق بالزجاج ، ضع شريحة الغرفة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية ، واحتضانها طوال الليل. في الصباح ، قم بشفط الوسائط من كل بئر ، ثم اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 500 ميكرولتر من PBS لبضع ثوان. لإصلاح الخلايا ، أضف 500 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهيد بنسبة 1٪ في كل بئر ، واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اجمع بارافورمالدهيد في حاوية نفايات سائلة خطرة مناسبة ، ثم قم بإزالة أي بقايا من المثبت عن طريق غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لبضع ثوان. للسماح باختراق الأجسام المضادة في الخلايا ، أضف 500 ميكرولتر من مخزن النفاذية إلى كل بئر ، واحتضنه على المقعد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد النفاذية ، اغسل الخلايا لفترة وجيزة ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب إلى كل بئر ، واحتضنه لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة. تحضير الأجسام المضادة الأولية ، المضادة ل CD1d ومضادة ل LAMP-1 ، بتركيزات عمل مناسبة. بعد ذلك ، قم بشفط المخزن المؤقت من الآبار وقم بتغطية الخلايا في كل بئر ب 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية المخففة ثم احتضان الشريحة على سطح مستو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية ، في هذه الحالة جسم مضاد مضاد للفئران والفئران بعلامات فلورية مميزة ، في منع المخزن المؤقت لتركيزات العمل المناسبة. بعد ذلك ، قم بشفط محلول الجسم المضاد الأساسي من الآبار ثم اغسل الخلايا أربع مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS. ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية المخففة إلى كل بئر ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الظلام. بعد الحضانة ، قم بشفط محلول الجسم المضاد الثانوي واغسل الآبار أربع مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS لإزالة أي جسم مضاد ثانوي غير مرتبط. لتركيب العينات بعد الغسيل النهائي ، افصل الغرف بعناية وقم بإزالتها من الشريحة. لإزالة PBS المتبقي ، أمسك الشريحة بزاوية فوق مسح مهمة دقيقة ، وقم بإزالة السائل من الحواف دون لمس الخلايا. بمجرد إزالة PBS الزائد ، أضف قطرة واحدة من وسط التركيب المضاد للبهتان ، الذي يحتوي على البقعة النووية DAPI ، على كل قسم من الخلايا. بعد ذلك ، خذ غطاء مقاس 20 × 60 ملم ، وباستخدام أطراف الأصابع فقط ، ابدأ في خفض الغطاء ببطء على أي من الحافتين ، مع الحرص على تجنب تكوين الفقاعات فوق الخلايا. امسح أي وسيط تثبيت إضافي على الشرائح بمسح دقيق للمهمة وقم بتخزين الشرائح في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع. لبدء تصوير الخلايا ، انقر أولا على أيقونة برنامج NIS على سطح المكتب. بمجرد دخولك إلى نافذة التحكم ، انقر فوق علامة التبويب TiPad في الأعلى ، واختر الهدف المطلوب للتصوير. بعد ذلك ، قم بتحميل الشريحة بالخلايا على المسرح ، وقم بتوسيطها أسفل العدسة. بعد ذلك ، في علامة التبويب A1plus Compact GUI بجوار علامة التبويب TiPad ، قم بإعداد أشعة الليزر المناسبة للفلوروفورات المستخدمة. انقر فوق رمز الترس لفتح قائمة إعدادات الصبغة والطيف. بمجرد فتح قائمة إعدادات الصبغة والطيف ، حدد القنوات المطلوبة واضبط الليزر لكل قناة. ثم حدد الانبعاثات المناسبة في القائمة المنسدلة أسفل المرآة الأولى ثنائية اللون. بعد ذلك ، ضمن نافذة A1plus Compact GUI ، انقر فوق Ch.Series لإعداد سلسلة قنوات الخط ، والتي تحدد ما إذا كانت أشعة الليزر المستخدمة ستطلق على العينة في وقت واحد أو بالتتابع. بعد ذلك ، ابدأ المسح بالنقر فوق رمز طرف السهم في الأعلى. في هذه المرحلة ، أثناء تشغيل التصوير ، ضمن نافذة A1plus Compact GUI ، انقر فوق المقياس المنزلق ، وقم بتعديل حجم الثقب لضمان الحد من الضوء خارج نطاق التركيز البؤري. بعد ذلك ، اضبط إعدادات الجهد العالي والإزاحة تحت كل ليزر إلى المستويات المناسبة باستخدام المقاييس المنزلقة لتمكين اكتشاف تلطيخ محدد مع الحد من أي تلطيخ محتمل في الخلفية. إذا توفرت عينة تلطيخ إيجابية ، فابدأ بتصوير هذه العينة لكل قناة للتأكد من أن إعدادات الليزر تنتج نسب إشارة إلى ضوضاء مثالية. بعد تعيين قيم الجهد العالي والإزاحة المثلى لكل ليزر ، انقر فوق علامة التبويب اكتساب الكثافة المحايدة ، ثم حدد أيقونة Z لإعداد المعلمات للسلسلة z. بعد ذلك ، أثناء الحصول على صورة حية للعينة ، قم أولا بتعيين الجزء السفلي عن طريق العثور على الجزء السفلي من الصورة والنقر فوق الزر السفلي. ثم ابحث عن الموضع العلوي للعينة وانقر فوق الزر العلوي. قم بتعيين حجم الخطوة إما عن طريق كتابة حجم الخطوة المفضل بالميكرون لكل خطوة على وجه التحديد أو عن طريق تحديد عدد الخطوات الإجمالية المطلوبة. لتحديد الحجم / دقة البكسل المطلوبة للصورة ، انقر فوق نافذة واجهة المستخدم الرسومية Aiplus Compact ، وتحت رمز الحجم ، حدد الدقة المطلوبة. لتقليل تشويش الصورة ، يمكنك تحديد القائمة المنسدلة بجوار رمز ثيتا لمتوسط عدد الصور المحدد. بعد ذلك ، انقر فوق علامة التبويب تشغيل الآن في قائمة اكتساب ND لبدء تصوير العينة. بعد اكتمال التصوير ، احفظ الصورة بالنقر فوق ملف ، ثم احفظ باسم ، والذي سيؤدي إلى تصدير ملف الصورة بالامتداد dot-nd2. أخيرا ، كرر العملية لكل عينة من العينات الأخرى. في هذه التجربة ، تم إصلاح الخلايا الليفية للفأر التي تعبر عن جين البروتين السكري السطحي CD1d ، وصبغها المناعي ، وتصويرها على مجهر متحد البؤر. تظهر هذه الصورة قسما واحدا من مكدس Z بتكبير 40X، حيث يكون CD1d ملطخا باللون الأحمر. تم تلبيس العينة ب LAMP-1 ، وهي علامة ليزوزومية ، باللون الأخضر. تم استخدام البقعة النووية DAPI لإظهار نوى الخلايا. في صورة مركبة حيث يتم دمج القنوات الثلاث المختلفة ، ينتج ظهور اللون الأصفر عن تداخل القناتين الحمراء والخضراء ، ويشير إلى منطقة يتم فيها توطين CD1d و LAMP-1 في الجسيمات الحالة. تشير المناطق التي يوجد بها لون واحد فقط إلى وجود CD1d أو LAMP-1 بدون توطين مشترك. تعرض هذه الصورة عرضا ثلاثي الأبعاد للخلايا التي تم إنشاؤها من الصور الملتقطة في z-stack ومكنت هذه الطريقة من إنشاء عرض جانبي لهذه المجموعة من الخلايا. تظهر هذه الصورة التالية شريحة من المكدس z بتكبير 100X ، مما يوضح أنماط التعبير لهذين البروتينين بمزيد من التفصيل. يعرض المربع المخطط باللون الوردي على الجانب الأيمن من الصورة المقطع العرضي للإحداثيات x المحددة بالخط الوردي في الصورة ، والذي يمثل المنظر الجانبي عند الخط الوردي. وبالمثل ، يظهر المربع الأزرق المحدد في أسفل الصورة المقطع العرضي للإحداثي y المحدد بالخط الأزرق في الصورة ، والذي يمثل المنظر الأمامي عند الخط الأزرق. يتيح العرض ثلاثي الأبعاد لصورة z-stack للمستخدمين عرض الصورة في 3D ، وتصور جميع مستويات x و y و z. يمكن استخدام هذا لدراسة التوطين المشترك للبقع المختلفة في مناطق مختلفة داخل الخلية.

confocal-fluorescence-microscopy-technique-to-determine-localization

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

الأحياء المتقدمة

Immunology

علم المناعة

confocal microscopy for protein localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell.

The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a molecule that can fluoresce. Because most biological samples have very little natural fluorescence, researchers usually add fluorescent labels to highlight the structures they want to study.

A confocal microscope focuses light into a small focal volume, not just a single point in the x-y plane. The size of that volume depends on the wavelength of light and the numerical aperture, or NA, of the objective lens. Light above and below the focal plane can still excite fluorophores, but the pinhole removes most of the unwanted emission before it reaches the detector.

Compared with conventional epifluorescence microscopy, this design reduces the hazy background caused by out-of-focus fluorescence. The result is sharper images and better contrast. Confocal microscopy also allows collection of images from a series of z-planes, called a z-stack, which can be processed into a 3D image with software.

The microscope described in the protocol uses diode lasers, a primary dichroic mirror, scanning mirrors, and photomultiplier tubes, or PMTs. The dichroic mirror reflects the excitation light into the objective while letting other wavelengths pass through. The scanning mirrors move the beam across the sample one pixel at a time, and the PMTs detect the emitted fluorescence. The pinhole and optical path also help keep scattered excitation light out of the detector so the weaker fluorescence signal can be measured more clearly.

One major advantage of confocal imaging is that it can separate membrane staining from intracellular staining more clearly than wide-field methods. This is useful when studying where a protein is found inside a cell. It is especially helpful when a 3D view is needed from a z-stack.

Preparing the sample is an important part of the process. For 3D imaging, fixed cells are often used because live cells can move and are harder to keep healthy while many z-planes are collected. Cells are grown on chamber slides or coverslips, fixed with paraformaldehyde, and blocked with bovine serum albumin, milk, or normal serum to reduce nonspecific antibody binding. The blocking solution should not come from the same species used to make the primary antibodies.

Next, the cells are stained with primary antibodies that bind the target antigen. If several targets are being labeled, each primary antibody must come from a different species. Fluorophore-conjugated secondary antibodies then bind the primary antibodies. Their excitation and emission properties must match the lasers on the confocal microscope, and the fluorophores should be different enough that the signals can be separated. A mounting medium is used to protect the sample from photobleaching and drying, and it may include a nuclear counterstain such as DAPI or Hoechst.

In the protocol shown here, mouse fibroblasts were made to express CD1d and were stained for CD1d and CD107a, also called LAMP-1. CD1d is a major histocompatibility complex 1, or MHC 1, like receptor that presents lipid antigens on antigen-presenting cells. LAMP-1 is a transmembrane protein found mainly in lysosomal membranes and serves as a marker for the lysosomal compartment. Because CD1d must travel through this low-pH compartment for proper antigen presentation, confocal imaging can show whether CD1d is present in LAMP-1-positive lysosomes.

Confocal Microscopy for Protein Localization

confocal-microscopy-for-protein-localization

flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

flow-cytometry-fluorescence-activated-cell-sorting-facs-isolation

Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

magnetic-activated-cell-sorting-macs-isolation-of-thymic-t-lymphocytes

Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive

ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

elispot-assay-detection-of-ifn-secreting-splenocytes

ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

antibody-generation-producing-monoclonal-antibodies-using-hybridomas

Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

immunofluorescence-microscopy-immunofluorescence-staining-paraffin

Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

immunoprecipitation-based-techniques-purification-endogenous-proteins

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

cell-cycle-analysis-assessing-cd4-cd8-t-cell-proliferation-after

Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

adoptive-cell-transfer-introducing-donor-mouse-splenocytes-to-host

Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

assay-for-cell-death-chromium-release-assay-of-cytotoxic-ability

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

This collection covers many staple techniques of immunology labs, including the labeling and sorting of immune cells. It also demonstrates proliferation methods for immune cells and antibodies, as well as common assays for immune activity including ELISA. Finally, it demonstrates staining and imaging of immune tissue and cell samples.

See how confocal fluorescence microscopy uses lasers, a pinhole, and z-stacks to reveal protein location in mouse fibroblasts and other cells.

Confocal Microscopy for Protein Localization

Description

Transcript

Tags