Name: mapping mrna ends with race
Uploaded: 2023-04-30T07:10:52.000Z
Duration: 9 min 44 s
Channel: JoVE

1. إعداد التجربة ل 3 'RACE
<ol>
	<li>صمم برايمر محدد مقاس 5 بوصات للجين ذي الأهمية (التمهيدي الخاص بالجين 1 ، GSP-1). يجب أن يكون محددا للغاية ، لأنه التمهيدي الوحيد الذي يقدم الخصوصية. لذلك ، سيكون من الأفضل وجود برايمر طويل نسبيا (الطول النموذجي حوالي 24 نيوكليوتيد ، يتراوح Tm من 55-65 درجة مئوية). </li>
	<li>صمم برايمر ثان متداخلا (GSP-2) ، أي يجب أن يكون التمهيدي موجودا 3 بوصات من GSP-1. هذه الخطوة اختيارية ، لكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني باستخدام برايمر متداخل سيزيد من إنتاجية وخصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل للجين محل الاهتمام. يتم سرد البادئات المستخدمة لتضخيم dSmad2 cDNAs في الجدول 2.</li>
</ol>
2. تخليق (كدنا) 
<ol>
	<li>استخرج الحمض النووي الريبي من العينات باستخدام طريقة أو مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. عالج العينات باستخدام DNase لتجنب تضخيم الحمض النووي الجيني. في مثالنا ، استخرجنا الحمض النووي الريبي من 10 ذباب بالغ كامل.</li>
	<li>قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير الحجم واضبطه باستخدام الماء الخالي من RNase بحد أقصى 100 نانوغرام / ميكرولتر إذا لزم الأمر.</li>
	<li>قم بإعداد (كدنا) في تفاعل النسخ العكسي (RT) ، باستخدام مجموعة موصى بها ل RACE. قم بإعداد مزيج رئيسي ، مع الكواشف التالية لكل عينة: 
	- 4 ميكرولتر مخزن مؤقت للنسخ العكسي (5x) 
	- 2 ميكرولتر أوليغو (dT) 20 برايمر (أوليغو يتكون من 20 ديوكسي ثيميدين) 
	- 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (بحد أقصى 1 ميكروغرام) 
	- 3 ميكرولتر ddH2O 
	- 1 ميكرولتر من النسخ العكسي 
	- الإجمالي: 20 ميكرولتر</li>
	<li>احتضان التفاعل لمدة 90 دقيقة عند 42 درجة مئوية. قم بتضمين عنصر تحكم سلبي مع حذف النسخ العكسي.</li>
	<li>قم بإلغاء تنشيط النسخ العكسي عن طريق الحضانة عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>من أجل تخفيف مستويات الحمض النووي من أجل تفاعل البوليميراز المتسلسل الفعال ، أضف 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 ميكرولتر.</li>
</ol>
3. تضخيم شظايا (كدنا)
<ol>
	<li>قم بإعداد مزيج PCR للتضخيم في الجولة الأولى باستخدام بوليميراز Taq عالي الدقة (HF): 
	- 4 ميكرولتر 5x HF Taq polymerase buffer 
	- 0.4 ميكرولتر dNTP مزيج (10 ملي لكل منهما) 
	- 1 ميكرولتر GSP1 التمهيدي (10 ميكرومتر) 
	- 1 ميكرولتر أوليغو (dT) 20 برايمر (10 ميكرومتر) 
	- 1 ميكرولتر قالب cDNA 
	- 0.2 ميكرولتر HF Taq DNA polymerase 
	- 12.4 ميكرولتر ddH2O 
	- المجموع: 20 ميكرولتر</li>
	<li>قم بتشغيل PCR باستخدام برنامج PCR1 (الجدول 1). قم بتضمين عنصر تحكم سلبي باستخدام منتج الحمض النووي الريبي الأصلي كقالب بدون RT. علاوة على ذلك ، يمكن تضمين عنصر تحكم "بدون برايمر".</li>
	<li>اختياري: تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل لزيادة الخصوصية وكمية منتجات (كدنا). قم بتخفيف 1 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل والتحكم السلبي 1:20 في المخزن المؤقت TE. استخدمها كقالب لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الثانية: 
	- 4 ميكرولتر 5x HF Taq polymerase buffer 
	- 0.4 ميكرولتر dNTP مزيج (10 ملي لكل منهما) 
	- 1 ميكرولتر GSP2 التمهيدي (10 ميكرومتر) 
	- 1 ميكرولتر أوليغو (dT) 20 برايمر (10 ميكرومتر) 
	- 1 ميكرولتر قالب منتج PCR 
	- 0.2 ميكرولتر HF Taq DNA polymerase 
	- 12.4 ميكرولتر ddH2O 
	- المجموع: 20 ميكرولتر</li>
	<li>تشغيل PCR الثاني باستخدام برنامج PCR2 (الجدول 1)</li>
</ol>
4. عزل شظايا (كدنا)
<ol>
	<li>قم بإعداد جل الاغاروز بنسبة 1-2٪ مع محلول TAE ، باستخدام بروميد الإيثيديوم أو صبغة الحمض النووي البديلة. </li>
	<li>امزج 5 ميكرولتر من العينة مع 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل الهلام 6x.</li>
	<li>قم بتحميل العينات وسلم الحمض النووي 1 كيلو بايت كعلامة وقم بتشغيل الجل عند 120 فولت لمدة 45 دقيقة تقريبا أو حتى تصبح مقدمة الصبغة ~ 75٪ من الطريق إلى أسفل الجل. تأكد من عدم نفاد العينات من الجل.</li>
	<li>افحص العصابات الهلامية تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية. لمزيد من المعالجة للمنتجات ، استخدم الأشعة فوق البنفسجية منخفضة الكثافة ، وحدد موقع العصابات المضخمة واقطعها من الجل باستخدام مشرط.</li>
	<li>قم بتنقية الحمض النووي من الجل باستخدام طريقة مثل التجميد والضغط أو مجموعة.</li>
	<li>قم بتخزين شظايا (كدنا) المنقاة عند -20 درجة مئوية أو استخدمها على الفور لمزيد من التطبيقات ، مثل التسلسل أو الاستنساخ.</li>
</ol>
<div class = "chapter_text" id = "script_0" >
عادة ، مع mRNAs الجديدة ، لا يعرف سوى جزء من تسلسلها الكامل. يمكن تحديد تسلسلات النيوكليوتيدات المفقودة في نهايات الرنا المرسال باستخدام طريقة قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل تسمى التضخيم السريع لنهايات (كدنا) ، أو RACE.
في حقيقيات النوى ، تتمتع mRNAs الناضجة بسمات هيكلية مميزة في كلا الطرفين. في نهاية الخمسة أولية ، يحتوي معظمها على بقايا غوانوزين ميثيلية متصلة ب mRNA عبر ارتباط ثلاثي فوسفات من خمسة أوليات إلى خمسة رئيسيات. يعرف هذا أيضا باسم الحد الأقصى المكون من خمسة رئيسيات. في الطرف ثلاثي النوى ، تحتوي معظم حقيقيات النوى على ذيل من 20 إلى 250 بقايا أدينيلات ، تسمى ذيل بولي (أ).
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
الآن ، إذا كان تسلسل النيوكليوتيدات حتى لجزء صغير معروفا في أي مكان داخل mRNA ، فيمكن تضخيم التسلسل حتى نهايته ثلاثية الأعداد الأولية باستخدام برايمر خاص بالجين وأوليغو (dT) التمهيدي غير المحدد الذي يلدن إلى ذيل بولي (A) في الطرف ثلاثي الأوليات. تسمى هذه المجموعة الفرعية من تقنية RACE ثلاثية الأعداد الأولية RACE ، وتسمح باكتشاف متغيرات النسخ والمناطق غير المترجمة ثلاثية الرئيسيات المختلفة ، أو UTRs.
يمكن تضخيم التسلسل في النهاية الخماسية الأولية بالمثل. للقيام بذلك ، يتم إرفاق ذيل بولي (A) أولا في الطرف المكون من خمسة أولي. بعد ذلك ، باستخدام أوليغو (dT) التمهيدي غير المحدد الذي يلدن بالذيل الملحق وبرايمر خاص بالجين ، يمكن تضخيم التسلسل حتى النهاية الخمسة. تعرف هذه المجموعة الفرعية من RACE باسم RACE خماسي الأعداد الأولية وتستخدم للعثور على متغيرات لصق تفاضلية خماسية أولية و UTRs البديلة ذات الخمسة أولية.
لإجراء RACE ثلاثي الأعداد الأولية لتحديد النصوص المختلفة المشفرة بواسطة جين معين ، يتم عزل الحمض النووي الريبي أولا عن الكائن الحي أو الأنسجة ذات الأهمية. بعد ذلك ، يتم تصنيع (كدنا) من mRNAs المعزولة مع تفاعل نسخ عكسي يستخدم أوليغو (dT) التمهيدي وإنزيم النسخ العكسي ، والذي يولد الحمض النووي التكميلي من قالب الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، من مجموعة cDNA التي تم إنشاؤها ، يتم تمديد الطرف ثلاثي الأعداد الأولية غير المعروف ل cDNA المستهدف عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل ، باستخدام أوليغو (dT) التمهيدي غير المحدد وبرايمر خاص بالجين ، ويتم تضخيمه أثناء تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
ومع ذلك ، نظرا للطبيعة العامة للبرايمر غير المحدد والخطأ العشوائي بواسطة التمهيدي الخاص بالجين ، يمكن أن تلدين إلى cDNA غير المستهدف ، مما يؤدي إلى تضخيمها أيضا. للتغلب على هذه المشكلة ، يتم إجراء جولة ثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات متداخلة ، والتي تربط مجرى المجموعة الأولى من البادئات. تعمل هذه المجموعة الثانية من البادئات على تضخيم (كدنا) ذي الأهمية ولكن ليس المنتج غير المحدد ، مما يزيد من خصوصية التفاعل وإنتاجيته.
أخيرا ، يتم فصل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ، والذي يفصل بين نسخ مختلفة من الجين المستهدف بناء على أحجامها ، مما ينتج عنه نطاقات مميزة. يمكن بعد ذلك استئصال نطاق الاهتمام وتنقيته وتسلسله أخيرا للحصول على التسلسل الكامل للنص.
في هذا الفيديو ، سنوضح تقنية RACE ثلاثية الأعداد الأولية لتحديد وعزل النصوص المختلفة المشفرة بواسطة ذبابة الفاكهة dSmad2 الجين.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
قبل البدء في توليف وتضخيم (كدنا) ، استخدم برنامج تصميم التمهيدي لإنشاء برايمر محدد من خمسة أوليات للجين محل الاهتمام ، dSmad2 في هذا المثال. للتأكد من أن التمهيدي محدد للغاية ، يجب أن يكون حوالي 24 نيوكليوتيد وتتراوح درجة حرارته من 55 إلى 65 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتصميم برايمر متداخل ثان يقع بثلاثة أوليات من التمهيدي الأول ، وهو خاص أيضا بالتسلسل المستهدف.
للبدء ، استخرج الحمض النووي الريبي من 10 ذباب بالغ كامل باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي المتوفرة تجاريا. بمجرد استخراج الحمض النووي الريبي ، أعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. بالنسبة لتفاعل 50 ميكرولتر ، أضف 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل إلى كل أنبوب عينة ، وقم بزيادة حجم التفاعل بإضافة 24 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. ثم أضف 1 ميكرولتر من DNase I لمنع تضخيم الحمض النووي الجيني. أخيرا ، احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
بعد علاج DNase ، قم بتعطيل الإنزيم باستخدام 1 ميكرولتر من 25 مللي مولار EDTA في كل أنبوب من الأنبوب. أضف العينة إلى عمود الدوران لتنقية الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، استخدم مقياس الطيف الضوئي الصغير الحجم لقياس تركيز الحمض النووي الريبي. اضبط التركيز على 100 نانوجرام لكل ميكرولتر عن طريق إضافة ماء خال من النوكلياز.
</div>
<div class = "chapter_text" id = "script_4" >
الآن ، قم بإعداد مزيج رئيسي لتفاعل النسخ العكسي. بالإضافة إلى عينات الحمض النووي للاختبار ، قم بتضمين عنصر تحكم سلبي واحد عن طريق حذف النسخ العكسي من الأنبوب المناسب. احتضان التفاعلات لمدة 90 دقيقة عند 42 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتعطيل النسخ العكسي عن طريق احتضان الأنابيب عند 85 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بتخفيف مستويات الحمض النووي عن طريق إضافة 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE إلى كل أنبوب ليصل إجمالي التفاعل إلى 100 ميكرولتر.
الآن بعد أن تم تصنيع (كدنا) ، قم بتضخيم الجين محل الاهتمام عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). للقيام بذلك ، قم أولا بإعداد مزيج PCR للتضخيم في الجولة الأولى. بالإضافة إلى قالب (كدنا) ، قم بتضمين تفاعل تحكم سلبي يستخدم القالب من المنتج غير المنسوخة عكسيا ، بالإضافة إلى تفاعل لا يحتوي على التمهيدي الخاص بالجين كعنصر تحكم بدون تمهيدي.
بمجرد تحضير التفاعلات ، قم بإجراء تضخيم PCR في جهاز تدوير حراري مزود بغطاء ساخن. بعد ذلك ، قم بتخفيف المنتجات من 1 إلى 20 عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من منتجات PCR إلى 19 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE. باستخدام هذه المنتجات المخففة ، قم بإعداد مزيج PCR للتضخيم في الجولة الثانية. ثم استخدم جهاز تدوير حراري لتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
لعزل شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد جل الاغاروز بنسبة 1٪ عن طريق إضافة 1 جرام من الاغاروز لكل 100 مل من محلول TAE. نذوب المزيج لمدة دقيقتين في الميكروويف ، ثم نضيف بقعة SYBR Safe أو بروميد الإيثيديوم. يسكب المزيج المنصهر في صينية هلام ويترك حتى يتماسك.
أثناء تثبيت الجل ، ضع ماصة 1 ميكرولتر قطرات من صبغة التحميل 6X على قطعة من البارافيلم تتوافق مع عدد العينات. أضف 5 ميكرولتر من العينة إلى كل قطرة. الآن ، قم بتحميل العينات ، جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي 1 كيلو قاعدة ، على الجل. قم بتشغيل الجل على حرارة 120 فولت لمدة 45 دقيقة تقريبا أو حتى تصل مقدمة الصبغة إلى 75٪ من الطريق إلى أسفل الجل.
عند الانتهاء من تشغيل الجل ، تحقق من أشرطة الجل الموجودة أسفل مصباح الأشعة فوق البنفسجية. حدد موقع العصابات واقطعها باستخدام مشرط. قم بتنقية شظايا (كدنا) باستخدام مجموعة أعمدة الدوران المتوفرة تجاريا. بمجرد تنقيتها ، يمكن تخزين شظايا الحمض النووي (كدنا) عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر أو استخدامها على الفور لمزيد من التحليل.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_6">
قبل هذه التجربة ، تم شرح نسختين ذبابة الفاكهة dSmad2 في قاعدة بيانات ذبابة الفاكهة الجينومية ، FlyBase. بناء على التضفير المتوقع لهذا الجين ، يجب تحديد منتجين بواسطة بروتوكول RACE ثلاثي الأصناف.
ومع ذلك ، تكشف نتائج هذه التجربة عن ثلاثة نسخ مختلفة ل dSmad2. من بين المنتجات المتوقعة ، هناك نسخة واحدة هي السائدة ، ويتم التعبير عن نسخة واحدة على مستوى أقل. بالإضافة إلى ذلك ، تم اكتشاف منتج أصغر لم يتم وصفه سابقا ، مرئي في 750 زوجا أساسيا.
</div>

يوفر RACE أداة سريعة وغير مكلفة وقوية للحصول على cDNAs من التسلسلات المعروفة جزئيا فقط ، أو من النصوص النادرة التي يصعب تضخيمها. يمكن استخدامه إما للعثور على تسلسل النصوص غير المعروفة من جين معروف بالفعل أو لاستنساخ هذه النصوص لمزيد من الدراسات. بعد RACE ، يمكن المبالغة في التعبير عن هذه النصوص في الأنظمة القائمة على الخلايا أو الكائنات الحية النموذجية للتحقيق في وظيفتها في الجسم الحي.

التضخيم السريع لنهايات (كدنا)

المصدر: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Brückner1,2,3 
1مركز إيلي وإيديث الواسع لطب التجديد وأبحاث الخلايا الجذعية 
2 قسم بيولوجيا الخلية والأنسجة ، 
3معهد أبحاث القلب والأوعية الدموية، جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو، سان فرانسيسكو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية 
التضخيم السريع لنهايات (كدنا) (RACE) هي تقنية تسمح بتضخيم (كدنا) كامل الطول من mRNA من خلال الامتداد إلى نهاية 3 أو 5 ، حتى بدون معرفة مسبقة بالتسلسل (Frohman et al. ، 1988). على عكس تفاعل البوليميراز المتسلسل العادي ، فإنه يستخدم برايمر PCR محدد واحد فقط وبرايمر ثان غير محدد يرتبط بشكل عشوائي بمعظم mRNAs. اعتمادا على ما إذا كانت المنطقة المراد تضخيمها موجودة في نهاية 3 أو 5 من mRNA ، يتم اختيار التمهيدي الثاني لربط ذيل polyA (نهاية 3 بوصات) أو رابط اصطناعي مضاف إلى جميع النصوص (نهاية 5). من المعروف أن هذه المجموعات الأولية تنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل "أحادي الجانب" أو "المثبت" بسبب تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام التسلسل المعروف لجانب واحد - 3 "أو 5" (Ohara et al. ، 1989). يسمح هذا النهج بالتقاط mRNAs النادرة الخاصة بالجينات والتي يصعب اكتشافها ، على سبيل المثال بسبب تعبيرها المنخفض نسبيا أو تسلسلها الكامل غير المعروف (Frohman et al. ، 1988). 
يبدأ RACE بخطوة نسخ عكسي (RT) لتصنيع الحمض النووي التكميلي أحادي السبل (cDNA) من mRNA. يتبع ذلك عمليتان متتاليتان لتفاعل البوليميراز المتسلسل يضخمان شظايا (كدنا) من الجين ذي الأهمية. لإجراء RACE ، يجب أن يكون تسلسل الجين محل الاهتمام معروفا جزئيا على الأقل ، حيث يلزم تصميم البادئات الخاصة بالجينات (GSPs; Frohman, 1994; ليو وغوروفسكي، 1993). نظرا لأن زوج التمهيدي الثاني عبارة عن برايمر عام يلدين جميع النصوص الموجودة في العينة ، يتم تقليل خصوصية تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لذلك يتم إجراء RACE بشكل مثالي باستخدام اثنين من تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخلة لتقليل فرص تضخيم النصوص غير المحددة (الشكل 1). اعتمادا على اتجاه التضخيم بالنسبة إلى نظام الأفضليات المعمم ، يتم تصنيف التقنية على أنها 5 'أو 3' RACE (الشكل 1). 
 3 'RACE (الشكل 1 أ) يستفيد من ذيل poly (A) الموجود في mRNAs كموقع ربط عام للتمهيدي غير المحدد. هذا يبسط هذه التقنية ، حيث يمكن للمرء تصنيع (كدنا) باستخدام بادئات oligo (dT). توجد GSPs في منطقة 5 'من النصوص. يسمح متغير RACE هذا بالكشف عن متغيرات النسخ و 3 'UTRs المختلفة (Scotto Lavino et al. ، 2007a). في 5 'RACE (الشكل 1 ب) ، توجد GSPs في المنطقة 3 'من الجين. لتتمكن من استخدام برايمر غير محدد يرتبط بجميع النصوص ، يتم إرفاق محول يعمل كموقع ربط تمهيدي عام بنهايات الحمض النووي الريبي 5 بوصات. لتوصيل المحول ب mRNA ، يجب إزالة الغطاء 5 بوصات الذي يحمي mRNAs من نوكلياز خارجي ويعزز الترجمة (Bird et al. ، 2016). على عكس 3 'RACE ، 5' RACE يساعد في العثور على متغيرات لصق تفاضلية 5 'و 5 'UTRs بديلة (Scotto Lavino et al. ، 2007b). 
سنقوم هنا بإجراء 3 'RACE لتحديد وعزل متغيرات النسخ المختلفة باستخدام تسلسل 5' المعروف (الشكل 2 أ) المشفر بواسطة ذبابة الفاكهة dSmad2 ( Smox). dSmad2 ، بروتين Smad ذبابة ، هو محول مهم لإشارات Activin-β ، وهو مسار لعائلة TGF-β الفائقة. ينظم dSmad2 العمليات الخلوية المتعددة ، مثل تكاثر الخلايا وموت الخلايا المبرمج والتمايز (Upadhyay et al. ، 2017). نظرا لأن النصوص المقسمة تفاضليا ل dSmad2 قد يكون لها وظائف مختلفة في الذبابة البالغة ، فإن الخطوة الأولى في استكشاف هذه الوظائف المحتملة هي تقييم جميع متغيرات النسخ ل dSmad2 في هذه المرحلة التنموية.

هناك نوعان من النسخ المشروحة ل ذبابة الفاكهة dSmad2 في FlyBase (الشكل 2 أ). ومع ذلك ، تكشف نتائجنا عن ثلاثة نصوص مختلفة ل dSmad2 ، يتراوح حجمها من 750 نقطة أساس إلى 1400 نقطة أساس (الشكل 2 ب). تشير الاختلافات في شدة النطاقات إلى مستويات التعبير النسبية لديها. من بين المنتجات المتوقعة ، هناك نسخة واحدة هي السائدة (الشكل 2 ب ، السهم الأسود أ) ، ويتم التعبير عن واحد عند مستوى أقل (الشكل 2 ب ، السهم الأسود ب). بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف عن منتج أصغر لم يتم وصفه سابقا (الشكل 2 ب ، السهم الرمادي C). 
...

Source: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Br&#252;ckner1,2,3
1Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research
...

عادة ، مع mRNAs الجديدة ، لا يعرف سوى جزء من تسلسلها الكامل. يمكن تحديد تسلسلات النيوكليوتيدات المفقودة في نهايات الرنا المرسال باستخدام طريقة قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل تسمى التضخيم السريع لنهايات (كدنا) ، أو RACE. في حقيقيات النوى ، تتمتع mRNAs الناضجة بسمات هيكلية مميزة في كلا الطرفين. في نهاية الخمسة أولية ، يحتوي معظمها على بقايا غوانوزين ميثيلية متصلة ب mRNA عبر ارتباط ثلاثي فوسفات من خمسة أوليات إلى خمسة رئيسيات. يعرف هذا أيضا باسم الحد الأقصى المكون من خمسة رئيسيات. في الطرف ثلاثي النوى ، تحتوي معظم حقيقيات النوى على ذيل من 20 إلى 250 بقايا أدينيلات ، تسمى ذيل بولي (أ). الآن ، إذا كان تسلسل النيوكليوتيدات حتى لجزء صغير معروفا في أي مكان داخل mRNA ، فيمكن تضخيم التسلسل حتى نهايته ثلاثية الأعداد الأولية باستخدام برايمر خاص بالجين وأوليغو (dT) التمهيدي غير المحدد الذي يلدن إلى ذيل بولي (A) في الطرف ثلاثي الأوليات. تسمى هذه المجموعة الفرعية من تقنية RACE ثلاثية الأعداد الأولية RACE ، وتسمح باكتشاف متغيرات النسخ والمناطق غير المترجمة ثلاثية الرئيسيات المختلفة ، أو UTRs. يمكن تضخيم التسلسل في النهاية الخماسية الأولية بالمثل. للقيام بذلك ، يتم إرفاق ذيل بولي (A) أولا في الطرف المكون من خمسة أولي. بعد ذلك ، باستخدام أوليغو (dT) التمهيدي غير المحدد الذي يلدن بالذيل الملحق وبرايمر خاص بالجين ، يمكن تضخيم التسلسل حتى النهاية الخمسة. تعرف هذه المجموعة الفرعية من RACE باسم RACE خماسي الأعداد الأولية وتستخدم للعثور على متغيرات لصق تفاضلية خماسية أولية و UTRs البديلة ذات الخمسة أولية. لإجراء RACE ثلاثي الأعداد الأولية لتحديد النصوص المختلفة المشفرة بواسطة جين معين ، يتم عزل الحمض النووي الريبي أولا عن الكائن الحي أو الأنسجة ذات الأهمية. بعد ذلك ، يتم تصنيع (كدنا) من mRNAs المعزولة مع تفاعل نسخ عكسي يستخدم أوليغو (dT) التمهيدي وإنزيم النسخ العكسي ، والذي يولد الحمض النووي التكميلي من قالب الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، من مجموعة cDNA التي تم إنشاؤها ، يتم تمديد الطرف ثلاثي الأعداد الأولية غير المعروف ل cDNA المستهدف عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل ، باستخدام أوليغو (dT) التمهيدي غير المحدد وبرايمر خاص بالجين ، ويتم تضخيمه أثناء تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ومع ذلك ، نظرا للطبيعة العامة للبرايمر غير المحدد والخطأ العشوائي بواسطة التمهيدي الخاص بالجين ، يمكن أن تلدين إلى cDNA غير المستهدف ، مما يؤدي إلى تضخيمها أيضا. للتغلب على هذه المشكلة ، يتم إجراء جولة ثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات متداخلة ، والتي تربط مجرى المجموعة الأولى من البادئات. تعمل هذه المجموعة الثانية من البادئات على تضخيم (كدنا) ذي الأهمية ولكن ليس المنتج غير المحدد ، مما يزيد من خصوصية التفاعل وإنتاجيته. أخيرا ، يتم فصل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ، والذي يفصل بين نسخ مختلفة من الجين المستهدف بناء على أحجامها ، مما ينتج عنه نطاقات مميزة. يمكن بعد ذلك استئصال نطاق الاهتمام وتنقيته وتسلسله أخيرا للحصول على التسلسل الكامل للنص. في هذا الفيديو ، سنوضح تقنية RACE ثلاثية الأعداد الأولية لتحديد وعزل النصوص المختلفة المشفرة بواسطة ذبابة الفاكهة dSmad2 الجين. قبل البدء في توليف وتضخيم (كدنا) ، استخدم برنامج تصميم التمهيدي لإنشاء برايمر محدد من خمسة أوليات للجين محل الاهتمام ، dSmad2 في هذا المثال. للتأكد من أن التمهيدي محدد للغاية ، يجب أن يكون حوالي 24 نيوكليوتيد وتتراوح درجة حرارته من 55 إلى 65 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتصميم برايمر متداخل ثان يقع بثلاثة أوليات من التمهيدي الأول ، وهو خاص أيضا بالتسلسل المستهدف. للبدء ، استخرج الحمض النووي الريبي من 10 ذباب بالغ كامل باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي المتوفرة تجاريا. بمجرد استخراج الحمض النووي الريبي ، أعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. بالنسبة لتفاعل 50 ميكرولتر ، أضف 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل إلى كل أنبوب عينة ، وقم بزيادة حجم التفاعل بإضافة 24 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. ثم أضف 1 ميكرولتر من DNase I لمنع تضخيم الحمض النووي الجيني. أخيرا ، احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد علاج DNase ، قم بتعطيل الإنزيم باستخدام 1 ميكرولتر من 25 مللي مولار EDTA في كل أنبوب من الأنبوب. أضف العينة إلى عمود الدوران لتنقية الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، استخدم مقياس الطيف الضوئي الصغير الحجم لقياس تركيز الحمض النووي الريبي. اضبط التركيز على 100 نانوجرام لكل ميكرولتر عن طريق إضافة ماء خال من النوكلياز. الآن ، قم بإعداد مزيج رئيسي لتفاعل النسخ العكسي. بالإضافة إلى عينات الحمض النووي للاختبار ، قم بتضمين عنصر تحكم سلبي واحد عن طريق حذف النسخ العكسي من الأنبوب المناسب. احتضان التفاعلات لمدة 90 دقيقة عند 42 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتعطيل النسخ العكسي عن طريق احتضان الأنابيب عند 85 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بتخفيف مستويات الحمض النووي عن طريق إضافة 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE إلى كل أنبوب ليصل إجمالي التفاعل إلى 100 ميكرولتر. الآن بعد أن تم تصنيع (كدنا) ، قم بتضخيم الجين محل الاهتمام عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). للقيام بذلك ، قم أولا بإعداد مزيج PCR للتضخيم في الجولة الأولى. بالإضافة إلى قالب (كدنا) ، قم بتضمين تفاعل تحكم سلبي يستخدم القالب من المنتج غير المنسوخة عكسيا ، بالإضافة إلى تفاعل لا يحتوي على التمهيدي الخاص بالجين كعنصر تحكم بدون تمهيدي. بمجرد تحضير التفاعلات ، قم بإجراء تضخيم PCR في جهاز تدوير حراري مزود بغطاء ساخن. بعد ذلك ، قم بتخفيف المنتجات من 1 إلى 20 عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من منتجات PCR إلى 19 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE. باستخدام هذه المنتجات المخففة ، قم بإعداد مزيج PCR للتضخيم في الجولة الثانية. ثم استخدم جهاز تدوير حراري لتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني. لعزل شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد جل الاغاروز بنسبة 1٪ عن طريق إضافة 1 جرام من الاغاروز لكل 100 مل من محلول TAE. نذوب المزيج لمدة دقيقتين في الميكروويف ، ثم نضيف بقعة SYBR Safe أو بروميد الإيثيديوم. يسكب المزيج المنصهر في صينية هلام ويترك حتى يتماسك. أثناء تثبيت الجل ، ضع ماصة 1 ميكرولتر قطرات من صبغة التحميل 6X على قطعة من البارافيلم تتوافق مع عدد العينات. أضف 5 ميكرولتر من العينة إلى كل قطرة. الآن ، قم بتحميل العينات ، جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي 1 كيلو قاعدة ، على الجل. قم بتشغيل الجل على حرارة 120 فولت لمدة 45 دقيقة تقريبا أو حتى تصل مقدمة الصبغة إلى 75٪ من الطريق إلى أسفل الجل. عند الانتهاء من تشغيل الجل ، تحقق من أشرطة الجل الموجودة أسفل مصباح الأشعة فوق البنفسجية. حدد موقع العصابات واقطعها باستخدام مشرط. قم بتنقية شظايا (كدنا) باستخدام مجموعة أعمدة الدوران المتوفرة تجاريا. بمجرد تنقيتها ، يمكن تخزين شظايا الحمض النووي (كدنا) عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر أو استخدامها على الفور لمزيد من التحليل. قبل هذه التجربة ، تم شرح نسختين ذبابة الفاكهة dSmad2 في قاعدة بيانات ذبابة الفاكهة الجينومية ، FlyBase. بناء على التضفير المتوقع لهذا الجين ، يجب تحديد منتجين بواسطة بروتوكول RACE ثلاثي الأصناف. ومع ذلك ، تكشف نتائج هذه التجربة عن ثلاثة نسخ مختلفة ل dSmad2. من بين المنتجات المتوقعة ، هناك نسخة واحدة هي السائدة ، ويتم التعبير عن نسخة واحدة على مستوى أقل. بالإضافة إلى ذلك ، تم اكتشاف منتج أصغر لم يتم وصفه سابقا ، مرئي في 750 زوجا أساسيا.

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

الأحياء المتقدمة

Genetics

علم الوراثة

Rapid Amplification of cDNA Ends

mapping mrna ends with race

RACE, or Rapid Amplification of cDNA Ends, is a PCR-based method used to find the full length of an mRNA transcript. It extends cDNA to either the 3' end or the 5' end, even when the full sequence is not already known. Because it focuses on one end of a transcript, it is also called one-sided or anchored PCR.

RACE starts with reverse transcription, which converts mRNA into single-stranded complementary DNA, or cDNA. The reaction then uses one gene-specific primer and one generic primer. The generic primer binds broadly, so the method can capture rare mRNAs that may be hard to detect because they are expressed at low levels or have an unknown complete sequence.

To run RACE, scientists must know at least part of the gene sequence. That known section is needed to design the gene-specific primers, or GSPs. Because the generic primer can bind to many transcripts in the sample, RACE is usually done with two nested PCR rounds to reduce non-specific amplification.

The two main forms are 3' RACE and 5' RACE. In 3' RACE, the poly(A) tail of mRNA serves as the generic binding site, so oligo(dT) primers can be used to make cDNA. The gene-specific primers are placed in the 5' region of the transcript. This version is useful for detecting transcript variants and different 3' UTRs.

In 5' RACE, the gene-specific primers are placed in the 3' region of the gene. To create a binding site for the generic primer, an adapter is added to the 5' ends of the RNA. This requires removal of the 5' cap, which normally protects mRNA from exonucleases and helps with translation. 5' RACE is used to find different 5' splice variants and alternative 5' UTRs.

Here, 3' RACE is used to identify and isolate transcript variants from the Drosophila dSmad2, also called Smox, gene. dSmad2 is a fly Smad protein and an important transducer of Activin-β signaling, which is part of the TGF-β superfamily. It helps regulate cell proliferation, apoptosis, and differentiation.

Because different splice forms of dSmad2 may have different roles in adult flies, the first step is to map the transcript variants present at this stage. This approach helps researchers compare how the gene is expressed and processed in a specific developmental context.

Mapping mRNA Ends with RACE

an overview of genetic analysis

How Genes Shape Traits and Populations

Genes shape traits and populations through inheritance, variation, and evolution. An organism’s phenotype, or physical traits, comes from its genotype, which is the set of alleles, or gene variants, inherited from its parents. Genes can also interact with one another and with environmental factors to produce traits in different ways. Allele and trait patterns in a population are not fixed. Natural selection, migration, and random genetic drift can all change how common certain alleles are over...

genetic crosses

Mendelian Inheritance and Tetrad Analysis

Genetic crosses help scientists study how traits are passed from one generation to the next. In a genetic cross, two organisms are mated on purpose so researchers can follow how parental DNA is recombined in the offspring. This makes it possible to infer gene function, gene interactions, and gene location. Genetic crosses also played a key role in the development of Mendel's three laws of inheritance. Those laws form the basis of modern genetics. The video then focuses on tetrad analysis, a...

genetic screens

How Genetic Screens Reveal Gene Function

Genetic screens are tools scientists use to reveal gene function and study gene interactions. They work by changing genes and then checking the organism for a trait, or phenotype, that can be seen or measured. This makes them useful for linking a DNA change to a biological effect. One common approach is a forward genetic screen. In a forward screen, mutations are made at random, and researchers look for organisms with a phenotype of interest. This method can help identify unknown genes that...

an overview of genetics and disease

Genetic Variations Linked to Human Disease

Genetic variations can play a major role in human disease. Some mutations are inherited from one generation to the next. Others appear during a person’s life and can contribute to diseases such as cancer. Medical geneticists study these changes to understand how disease develops. Their work has a long history, and it focuses on key questions about how genetic alterations affect health. Researchers use this knowledge to improve diagnosis and expand treatment options for patients. Several tools...

snp genotyping

Detecting SNPs in Human DNA

SNPs, or single nucleotide polymorphisms, are the most common form of genetic variation in humans. They are changes at a single DNA base. In many cases, these differences do not directly affect gene expression. Even so, they can help scientists locate disease-associated genes or support patient diagnosis. This page explains how SNPs are identified, or genotyped. Several common methods are used for this purpose. These include direct hybridization, PCR-based methods, fragment analysis, and...

cytogenetics

Karyotype Analysis in Chromosomes

Karyotype analysis focuses on chromosomes and their number and structure. A karyotype is the direct view of a cell’s chromosomes, and it can reveal chromosomal abnormalities linked to disease. Chromosomes in a karyotype can be stained with different dyes to create unique banding patterns. These patterns help scientists compare chromosomes and look for changes in structure. The video also explains newer cytogenetics methods, including comparative genomic hybridization and fluorescence in situ...

an overview of gene expression

Gene Expression: How Cells Make Proteins

Gene expression is the process cells use to turn genetic information into functional products. In many cases, that product is a protein made from amino acids. This process is controlled at several stages, and mistakes in control can contribute to diseases such as cancer. The study of gene expression has also grown through major historical discoveries. One key advance was learning how specific combinations of DNA bases encode the amino acids that build proteins. That discovery helped explain...

expression profiling with microarrays

Using Microarrays to Compare Gene Expression

Microarrays let scientists compare gene expression by measuring how strongly genes are turned on in a sample. They rely on complementary binding, which means matching nucleic acid strands stick to each other. In this method, probes attached to a glass chip bind to nucleic acids taken from samples. With microarrays, researchers can evaluate the expression of thousands of genes at the same time. That makes the method useful for spotting broad patterns in cells and tissues. Scientists can also...

rapid amplification of cdna ends

RACE, or Rapid Amplification of cDNA Ends, is a PCR-based method used to find the full length of an mRNA transcript. It extends cDNA to either the 3' end or the 5' end, even when the full sequence is not already known. Because it focuses on one end of a transcript, it is also called one-sided or anchored PCR. RACE starts with reverse transcription, which converts mRNA into single-stranded complementary DNA, or cDNA. The reaction then uses one gene-specific primer and one generic primer. The...

rna-seq

Measuring Gene Expression with RNA-Seq

RNA-seq measures gene expression by sequencing RNA from a sample. It is a high-throughput method, which means it can read many RNA molecules at once. It is especially useful because it can be analyzed without prior genomic information. In RNA-seq, RNA isolated from samples of interest is first used to build a DNA library. A DNA library is a prepared collection of DNA fragments made from the RNA. That library is then amplified and sequenced. The resulting data can show which genes are...

an overview of epigenetics

How Epigenetic Tags Control Genes

Epigenetic tags can change how genes work without changing the DNA sequence itself. In genetics research, scientists have long seen heritable traits that are not explained by changes in the nucleotide sequence of DNA. These differences are linked to chemical and protein-based controls that act on genes. One common mechanism is DNA methylation, which adds methyl groups to cytosine bases in DNA. Another involves histones, the proteins around which DNA is wrapped. Chemical groups added to...

dna methylation analysis

DNA Methylation and Gene Silencing

DNA methylation is a DNA change that can help turn genes on or off. It happens most often at CpG dinucleotides, which are places where a cytosine is followed by a guanine in the DNA sequence. Methyl groups added at these sites may affect gene expression and are often studied near promoters and other gene control regions. Clusters of these methylation sites are called CpG islands. When CpG islands near a promoter become methylated, they may help keep a gene silent in a stable way. This matters...

chromatin immunoprecipitation

Mapping DNA With Histone Marks

Histones help package DNA in eukaryotic nuclei. DNA wraps around these proteins to form chromatin, the compact structure that organizes the genome. Histones can also carry chemical changes, and those changes can affect gene expression. Scientists use chromatin immunoprecipitation, or ChIP, to find which DNA regions are linked to specific histone modifications or other gene regulatory proteins. An antibody is used to isolate the protein of interest. The DNA that remains attached to that protein...

an overview of genetic engineering

Genetic Engineering Tools and Applications

Genetic engineering changes an organism’s DNA on purpose. It is used to build research tools, create model organisms, and support agricultural applications. Scientists also study it for future uses such as stress tolerance in crops and gene therapy for human disease. The field grew as researchers confirmed that DNA is the genetic material. Those discoveries led to tools that can modify DNA. This page also traces the history of genetic engineering and shows how those tools became part of modern...

recombineering and gene targeting

Homologous Recombination for DNA Engineering

Homologous recombination is a key method for DNA engineering in modern biology. It lets scientists change DNA by using matching stretches of sequence between different DNA molecules. This approach helps overcome limits of standard molecular cloning with restriction enzymes, which can be less useful for large or complex DNA constructs. Recombineering uses homologous recombination to edit DNA more efficiently. It depends on recombination-competent organisms and genomic libraries such as...

genome editing

DNA Repair Tools for Genome Editing

Genome editing uses DNA repair to make targeted changes in the genome. It works by creating a double-strand break in DNA with an engineered nuclease. The nuclease is guided to a chosen genomic site by a protein or an RNA that recognizes a specific sequence. After the break, the cell tries to repair the damage. During that repair process, mutations can be introduced into the targeted DNA region. This makes genome editing a useful way to modify specific sequences without relying only on gene...

genetics

This collection focuses on genetics and incorporates five broad subdisciplines: the genetics of individuals and populations; genetics and disease; gene expression; epigenetics; and genetic engineering. 

Learn how RACE finds mRNA ends using gene-specific and generic primers, and how 3' RACE is used to identify dSmad2 transcript variants in flies.

Mapping mRNA Ends with RACE

Description

Transcript

Tags