ويشيع استخدام الديدان المعدلة وراثيا في C. ايليجانس البحوث. ووصف هو بروتوكول بسيطة ، لكنها فعالة ، ليعرض في الجينات المحورة باستخدام الديدان القصف biolistic مع جزيئات الذهب المطلي الحمض النووي. على الجهد المبذول والنتائج من القصف إيجابية لدى مقارنتها microinjection لتوليد حيوانات معدلة وراثيا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
عدد المختبرات باستخدام النيماتودا تعيش حرة C. ايليجانس يشهد نموا سريعا. ويعزى الإقبال على هذا النموذج البيولوجي إلى وقت الجيل السريع والقصير العمر ، صيانة سهلة وغير مكلفة ، تسلسل الجينوم بالكامل ، ومجموعة من الموارد رني والحيوانات الطافرة. بالإضافة إلى ذلك ، تحليل جيم كشفت ايليجانس الجينوم تشابه كبير بين الديدان والفقاريات العليا ، مما يوحي بأن البحث في الديدان يمكن أن يكون إضافة هامة للدراسات التي أجريت في الفئران كليا أو الخلايا المستزرعة. إن جزءا مهما من قوة والبحوث الدودة هي القدرة على استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا لدراسة الجينات وظيفة الترجمة. يمكن خلق حيوانات معدلة وراثيا إما عن طريق microinjection من germline دودة أو من خلال استخدام القصف biolistic. القصف هو أحدث تقنية وغير مألوفة لعدد من المعامل. نحن هنا وصف بروتوكول بسيط لتوليد الديدان المعدلة وراثيا عن طريق القصف biolistic مع جزيئات الذهب باستخدام بيو راد PDS - 1000 النظام. مقارنة الحمض النووي في microinjection germline خنثى ، هذا البروتوكول لديه ميزة لا تتطلب مهارات خاصة من المشغل فيما يتعلق بتحديد تشريح دودة أو أداء microinjection. وعادة ما يتم الحصول على مزيد من خطوط المعدلة وراثيا متعددة من القصف واحدة. أيضا على النقيض من microinjection ، قصف biolistic تنتج حيوانات محورة جينيا مع كل من صفائف خارج الصبغي والجينات المحورة المتكاملة. يمكن أن القدرة على الحصول على خطوط المعدلة وراثيا متكاملة تجنب استخدام البروتوكولات مطفرة لدمج الحمض النووي الأجنبية. في الختام ، يمكن أن يكون القصف biolistic طريقة جذابة لجيل من الحيوانات المعدلة وراثيا ، وخاصة بالنسبة للمحققين ليست مهتمة في الاستثمار في الوقت والجهد اللازم ليصبحوا مهرة في microinjection.
البروتوكول
نظرة عامة
وقد تولدت الديدان المعدلة وراثيا تقليديا microinjecting DNA التحوير في C. ايليجانس germline 1،2،3،4. بينما ناجحة ، حسب هذا النهج المعدات المتخصصة وتطوير الخبرات مع تشريح دودة وتقنية microinjection. في الآونة الأخيرة وضعت القصف biolistic كنهج بديل والذي يستخدم الحمض النووي جزيئات الذهب المطلي لإدخال الحمض النووي الأجنبية إلى 5،6 germline. هذا النهج يتطلب وقتا أقل في الاستثمار من حيث الممارسة لتصبح ناجحة.
القصف biolistic من جيم ايليجانس لتوليد الد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
قصف Biolistic هي طريقة بسيطة لإدخال الحمض النووي الأجنبية إلى العديد من الكائنات الحية ، بما في ذلك جيم ايليجانس 1،5،6،7،16. لأنه يعتمد على جزيئات الذهب تشكيل معقدة مع الحمض النووي في وجود CaCl 2. الأمينات الموجبة ، مثل سبيرمدين ، وحماية الحمض النووي من تدهور nuclease في الجسم الحي. منذ سبيرمدين هو جزيء عطوب ، فمن المهم لتخزينه في aliquots صغيرة في -20 درجة مئوية ، وجعل الحل الصحيح قبل تنفيذ القصف. كما وصفنا في البروتوكول القصف ، ويمكن استخدامها بدلا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من جانب صناديق البذور من جامعة بيتسبرغ والمعاهد الوطنية للصحة AG028977 منحة لمؤسسة آنا ليند
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| جسيمات ذهبية | Inbio gold | BD021 | 1micron |
| طقم استخلاص Midiprep | Qiagen | 12143 | |
| سبرميدين | Sigma-Aldrich | S4139 | |
| بروتامين | Sigma-Aldrich | P4505 | |
| حوامل كبيرة (Macrocarriers) | Bio-Rad | 165-2335 | |
| نظام PDS-1000/He Hepta | Bio-Rad | 165-2257 | |
| قرص تمزق | Bio-Rad | 165-2330 | |
| نيستاتين | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| ستريبتومايسين | MP Biomedicals | 100556 |
المراجع
- Evans, T. C. Wormbook. , 1-15 (2006).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA tr....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation
Posted by JoVE Editors on 12/12/2012. Citeable Link.
The volume for a solution in, Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation, was incorrect.
