في هذا الفيديو نظهر تقنية الطباعة الحجرية الناعمة مع siloxane polydimethyl (PDMS) التي نستخدمها لfarbricate جهاز ميكروفلويديك لزراعة الخلايا العصبية.
مقالة منهجية
تصنيع جهاز ميكروفلويديك للتجزئة سوما الخلية العصبية والمحاوير
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في هذا الفيديو ، وندلل على تقنية الطباعة الحجرية الناعمة مع siloxane polydimethyl (PDMS) التي نستخدمها لصنع جهاز ميكروفلويديك لزراعة الخلايا العصبية. سابقا ، كانت منقوشة رقاقة السيليكون مع تصميم للجهاز باستخدام الخلايا العصبية ميكروفلويديك SU - 8 و ضوئيه لإنشاء القالب الرئيسي ، أو ما نشير ببساطة إلى أنه "سيد". المقبل ، ونحن صب بوليمر السليكون PDMS على رأس الرئيسي الذي شفي بعد ذلك عن طريق تسخين PDMS إلى 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ويشكل PDMS العفن السلبية للجهاز. ومن ثم قطع بعناية PDMS ورفعت بعيدا عن الربان. واللكم الثقوب حيث سيتم الخزانات وقلص PDMS الزائدة بعيدا عن الجهاز. ويستخدم النيتروجين لتفجير بعيدا أي حطام الزائدة من الجهاز. عند هذه النقطة الأجهزة هي الآن جاهزة للاستخدام ، ويمكن المستعبدين إما لتغطية زجاج كورنينج رقم 1 مع البلازما التعقيم / نظافة أو يمكن أن تكون ملزمة عكسية على الزجاج تغطي ببساطة عن طريق وضع الجهاز على أعلى من الزجاج غطاء. وغطت الرابطة عكسها الجهاز على الزجاج في شريط فيديو منفصل ويتطلب أولا أن يتم تعقيم الجهاز إما مع الايثانول 70 ٪ أو التعقيم. البلازما علاج يعقم الأجهزة حتى لا مزيد من العلاج الضروري. هو عليه ، ومع ذلك ، من المهم ، عند البلازما معالجة الأجهزة ، إضافة إلى الأجهزة السائل في غضون 10 دقيقة من العلاج البلازما في حين لا تزال الأسطح المائية. الانتظار وقتا أطول من 10 دقائق لإضافة السائل إلى الجهاز يجعل من الصعب على السائل لدخول الجهاز. واضاف على الفور الأجهزة العصبية وعادة ما تكون البلازما محدد لتغطية الزجاج و 0.5 ملغ / مل بولي - L - يسين (PLL) في المخزن الرقم الهيدروجيني بورات 8.5 إلى الجهاز. بعد ما لا يقل عن 3 ساعات مع تفرخ PLL ، يتم غسلها بالماء الأجهزة dH2O ما لا يقل عن 3 مرات على الأقل 15 دقيقة بين كل غسل. المقبل ، يتم إزالة الماء ويضاف الطازجة وسائل الإعلام إلى الجهاز. عند هذه النقطة يكون الجهاز جاهزا للاستخدام. من المهم أن نتذكر في هذه المرحلة أن أبدا إزالة كافة وسائل الإعلام من الجهاز. دائما تترك وسائل الإعلام في القناة الرئيسية.
البروتوكول
الجزء 1 : إعداد الجهاز ميكروفلويديك عصبون
- "وتستخدم رقاقة السيليكون مع نمط مصنوعة من SU - 8 بواسطة ضوئيه الإدلاء (PDMS) Polydimethylsiloxane العفن ميكروفلويديك. نشير إلى SU - 8 رقاقة السيليكون منقوشة والقوالب الرئيسية ، أو" A 3 سادة ".
- مختلطة مع وكيل PDMS علاج في فصيل عبد الواحد / ث نسبة 10:1 ، وهذا هو ، لمدة 10 غراما من PDMS ، يضاف 1 غرام من وكيل علاج لها.
- خلط PDMS ثم جيدا وسكب على ورقاقة السيليكون. يرد رقاقة السيليكون داخل صحن 10 سم بيتري البوليسترين. يستغرق حوالي 12 غرام إلى 15 غرام من PDMS لتغطية رئيسية مع سماكة 4 ملم تقريبا.
- ثم يتم وضع الربان مع PDMS في فراغ dessicator مع الغطاء طبق بيتري ، ويتم تطبيق فراغ. يتم ذلك للمساعدة على إزالة فقاعات الهواء من PDMS التي تم تقديمها خلال اثارة للعامل في هذه المعالجة. يلزم لتكون إزالة ما يقرب من 15 دقيقة لفقاعات الهواء.
- تتم إزالة رئيسية مع PDMS من dessicator. يستخدم بندقية الهواء مع مرشح أم 0.45 لإزالة أي فقاعات المتبقية.
- ثم يتم وضع الربان على صفيحة ساخنة 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة من العلاج.
ملاحظة : إذا dessicator فراغ غير متوفرة ، ويمكن ترك الرئيسي في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات. وسوف تتبدد فقاعات الهواء في النهاية من تلقاء نفسها. إذا طبق ساخن غير متوفرة ، فإن PDMS علاج في درجة حرارة الغرفة بعد 24 ساعة.
ملاحظة : ومن المهم أيضا للتأكد من أن الربان هو مستوى خلال عملية المعالجة.
الجزء 2 : الاستغناء عن جهاز ميكروفلويديك عصبون
- بمجرد أن يتم الشفاء من PDMS على الشريحة الرئيسية ، يتم التقاطها على غطاء محرك السيارة نظيفة.
- استخدام شفرة جراحية ، هو قطع دائرة حول محيط الأجهزة. عند واحد يدخل النصل في PDMS ، فمن المهم لاجراء اتصالات مع رقاقة السيليكون لكن لا تضع الكثير من الضغوط على الرقاقة ، وإلا سيكون سيد الكراك.
- مع دائرة قطع كل الطريق حول الأجهزة (هناك 4 أجهزة في كل ماجستير 3 السيليكون ") ، ورفع بعناية قبالة PDMS الرئيسي. يمكن بدء هذا اللف برفق شفرة الجراحية كما هو إدراجه في خفض السابقة .
- المقبل ، وخزانات لكمات في الجهاز باستخدام الأنسجة 8 ملم خزعة لكمة.
- ثم يتم إيواؤهم الأجهزة وقلص PDMS الزائدة بعيدا حتى أن الجهاز سوف ينطبق بدقة على كورنينج زجاج الغطاء (رقم 1) 24 ملم × 40 ملم. ويستخدم النيتروجين الجوي لتفجير بعيدا أي حطام الزائدة. ويمكن أيضا أن تكون إزالة الحطام العنيد باستخدام العلامة التجارية 3M سكوتش الشريط الفينيل 471.
الجزء 3 : البلازما الرابطة الأجهزة زلات لتغطية الزجاج.
- يستخدم لتنظيف البلازما السندات Harrick الأجهزة العصبية لتغطية زلات. لفترة وجيزة ، وتوضع الأجهزة في نظافة البلازما ، وتستخدم مضخة فراغ لاجلاء الهواء من الغرفة.
- بعد الضغط من فراغ وصلت 300 milliTorr ، يتم تشغيل الطاقة إلى لفائف الكهربائية وتعيين إلى عالية.
- لفائف الكهربائية يخلق البلازما "، وهو غاز مؤين جزئيا يتكون من الإلكترونات ، الأيونات والذرات أو الجزيئات المحايدة" -- http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php ، للخروج من جزيئات الهواء المتبقية غادرت في الغرفة. البلازما يخلق نوعا رد الفعل على أسطح من الزجاج والجهاز ، والتي عندما وضعت معا ستشكل سندا دائما. البلازما يتحول أيضا السطوح المائية ، مما يساعد على تسهيل إضافة السوائل. بالإضافة إلى ذلك ، نظافة البلازما يعقم الأجهزة.
يوضع على سطح الجهاز PDMS الذي يحتوي على جهاز ميكروفلويديك في مواجهة نظافة البلازما مع الشرائح الزجاجية.
ويتم تجميع السطوح البلازما المعالجة من الزجاج وجهاز ميكروفلويديك في اتصال مع بعضها البعض في مقعد نظيفة ، ثم توضع في أطباق العقيمة 60 ملم. والأسطح المعالجة تشكيل رابطة ضيقة لا رجعة فيه. - في غضون 10 دقيقة من البلازما الرابطة الأجهزة على الزجاج ، إضافة بولي - L - يسين (PLL) إلى الجهاز. بعد 10 دقيقة ، سوف hydrophilicity الجهاز الانخفاض مما يجعل من الصعب للPLL لدخول الجهاز.
ملاحظة : من المهم أن تحقق من وجود فقاعات الهواء في الجهاز بعد إضافة PLL. فقاعات الهواء في القناة الرئيسية هي غير مرغوب فيه ، لأنها أكسدة الخلايا. طريقة سهلة لإزالة أي فقاعات هواء الحالية هو استخدام الماصة P200 مليئة 150 UL السائل (في هذه الحالة PLL) ، ضع طرف مباشر في افتتاح القناة الرئيسية ، وكساد P200 بقوة. هذا قد تحتاج إلى تكرار عدة مرات ولكن في نهاية المطاف قوة من الماصة سيدفع فقاعات الخروج. - ويسمح للأجهزة التي تحتوي على PLL لاحتضان بين عشية وضحاها في نسيج الثقافة حاضنة قياسية بلغت 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2.
- في اليوم التالي ، دييتم شطف الرذائل بسرعة مرتين مع dH2O تعقيمها. أثناء هذه العملية ، يتم أبدا إزالة السائل تماما من القنوات الرئيسية ، إلا من الخزانات. فإن إزالة السائل من القنوات الرئيسية أعرض الفقاعات. بعد 2 يشطف سريعة ، يتم ملء هذه الأجهزة مع dH2O تعقيمها ووضعها مرة أخرى في حاضنة لمدة لا تقل عن 3 ساعات ، أو بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي ، والأجهزة مرة أخرى تشطف 2 مرات بسرعة مع dH2O تعقيمها. ثم يتم إضافة وسائل الاعلام العصبية القاعدية ، التي تحتوي على ملاحق ضرورية B27 وزراعة الخلايا العصبية لglutamax الجرذان الأولية ، إلى الأجهزة. وضعت الأجهزة مرة أخرى في حاضنة لاستخدامها في المستقبل. الأجهزة هي الآن جاهزة للزرع الخلايا العصبية.
المناقشة
في هذا الفيديو أظهرنا كيفية جعل وإعداد جهاز ميكروفلويديك PDMS التي نستخدمها لثقافة فيها الخلايا العصبية والجهاز يسمح لنا بالحصول على جزء نقية محواري مفصولة microgrooves من مقصورة تحتوي على مزيج من الهيئات الخلية ، والتشعبات ، والمحاوير . هذه الأجهزة تسمح للباحث لدراسة آثار العلاجات المختلفة وكذلك توفير منصة لتنفيذ إصابات جسدية على المحاور ومراقبة ما آثار هذه العلاجات وعلى الخلايا العصبية. ويوفر الجهاز أيضا على مستوى من أجل استنبات الخلايا العصبية التي تساعد على تسهيل دراسات النقل. إضافة إلى ذلك ، microgrooves والتي تفصل بين الثقافة المقصورة الخلية من المقصورة محور عصبي ، ويسمح للعزلة fluidic بين القسمين مما يجعل من الممكن لمعالجة جانب واحد من الجهاز دون التأثير على الجانب الآخر من الجهاز مباشرة مع العلاج. هذه الخاصية تسمح للباحث لدراسة تأثيرات مثل نقل الإشارة والنقل التي تنتج عن العلاج.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| PDMS | كاشف | Dow Corning | Sylgard 184 مع عامل المعالجة، يرجى مراجعة Dow Corning للعثور على مورد قريب منك | |
| جهاز تنظيف بالبلازما | أداة | Harrick Scientific Products, Inc. | http://www.harrickplasma.com/ | |
| وسط غذائي عصبي أساسي | كاشف | Invitrogen | 21103-049 | يتم الحصول على الوسط الغذائي العصبي الأساسي من شركة Invitrogen ضمن خط Gibco لكواشف الزرع الخلوي. |
| B27 | كاشف | Invitrogen | 17504-044 | B27 هو مكمل مسجل تجارياً متاح من خلال شركة Invitrogen ضمن خط Gibco لكواشف الزرع الخلوي. |
| Glutamax | كاشف | Invitrogen | 35050-061 | يتوفر Glutamax من خلال شركة Invitrogen ضمن خط Gibco لكواشف الزرع الخلوي. |
| غطاء زجاجي Corning رقم 1 | غطاء زجاجي | Corning | Corning No. X2935 244 | متاح من خلال Fisher Scientific، رقم كتالوج Fish 12-531D |
| أطباق بتري 60 مم | أداة | Fisher Scientific | 08-757-13A | تُستخدم أطباق بتري المعقمة المصنوعة من البوليسترين بمقاس 60 مم لاحتواء الجهاز المربوط بالزجاج. |
| أنبوب BD Falcon سعة 50 مل | أداة | BD Biosciences | Falcon No. 352098 | متاح من خلال رقم كتالوج Fisher Scientific 14-959-49A |
| أنبوب BD Falcon سعة 15 مل | أداة | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | متاح من خلال رقم كتالوج Fisher Scientific 14-959-70C |
| Poly-L-Lysine | كاشف | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| عنصر جديد |
المراجع
- Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
