هذه المقالة يوضح طريقتين مختلفتين جدا من الحقن : 1) في الدماغ (intracerebroventricular) و 2) جهازية (في الوريد) لإدخال العوامل العلاجية في النظام العصبي المركزي من الفئران حديثي الولادة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقديم وكلاء العلاجية من خلال Intracerebroventricular (ICV) ، وحقن في الوريد (رابعا) في الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
على الرغم من دور الحماية التي حاجز الدم في الدماغ يلعب في التدريع الدماغ ، وأنه يحد من الوصول إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، الذي غالبا ما يؤدي إلى فشل العلاجات المحتملة المصممة ل1،2 الاضطرابات العصبية. الأمراض العصبية مثل ضمور العضلات الشوكي (SMA) ، والتي تتأثر الخلايا العصبية الحركية أقل ، يمكن أن تستفيد كثيرا من تقديم وكلاء العلاجية في الجهاز العصبي المركزي. الغرض من هذا الفيديو هو إظهار نموذجين حقن مختلفة لتوفير المواد العلاجية في الفئران حديثي الولادة في أقرب وقت بعد الولادة. واحد من هذه الأساليب هو عن طريق الحقن مباشرة في البطينات الدماغية الوحشي (Intracerebroventricular) الذي ينتج في تسليم المواد إلى الجهاز العصبي المركزي من خلال السائل النخاعي 3،4. الأسلوب الثاني هو حقن الوريد الصدغي (في الوريد) التي يمكن إدخال العلاجات المختلفة في نظام الدورة الدموية ، مما يؤدي إلى تسليم النظامية بما في ذلك الجهاز العصبي المركزي 5. تنبيغ على نطاق واسع في الجهاز العصبي المركزي يمكن تحقيقه إذا ما استخدمت متجه المناسبة الفيروسي والمصلي الفيروسي. التصور والاستفادة من الوريد الصدغي للحقن غير مجدية حتى اليوم ما بعد الولادة 6. ومع ذلك ، إذا كان المقصود تسليم المواد للوصول إلى الجهاز العصبي المركزي ، يجب أن تتم هذه الحقن في حين أن حاجز الدم في الدماغ هو أكثر نفاذا بسبب وضعها غير ناضجة ، وذلك قبل يوم ويفضل أن تكون فترة ما بعد الولادة 2. الدم في الدماغ وضعت بشكل كامل حاجز يحد بدرجة كبيرة من الفاعلية في التنفيذ عن طريق الوريد. نظم التوصيل على حد سواء بسيطة وفعالة عندما يتم تحقيق الكفاءة الجراحية. أنها لا تتطلب أية أجهزة جراحية واسعة النطاق يمكن أن يقوم بها شخص واحد. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات ليست بدون تحديات. ويمكن لصغر حجم الجراء بعد الولادة 2 اليوم وما تلاه من المناطق المستهدفة الصغيرة تجعل من الصعب تنفيذ عمليات الحقن وتحديا في البداية لتكرار.
البروتوكول
1. Intracerebroventricular الحقن
- الخطوة الأولى هي إعداد الحلول الأسهم الحقن ، وهذه الحلول هي ناقلات فيروسية ، DNA البلازميد ، والمخدرات ، وينبغي أن يتم حقنه تحت ظروف معقمة.
- مزيج من عيار المطلوب النواقل الفيروسية (مجموع ميكرولتر 5-7) مع 0.05 ٪ W / V التريبان الأزرق في برنامج تلفزيوني عن التصور لموقع الحقن.
- البلازميد حل الحمض النووي (5 لتر مجموع ميكرولتر) يحتوي على مد (+) - الجلوكوز 20 ٪ (W / V) (1 ميكرولتر) ، التريبان الأزرق (0.05 ٪) PBS (1 ميكرولتر) ، بلازميد (~ ~ 5 ز / L ~ () 2 ~ L) ، و 2.5 كيلو دالتون خطية homopolymer PEI (150 ملم) (1 ~ L).
- شل PND 2 حديثي الولادة عن طريق التخدير بالتبريد لمدة 1-2 دقائق.
- الإبرة المستخدمة في هذه الحقن هي الصغرى ليتر معايرة micropipette الزجاج المعقمة التي يتم تركيبها على 3ml حقنة 3 مل هاميلتون من خلال أنبوب طويل.
- كسر رأس الإبرة (مع ملعقة) لضبط لاختراق مم 2 في الجمجمة. مكان الإبرة قطريا في الأنبوب الذي يحتوي على حل microcentrifuge الحقن. تحميل الحل في حقن الإبرة بعناية عن طريق سحب المكبس من المحاقن.
- بعد امتصاص من الحل ، تنأى المحقنة من الأنبوب ؛ سحب ما يصل المكبس ومزيد من ثم نعلق على الإبرة مرة أخرى.
- عقد إبرة في اليد اليمنى بين الإبهام والسبابة ومكان الحقنة بين الأصابع الوسطى والبنصر مع المكبس لمس كف اليد اليمنى.
- فهم يجمد الماوس بحزم إلى جانب الجلد خلف الرأس باستخدام اليد اليسرى والمكان على ضوء الالياف البصرية لإلقاء الضوء على الهياكل التشريحية ذات الصلة التي يمكن استخدامها كدليل.
- ادخال الإبرة 2 مم عميق ، عمودي على سطح الجمجمة ، في مكان ما يقرب من 0.25 ملم الوحشي للخياطة والسهمي 0،50-0،75 مم منقاري لخياطة الشرايين التاجية في حديثي الولادة (الشكل 1A) ، ثم دفع المكبس باستخدام كف اليد اليمنى ببطء شديد وبعناية. رصد السفن تمزق أو تورم في الوجه.
- إزالة الإبرة 15 ثانية بعد وقف حركة المكبس لمنع قلس.
- لاسترداد ، والحفاظ على الفئران لمدة 5-10 دقائق في وعاء تحسنت حتى يتم استعادة الحركة والقدرة على الاستجابة العامة.
2. الحقن في الوريد عن طريق الوريد الصدغي / الوجه
- وينبغي إعداد الحل ليتم حقنه وتستكمل مع تصفيتها صبغة الطعام الخضراء في التخفيف 1:100 وحقنها تحت ظروف معقمة.
- إرفاق luer بلاستيكية صغيرة وحتى نهاية 100 ميكرولتر حقنة هاميلتون الزجاج. لluer ، أرفق قياس 33 بوصة 0.25 الحقن بالإبر. ضمان أن يتم توصيل جميع الأجزاء.
- تحميل المحاقن مع وحدة التخزين ليتم حقنه ، وضمان عدم وجود الهواء في حقنة وحقن الهواء في الإناء قاتلة. غالبا ما يكون من المفيد أن حجم الماصة ليتم حقنه حتى قطعة من parafilm. وهذا يسمح للتصور واضح للامتصاص من الحل في المحاقن.
- ويستخدم Transilluminator البصر وي لتصور بسهولة الوريد الصدغي السطحي ، أو عرق الوجه ، في الوليد (الشكل 2A). قبل الحقن ، وتأمين الوليد إلى transilluminator باستخدام الشريط الجراحية. وينبغي أن يوضع شاش بين الوليد والشريط لمنع الشريط من إتلاف جلد الحيوان. تأمين الحيوانات لtransilluminator على جانبها ، وضمان ان الشريط لا يمنع التنفس. وينبغي للرقبة الوليد برفق بحيث تحولت الوريد الوجه مرئيا بسهولة ويجب أن تكون مسجلة في الأنف لتحقيق الاستقرار في الرأس.
- باستخدام المكبر عقال 2.25X للسماح لسهولة التصور ، تضاف ببطء الإبرة في الوريد. السياق هو سطحي جدا بحيث يجب أن تبقى مرئية إبرة تحت الجلد.
- ضخ ببطء حجم المحلول في الوريد. الصبغة الخضراء يسمح التصور سهل من الحقن.
- الانتظار 15 ثانية قبل إزالة الإبرة كما أن هناك فارقا بين محبط تماما المكبس من المحاقن وطرد من الحل لا تزال قائمة بسبب تحمل الإبرة الضيقة للغاية.
- بعد إزالة الإبرة ، واستخدام الشاش لتطبيق الضغط على موقع الحقن حتى يتوقف النزيف.
- الوليد لرصد علامات على الضيق. بعد الحقن ، ينبغي أن يلاحظ أي ضائقة علني. وينبغي إيلاء الوليد حوالي 5 دقائق لاستعادة قبل إعادته إلى القفص.
- مطاردة الوحدة إبرة / المحاقن مع برنامج تلفزيوني في الحقن وبين الدم في الإبرة سوف تسد بسرعة بسبب تتحمل الصغيرة.
3. ممثل النتائج :
ICV الحقن : يمكن حصاده والدماغ في مختلف نقاط حقن الوقت وتصور آخر لإثبات نجاح تقنية الحقن. إذا لم يتم إضافة الصبغة في حل الحقن ، وسوف يكون من الصعب التحقق من دقة فيjection. والحقن واحد من البطينين يسمح توزيع التريبان الأزرق على الجانب حقنه في الدماغ حوالي 10-15 دقيقة بعد الحقن (1B الشكل). وهناك توزيع موحد للأزرق التريبان في نصفي الكرة الأرضية على حد سواء الدماغ الأيمن والأيسر وبصيلات الشم تكون مرئية حوالي 60 دقيقة بعد الحقن (الشكل 1C). هذا ومن المقرر أن التواصل بين البطينين الدماغي التي من شأنها أن تسمح للنشر الصبغة الزرقاء إلى البطين المجاورة. ويمكن أيضا أن تكون دقيقة الحقن التي تصور تشتت الصبغة الزرقاء في القناة الشوكية المركزية منقاري تقريبا في غضون 12 ساعة بعد الحقن (1D الشكل). ويمكن تمييز الحقن غير دقيقة بسبب الافتقار إلى اللون الأزرق في نصفي الكرة المخية. في هذه الحالة ، كان على عمق الإبرة لا يكفي والحل ربما وزعت بالحقن تحت الجلد. والبديل هو إمكانية أن الإبرة توغلت عميقا في الدماغ ، وبالتالي تمرير خارج البطين ويتم إفراغ الحل تحت البطينات الدماغية.
رابعا الحقن : يمكن أن تكون دقيقة وفعالة حقن الوريد الصدغي / تصور الوجه مباشرة بعد الحقن. كما يتم حقن محلول ، صبغة خضراء يسمح التصور من الحل الدخول والتي تتدفق من خلال الوريد الوجه (الشكل 2A). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ملاحظة تغير لون البشرة من الفأرة الحقن التالية. يتم تحويل لون وردي والوليد الطبيعي إلى اللون الأخضر ، وذلك بسبب وجود صبغة الطعام الخضراء في حل حقن (2B الشكل). مدى تغير اللون الأخضر لوحظت في الوليد يعتمد على تركيز الصبغة المستخدمة. لرؤية بسيطة من الحقن ، وخلال فترة الممارسة ، فمن المستحسن المخفف 01:50. ومع ذلك ، فإن تغير لون البشرة بشكل كبير في النتائج في كثير من الأحيان يتم رفض الجرو من قبل الأم ، وبالتالي ينبغي النظر في إزالة الصبغة أو التركيز بدرجة كبيرة خلال إجراءات تجريبية. سوف حقنة غير دقيقة يؤدي إلى تراكم الصبغة الخضراء تحت الجلد في موقع الحقن. ويعتبر الحقن غير مكتملة ، والذي يحدث عندما لا يتم افتتاح إبرة تدخل بشكل كامل في الوريد ، وعندما حل بعض التدفقات في الوريد وبعض تتراكم تحت الجلد. إذا لوحظ ذلك ، ينبغي إدراج المزيد من إبرة في الإناء.
الشكل 1. تظاهرة من الحقن ICV PDN2 ناجحة في الفئران. التخطيطي) من مواقع الحقن المستخدمة في الحقن ICV إلى البطينين. B) من الدماغ ICV حقن الجرو مع الأزرق التريبان في برنامج تلفزيوني على البطين الأيسر ، 15 صورة التقطت حقن آخر دقيقة. C ) من الدماغ ICV حقن الجرو مع الأزرق التريبان في برنامج تلفزيوني على البطين الأيسر ، 60 صورة التقطت حقن آخر دقيقة. D) يظهر منقاري القناة الشوكية المركزية في ICV حقن الجرو مع الأزرق التريبان في برنامج تلفزيوني على البطين الأيسر ، 12 صورة التقطت حقن آخر ساعة.
الشكل 2. مظاهرات الرابع من الحقن PDN2 ناجحة في الفئران. التخطيطي) من الوريد للاستخدام حقن الوجه الرابع باء) الجرو الرابع حقن الصبغة الخضراء في برنامج تلفزيوني مقارنة مع الامم المتحدة وحقن littermate ، صور تؤخذ الحقن آخر على الفور.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بحث باستخدام نماذج الماوس من المرض وغالبا ما يتطلب ادارة المخدرات أو المواد الأخرى لحديثي الولادة. في هذا الفيديو ، ونحن لشرح خطوة خطوة من خلال إجراءات تشمل نوعين من الاستراتيجيات الحقن التي يمكن استخدامها لاستهداف الجهاز العصبي المركزي : 1) الحقن المباشر في الجهاز العصبي المركزي التي تستخدم intracerebroventricular (ICV) الحقن ، أو 2) رابعا الحقن التي تستهدف / الزمانية الوريد الوجهي. توقيت هذه الحقن هي ذات أهمية كبيرة. منذ الحقن ICV هي مرفوعة ، يجب أن تكون طيعة الجمجمة نسبيا. هذا ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أشكر جون مارستون لخبراء تربية الحيوان ، والدكتور ماركو Passini ألف لتقديم المساعدة التقنية في المراحل الأولى من هذا المشروع. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد القومية للصحة أن CLL (R01NS41584 ؛ R01HD054413).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات (اختياري) |
| الخضراء صبغ الغذاء | مكورميك | ن / أ | يجب أن تتم تصفيته |
| هاميلتون الزجاج الحقنة (100 ميكرولتر) | سيغما Aldrick | 20702 | |
| LuerMxF نايلون الموضوع نمط الابيض | قطع صغيرة ، وشركة | VPLF - LC78 - 1-25 | |
| إبر تحت الجلد قياس غرامة | بوبر | 7111 | الحجم : 33 (SWG) × ¼ "(6.35 ملم) |
| وي البصر Transilluminator | Respironics | 1017920 | |
| 2.25X العصابة المكبر | MagEyes | نموذج رقم (5) | حدد التكبير لتناسب التفضيلات الفردية |
المراجع
- Blanchette, M., Fortin, D. Blood-brain barrier disruption in the treatment of brain tumors. Methods Mol. Biol. 686, 447-463 (2011).
- Foust, K. D., Kaspar, B. K. Over the barrier and through the blood: to CNS delivery we go. Cell Cycle. 24, 4017-4018 (2009).
- Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MPS VII mouse brain. Nature. 374, 367-370 (1995).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector. J. Virol. 24, 12382-12392 (2001).
- Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46, 50-54 (2007).
- Sands, M. S., Barker, J. E. Percutaneous intravenous injection in neonatal mice. Lab. Anim. Sci. 49, 328-330 (1999).
- Foust, K. D. Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. Nat. Biotechnol. 28, 271-274 (2010).
- Foust, K. D. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Passini, M. A., Watson, D. J., Wolfe, J. H. Gene delivery to the mouse brain with adeno-associated virus. Methods Mol. Biol. 246, 225-236 (2004).
- Coady, T. H., Lorson, C. L. Trans-splicing-mediated improvement in a severe mouse model of spinal muscular atrophy. J. Neurosci. 30, 126-130 (2010).
- Baughan, T. D., Dickson, A., Osman, E. Y., Lorson, C. L. Delivery of bifunctional RNAs that target an intronic repressor and increase SMN levels in an animal model of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 18, 1600-1611 (2009).
- Coady, T. H., Baughan, T. D., Shababi, M., Passini, M. A., Lorson, C. L. Development of a single vector system that enhances trans-splicing of SMN2 transcripts. PLoS One. 3, e3468-e3468 (2008).
- Dickson, A., Osman, E., Lorson, C. A. Negatively-Acting Bifunctional RNA Increases Survival Motor Neuron in vitro and in vivo. Hum. Gene. Ther. 19, 1307-1315 Forthcoming.
- Mattis, V. B., Ebert, A. D., Fosso, M. Y., Chang, C. W., Lorson, C. L. Delivery of a read-through inducing compound, TC007, lessens the severity of a spinal muscular atrophy animal model. Hum. Mol. Genet. 18, 3906-3913 (2009).
- Williams, J. H. Oligonucleotide-mediated survival of motor neuron protein expression in CNS improves phenotype in a mouse model of spinal muscular atrophy. J. Neurosci. 29, 7633-7638 (2009).
- Passini, M. A. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. J. Clin. Invest. 120, 1253-1264 (2010).
- Shababi, M., Glascock, J., Lorson, C. L. Combination of SMN Trans-Splicing and a Neurotrophic Factor Increases the Life Span and Body Mass in a Severe Model of Spinal Muscular Atrophy. Hum. Gene. Ther. 22, 1-10 (2010).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
