مقالة منهجية

تحليل الانصهار الغشاء بوساطة كمين باستخدام الانصهار خلية الفحص الانزيمي

DOI:

10.3791/4378

⸱

أكتوبر 19, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Louisville School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وضعنا مقايسة الانصهار خلية يحدد مقدار كمين بوساطة الانصهار غشاء من الأحداث تنشيط التعبير من غالاكتوزيداز β-.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفاعلات الفخ (ق oluble N-ethylmaleimide تراعي عامل البروتين إعادة متقبل ttachment) البروتينات على حويصلات (V-الافخاخ) وعلى الأغشية الهدف (T-الافخاخ) تحفيز الخلايا الانصهار الحويصلة 1-4. المقايسات ضرورية لإعادة تشريح آلية وتنظيم الانصهار غشاء كمين بوساطة 5. في خلية الانصهار 6،7 الفحص، يتم التعبير عن البروتينات الفخ ectopically على سطح الخلية. هذه "انقلبت" محرك الخلية البروتينات الفخ خلايا الانصهار، مما يدل على أن الافخاخ تكفي لصهر الأغشية الخلوية. لأنه يعتمد الفحص على خلية الانصهار التحليل المجهري، فمن أقل كفاءة عندما تستخدم لتحليل متعددة V-T-والتفاعلات كمين كميا.

نحن هنا وصف الفحص الجديدة 8 يحدد مقدار كمين بوساطة الأحداث الانصهار خلية تنشيط التعبير من غالاكتوزيداز β-. اثنانوتستخدم عناصر منظومة الجينات التعبير تيت أوف 9 بمثابة نظام قراءات: في transactivator التتراسيكلين التي تسيطر عليها (TTA) ومراسل البلازميد الذي يشفر الجين LacZ تحت سيطرة العنصر التتراسيكلين والاستجابة (TRE-LacZ). نحن بالنقل نقل واكتساب التكنولوجيا في الخلايا COS-7 التي تعبر عن انعكاس V-كمين البروتينات على سطح الخلية (الخلايا V-) وبالنقل TRE-LacZ في الخلايا COS-7 التي تعبر عن انعكاس تي في كمين البروتينات على سطح الخلية (الخلايا التائية) . التي تعتمد على الانصهار كمين للV-والنتائج (خلايا تي) في ملزمة من نقل واكتساب التكنولوجيا لTRE، تفعيل الترانسكربتي من LacZ والتعبير عن غالاكتوزيداز β-. وكميا نشاط غالاكتوزيداز β-اللونية باستخدام طريقة الامتصاص من قبل في 420 نانومتر.

غشاء الحويصلة البروتينات المرتبطة (الرقعات) هي V-الافخاخ الموجودة في حجرات بعد غولجي مختلف حويصلي 10-15. بالإعراب عن الرقعات 1 و 3 و 4 و 5 و 7 و 8 على نفس المستوى، على قارنا الانصهار الغشاءأنشطة باستخدام الانصهار خلية الأنزيمية فحص. القياس الطيفي على أساس هذا الفحص يوفر النهج الكمي لتحليل كمين بوساطة الانصهار غشاء والإنتاجية العالية للدراسات.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. زراعة الخلايا وترنسفكأيشن

  1. يتم استزراع الخلايا COS-7 في متوسطة Dulbecco معدلة النسر (DMEM) تستكمل مع 4.5 جم / لتر والجلوكوز 10٪ مصل بقري جنيني (FBS).
  2. ويتم ترنسفكأيشن مع البلازميد Lipofectamine وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (إينفيتروجن).

2. المجهري مضان من تحليل سطح الخلية التعبير الفخ

  1. والمصنف في اليوم السابق ترنسفكأيشن، 3 × 10 4 COS-7 الخلايا على الزجاج معقمة coverslips 12-مم (فيشر العلمية) الواردة في 24 لوحات جيدة.
  2. ل V-خلايا في كل ميكروغرام جيدا 0.25، من البلازميد الذي يشفر نقل واكتساب التكنولوجيا (pTet أوف، CLONTECH) وبنسبة 0.25 ميكروغرام cotransfected من البلازميدات التي تعبر عن انعكاس الرقعات.
  3. لخلايا تي في كل بئر، وcotransfected 0،25 ميكروغرام من الترميز البلازميد TRE-LacZ (PBI-G، CLONTECH) بنسبة 0.25 ميكروغرام لكل من البلازميدات التي تعبر عن انعكاس SNAP-25 وsyntaxins 1 أو 4.
  4. بعد 24 ساعة ريتم إصلاح ransfection، والخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني + + (PBS تستكمل مع 0.1 غرام / لتر CaCl 2 و 0.1 غ / لتر MgCl 2) لمدة 10 دقيقة، ومنعت بعد ذلك في FBS 10٪ في برنامج تلفزيوني + + لمدة 30 دقيقة.
  5. يتم تحضين الخلايا مقابل 1.5 ساعة مع 9E10 مكافحة Myc على الأجسام المضادة أحادية المنشأ (أنيق طاف ورم هجين الثقافة).
  6. بعد أربعة يغسل مع PBS + +، يتم تحضين الخلايا ل1 ساعة مع FITC، مترافق الأجسام المضادة الثانوية (جاكسون المختبرات Immunoresearch) حتى التخفيف 1:500.
  7. بعد أربعة يغسل مع PBS + +، هي التي شنت الخلايا المسمى في إطالة الذهب كاشف antifade (إينفيتروجن).
  8. يتم جمع الصور مبائر على مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر أوليمبوس. تتم معالجة الصور مع برنامج أدوبي فوتوشوب.

3. FACS تحليل سطح الخلية التعبير الفخ

  1. والمصنف في اليوم السابق ترنسفكأيشن، 2 × 10 5 خلايا COS-7 في كل بئر من 6 لوحات جيدا.
  2. بعد 24 ساعة هيئة تنظيم الاتصالاتnsfection مع انقلبت الفخ، pTet خارج البلازميدات وPBI-G، يتم إصلاح الخلايا مع 1٪ في بارافورمالدهيد PBS + + لمدة 15 دقيقة، ومنعت بعد ذلك في FBS 10٪ في برنامج تلفزيوني + + لمدة 15 دقيقة.
  3. يتم تحضين الخلايا مع 9E10 مكافحة Myc على الأجسام المضادة أحادية المنشأ لمدة 60 دقيقة.
  4. بعد ثلاث غسلات مع PBS + +، وصفت الخلايا مع أجسام مضادة FITC، مترافق الثانوية (1:200 التخفيف) لمدة 45 دقيقة.
  5. بعد ثلاث غسلات مع PBS + +، يتم كشط الخلايا قبالة لوحات مع مكشطة الخلية.
  6. ويتم تحليل الخلايا 15000 باستخدام قياس التدفق الخلوي FACSCalibur (BD العلوم البيولوجية). يتم الحصول على كثافة مضان يعني من كل عينة باستخدام CellQuest برو البرمجيات.

4. الأنزيمية فحص خلية الانصهار

  1. والمصنف في اليوم السابق ترنسفكأيشن، 1.2 × 10 6 خلايا COS-7 في كل طبق زراعة الأنسجة 100-مم، و 2 × 10 5 والمصنف COS-7 خلايا في كل بئر من 6 لوحات جيدا.
  2. ل V-الخلايا، 0،5 حتي 5 ميكروغرام لكل من flippوcotransfected إد الرقعه البلازميد مع 5 ميكروغرام من pTet أوف في الخلايا في كل طبق الثقافة 100-مم. وcotransfected خلايا التحكم مع pcDNA3.1 ناقلات الفارغة (+) وpTet خارج. لمنع N-بالغليكوزيل من الرقعات 1 و 4 و 5 و 7 و 8، tunicamycin (10 ميكروغرام / مل) يتم تضمينها في المتوسط ​​خلال زراعة الخلايا ترنسفكأيشن.
  3. انقلبت لخلايا تي في كل بئر من لوحات 6 جيدا، 1 ميكروغرام من انقلبت SNAP-25 البلازميد وcotransfected PBI-G مع 0.5 ميكروغرام من syntaxin1 البلازميد أو 0.05 ميكروغرام من syntaxin4 انقلبت البلازميد.
  4. 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وفصل الخلايا من V-الأطباق الثقافة مع خلية التفكك الاحتياطي خالية من إنزيم (إينفيتروجن). يتم عد الخلايا منفصلة مع عدادة الكريات ومعلق في HEPES مخزنة DMEM تستكمل مع FBS 10٪، 6.7 ميكروغرام / مل و 0.67 tunicamycin DTT ملم.
  5. تضاف 4،8 × 10 5 خلايا معلق V-إلى كل بئر تحتوي بالفعل على الخلايا التائية.
  6. بعد الفئران ساعة 6 أو 12 أو 24 37 ° C CO في 5٪ 2 ، يتم قياس التعبير عن غالاكتوزيداز β-باستخدام الفحص إنزيم β-غالاكتوزيداز النظام مع العازلة يزيس مراسل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (Promega). لفترة وجيزة، وغسلها مرتين مع الخلايا PBS، و lysed ثم في المخزن المؤقت مراسل يزيس. لست] خلية مختلطة مع حجم مساو من الاحتياطي الفحص × 2. كعنصر تحكم فارغة، يتم خلط الاحتياطي يزيس مع مراسل × الاحتياطي الفحص 2.
  7. بعد 90 دقيقة، يتم إيقاف رد فعل اللونية بإضافة 1 كربونات الصوديوم M.
  8. يتم قياس الامتصاصية في 420 نانومتر باستخدام 100-40 HITACHI الطيف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لوضع الانصهار خلية الكمية الفحص، ونحن الاستفادة من تفعيل النسخي وقوية من قبل ملزمة للنقل واكتساب التكنولوجيا لTRE. في حالة عدم وجود نقل واكتساب التكنولوجيا، نسخ من الجين LacZ في TRE-LacZ صامت. عندما نقل واكتساب التكنولوجيا موجودة، فإنه يربط إلى TRE وينشط النسخ من LacZ. ويظهر الشكل 1 مخطط انسيابي للفحص خلية الانصهار الأنزيمية. وتقاس نقل واكتساب التكنولوجيا في الخامس والخلايا التي تقاس صريحة V-كمين البروتينات على سطح الخلية، وTRE-LacZ<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انصهار الخلية الأصلية مقايسة 6 يحدد كمين بوساطة الأحداث الانصهار خلية بواسطة المجهر مضان. نحن هنا وصف لفحص مبتكرة يحدد مقدار كمين بوساطة الأحداث الانصهار خلية تنشيط التعبير من غالاكتوزيداز β-وقياس الطيفي. باستخدام هذا الاختبار، نحن نحلل بشكل روتيني 15 حتي 20-V و T-كمين مجموعات في تجربة واحدة. باستخدام التدفق الخلوي لقياس التعبير في كمين سطح الخلية، ونحن عاير مستويات التعبير عن الرقعات وقدراتها مقارنة الانصهار غشاء (أرقام 2 و 4). وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام الانصهار خل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم هذا العمل من جانب صناديق بدء التشغيل من جامعة لويزفيل وCA135123 من المعاهد الوطنية للصحة (لCH).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف والمعدات شركة كتالوج رقم
DMEM إينفيتروجن 12800-017
COS-7 خلايا ATCC CRL-1651
tunicamycin سيغما الدريخ T7765-5MG
pTet أوف Clontech K1620-A
PBI-G Clontech 6150-1
lipofectamine إينفيتروجن 18324-012
انزيم خالية حل خلية التفكك إينفيتروجن 13151-014
الأرانب الأجسام المضادة لمكافحة قامع TET بولكلونل ميليبور AB3541
FITC، مترافق المضادة للحمار الماوس مفتش (H + L) JACkson ImmunoResearch 715-095-150
ليزر متحد البؤر المسح المجهر OLYMPUS FV1000
FACSCalibur تدفق عداد الكريات BD العلوم البيولوجية
β-غالاكتوزيداز نظام الفحص إنزيم مع العازلة يزيس مراسل Promega E2000
نموذج UV-VIS 100-40 الطيف HITACHI C740843

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
  2. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
  3. Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
  5. Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  6. Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
  7. Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
  8. Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238(2010).
  9. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
  10. Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
  11. McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
  12. Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
  13. Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
  14. Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
  15. Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Tet Off VAMP Syntaxin COS 7

مقالات ذات صلة