مقالة منهجية

المفاعل الحيوي Picoliter Microfluidic لتحليل الخلية الميكروبية أحادية الخلية: التصنيع وإعداد النظام والتشغيل

DOI:

10.3791/50560

⸱

ديسمبر 6, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Bio- and Geosciences, IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Juelich GmbH

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، يتم تقديم تصنيع وإعداد وتشغيل أساسي لمفاعل حيوي بيكوليتر ميكروسويديك (PLBR) لتحليل الخلية المفردة للكائنات الحية الدقيقة بدائية النواة. تم تحليل الكائنات الحية الدقيقة ذات الصلة صناعيا كدليل على المبدأ مما يسمح برؤى حول معدل النمو والتشكل وعدم تجانس النمط الظاهري خلال فترات زمنية معينة ، وهو أمر يصعب تحقيقه بالطرق التقليدية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، يتم وصف التصنيع والإعداد التجريبي والتشغيل الأساسي للمفاعل الحيوي الموائع الدقيقة (PLBR) الذي تم إدخاله مؤخرا بالتفصيل. يمكن استخدام PLBR لتحليل البكتيريا المفردة والمستعمرات الدقيقة للتحقيق في الأسئلة المتعلقة بالتكنولوجيا الحيوية والميكروبيولوجية المتعلقة ، مثل نمو الخلايا ، والتشكل ، والاستجابة للإجهاد ، وإنتاج المستقلب أو البروتين على مستوى الخلية الواحدة. يتميز الجهاز بتدفق مستمر للوسائط يتيح ظروفا بيئية ثابتة لدراسات الاضطراب ، ولكنه بالإضافة إلى ذلك يسمح بتغييرات متوسطة سريعة بالإضافة إلى ظروف متذبذبة لتقليد أي حالة بيئية مرغوبة. لتصنيع الأجهزة ذات الاستخدام الفردي ، كانت رقاقة السيليكون التي تحتوي على هياكل SU-8 بحجم ميكرومتر فرعي بمثابة قالب النسخ المتماثل لصب بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان السريع. تم قطع الرقائق وتجميعها وتوصيلها وإعدادها على مجهر عالي الدقة ومؤتمت بالكامل مناسب للتصوير بفاصل زمني ، وهي أداة قوية لتحليل الخلايا المكانية والزمانية. هنا ، تم زرع كائن منصة التكنولوجيا الحيوية Corynebacterium glutamicum في PLBR وتمت متابعة نمو الخلايا والتألق داخل الخلايا على مدار عدة ساعات لكشف عدم تجانس السكان المعتمد على الوقت على مستوى الخلية المفردة ، وهو أمر غير ممكن مع طرق التحليل التقليدية مثل قياس التدفق الخلوي. إلى جانب الأفكار حول تصنيع الجهاز ، علاوة على ذلك ، يتم توضيح تحضير الزراعة المسبقة ، وتحميل البكتيريا ، ومحاصرتها ، وزراعة PLBR للخلايا المفردة والمستعمرات. ستضيف هذه الأجهزة بعدا جديدا في البحوث الميكروبيولوجية لتحليل الظواهر المعتمدة على الوقت للبكتيريا المفردة تحت رقابة بيئية مشددة. نظرا لعملية التصنيع البسيطة والقصيرة نسبيا ، يمكن تكييف التكنولوجيا بسهولة في أي مختبر للموائع الدقيقة وتصميمها ببساطة لتلبية الاحتياجات المحددة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الفحص المجهري بفاصل زمني أداة قوية لدراسة الخلايا الحية في الجسم الحي1. وفي الوقت نفسه ، يتم تطبيق منصات الفحص المجهري المؤتمتة بالكامل المتوفرة تجاريا بما في ذلك تعويض انجراف التركيز المستحث حراريا بشكل شائع في البحث البيولوجي لدراسة الظواهر المعتمدة على الوقت ، بدءا من أبحاث الخلايا السرطانية والخلايا العصبية على هندسة الأنسجة والدراسات الديناميكية مع الخميرة المفردة أو الخلايا البكتيرية2-6.

< p class = "jove_content" >عادة ما يتم تطبيق ألواح الآبار الشفافة أو منصات أجار أو ببساطة شرائح الفحص المجهري لتوفير بيئات زراعة الخلايا أثناء التصوير بفاصل زمني7. على الرغم من أنها مناسبة لأبحاث معينة ، إلا أن هذه الأنظمة البسيطة لها سيطرة محدودة للغاية على الظروف البيئية ولا تسمح باضطرابات أكثر تعقيدا أو تغييرات متوسطة محددة جيدا وسريعة. تم طرح أجهزة رقائق الموائع الدقيقة التي تستخدم لمرة واحدة والتي يتم إنتاجها عن الإنتاج الضخم في السوق مؤخرا ولكنها مصممة في الغالب لأنواع الخلايا حقيقية النواة الأكبرحجما 4. على الرغم من أنه يمكن متابعة النمو ، إلا أن تحقيقات النمو المحددة جيدا فيما يتعلق ، على سبيل المثال ، بمحاصرة الخلايا الدقيقة ، وحجم المستعمرة ، واتجاه النمو ، والقدرة على إزالة الخلايا محدودة. الموائل والمفاعلات الدقيقة ، التي يتم فيها زراعة الخلايا البكتيرية في بيئات ثلاثية الأبعادتم تطويرها من 8 إلى 10 ، لها عيوب عند التعامل مع الدراسات الكمية على مستوى الخلية الواحدة. بينما يمكن تحليل عدم التجانس الكلي للسكان ، لا يمكن تحديد العديد من معلمات الخلية بدقة بدقة من خلال دقة الخلية المفردة لأن النمو لا يقتصر على الطبقات الأحادية.

< p class = "jove_content"> أدى هذا القيد إلى تطوير أنظمة دقيقة تمكن من زراعة الخلايا في قنوات وموائل محددة جيدا مع نمو الخلايا في طبقات أحادية مسطحة بدقة خلية واحدة وتحكم صارم بشكل خاص في إمدادات الوسائط والظروف البيئية6،11،12. تم عرض أمثلة قليلة على أنظمة الموائع الدقيقة لزراعة الخلاياالبكتيرية 12-14. تظهر البكتيريا عادة معدلات نمو سريعة جدا وتتطلب هياكل موائع دقيقة في حدود بضعة ميكرومترات وأقل ، خاصة عندما تكون الطبقات الأحادية للخلية مطلوبة للفحص المجهري. كيمر وآخرون. أظهر النمو والانتشار لسلالات الإشريكية القولونية في المناظر الطبيعية الدقيقة15،16. نظرا لأنهم كانوا مهتمين بديناميكيات السكان ، لم يحققوا بدقة الخلية الواحدة.

< p class = "jove_content">لقد قمنا بتطوير المفاعل الحيوي picoliter (PLBR) 13 ، والذي يتم تطبيقه حاليا للتحقيق في مؤشرات أداء التكنولوجيا الحيوية المختلفة مثل النمو17 وتحليل الإنتاجية المقترنة بالتألق على مستوى الخلية المفردة18،19. يسمح جهاز الموائع الدقيقة الحالي بالتحكم في المفاعل البيئي بحجم ثقافة محدد يبلغ حوالي بيكوليتر واحد ومراقبة مستمرة لخلية واحدة في وقت واحد. بالمقارنة مع أنظمة الصناديق أحادية الطبقةالمفتوحة 11،14 ، حيث يكون أحد الجانبين مفتوحين لقناة إمداد الوسائط ، يسمح PLBR بالاصطياد والاستزراع المتحكم فيه. يسمح التصميم بزراعة البكتيريا على المدى الطويل دون التعرض لخطر تكوين عدة مستعمرات مجاورة مجموعة كبيرة واحدة. علاوة على ذلك ، يشتمل النظام على مناطق زراعة بارتفاع 1 ميكرومتر (بترتيب قطر الخلية) لتقييد نمو البكتيريا في طبقات وحيدة الخلية. في المقابل ، تكون قنوات الإمداد أعمق 10 أضعاف لتقليل المقاومة الهيدروليكية.

< p class = "jove_content">بالمقارنة مع أنظمة زراعة الدفعاتالمصغرة 20 ، يسمح النظام الحالي بالزراعة بمعايير بيئية ثابتة بسبب التدفق المستمر للوسائط. علاوة على ذلك ، يمكن التحكم بسهولة في المعلمات البيئية مثل التركيب المتوسط ودرجة الحرارة ومعدلات التدفق وتبادل الغاز وتغييرها في غضون ثوان. يسمح هذا بإجراء تحقيقات محددة للاستجابة الخلوية للتغيرات البيئية فيما يتعلق على سبيل المثال بتوافر المغذيات أو محفزات الإجهاد. إن الطلب على أحجام الوسائط المخفضة ، أي في نطاق بضعة ميكرولتر فقط ، يمكن الباحثين من إجراء دراسات جديدة ، على سبيل المثال اضطراب الخلايا أثناء التصوير بفاصل زمني مع طاف للتجارب واسعة النطاق التي تكشف استجابة الخلية في ظل هذه الظروف البيئية المحددة17. يوفر المفاعل الحيوي للباحثين نظاما قويا يتحكم بإحكام في الظروف الفيزيائية الحيوية ويتم تشغيله باستخدام مضخات حقنة عالية الدقة ومجهر المجال الساطع الآلي والفحص المجهري الفلوري للتصوير بفاصل زمني. هنا ، نبلغ عن بروتوكول كامل بما في ذلك تصميم الجهاز والتصنيع والتطبيقات المثالية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تصنيع الرقاقة

  1. صمم جهاز الموائع الدقيقة الذي يحتوي على مداخل ومنافذ وقنوات رئيسية و PLBRs (الشكل 1 أ) باستخدام برنامج CAD.
  2. يتكون التصميم المقدم في هذا البروتوكول (الشكل 2) من مدخلين للبذر ، ومولد متدرج لخلط ركيزتين مختلفتين ، ومخرج واحد ، وستة مصفوفات من PLBRs. تحتوي كل مصفوفة على 5 PLBRs ، مما ينتج عنه 30 PLBRs متوازية داخل جهاز واحد ميكروفيليديك.
  3. قم بإنشاء قناع ضوئي للطباعة الحجرية يحتوي على تخطيطات الرقاقة المطلوبة (الشكل 1 ب). تم إنتاج القناع الضوئي داخليا عن طريق كتابة شعاع الإلكترون بدقة دون الميكرون. يتكون القناع المستخدم من طبقة من الكروم على صفيحة زجاجية 5 في2.
    ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية في ظل ظروف غرف الأبحاث من الفئة 100 أو أفضل (يظهر مخطط انسيابي للعملية في الشكلين 3 أ و 3 ب).
  4. نظف رقاقة السيليكون 4 بوصات مع سمكة البيرانا (نسبة 10: 1 من حمض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين) وحمض الهيدروفلوريك لعدة دقائق (تحذير: مواد كيميائية خطرة). اشطفه بالماء منزوع الأيونات (DI) لمدة 10 ثوان تقريبا.
  5. تجفيف الرقاقة لمدة 20 دقيقة عند 200 درجة مئوية.
  6. تدور الطبقة 1 ميكرومتر SU-8 2000.5 مقاومة للضوء على الرقاقة (طبقة 1) (مقاومة 4 مل ، تدور 10 ثوان مع ، v = 500 دورة في الدقيقة ، و a = 100 دورة في الدقيقة / ثانية ، تدور 30 ثانية مع v = 1,000 دورة في الدقيقة و a = 300 دورة في الدقيقة / ثانية).
  7. ضع الرقاقة المطلية على لوح تسخين عند 95 درجة مئوية للتخلص من المذيبات الزائدة (1.5 دقيقة عند 65 درجة مئوية ، و 1.5 دقيقة عند 95 درجة مئوية ، و 1 دقيقة عند 65 درجة مئوية ؛ من الناحية المثالية استخدم لوحين تسخين).
  8. أدخل قناع ضوئي من الطبقة 1 (هنا مناطق الاصطياد لمفاعلات البيكوليتر) ورقاقة داخل محاذاة القناع وقم بتعريض الرقاقة إلى 350-400 نانومتر (ملامسة الفراغ ، 64 مللي جول / سم² ، ر = 3 ثوان ، أنا = 7 ميجاوات / سم²).
  9. قم بإجراء خبز ما بعد التعرض على لوح تسخين عند 95 درجة مئوية لبدء بلمرة SU-8 (دقيقة واحدة عند 65 درجة مئوية ، ودقيقة واحدة عند 95 درجة مئوية ، ودقيقة واحدة عند 65 درجة مئوية). ملاحظة: بعد هذه الخطوة يمكن رؤية الهياكل الموجودة في طبقة SU-8.
  10. ضع الرقاقة في حمام مطور SU-8 لمدة 1 دقيقة وانقل الرقاقة إلى حاوية ثانية مع مطور SU-8 الطازج لبضع ثوان.
  11. اشطف الرقاقة في الأيزوبروبانول لإزالة مطور SU-8 والرقاقة الجافة باستخدام تدفق النيتروجين لغزل الرقاقة.
  12. اخبزي الرقاقة لمدة 10 دقائق عند 150 درجة مئوية.
  13. تدور طبقة 9 ميكرومتر SU-8 2010 مقاومة للضوء على الرقاقة (الطبقة الثانية) (الاستغناء عن مقاومة 4 مل ، تدور 10 ثوان مع V = 500 دورة في الدقيقة ، أ = 100 دورة في الدقيقة / ثانية ، وتدور 30 ثانية مع V = 4,000 دورة في الدقيقة ، أ = 300 دورة في الدقيقة / ثانية).
  14. ضع الرقاقة مع SU-8 على لوح تسخين عند 95 درجة مئوية للتخلص من المذيبات الزائدة (15 دقيقة عند 65 درجة مئوية ، 45-60 دقيقة عند 95 درجة مئوية ، و 10 دقائق عند 65 درجة مئوية). ملاحظة: يجب الانتباه إلى التجاعيد والفقاعات. إذا تم تسخين الرقاقة بسرعة تصل إلى 95 درجة مئوية ، فقد يتم تغليف المذيب المتبخر في فقاعات غاز صغيرة.
  15. أدخل قناع ضوئي بالتخطيط المطلوب (هنا القنوات الرئيسية لإمداد المغذيات) والرقاقة في تقويم القناع وعرضها إلى 350-400 نانومتر (اتصال صلب ، 64 مللي جول / سم² ، ر = 10 ثوان ، أنا = 7 ميجاواط / سم²)
  16. قم بإجراء خبز ما بعد التعرض على لوح تسخين عند 95 درجة مئوية لإنهاء بلمرة SU-8 (5 دقائق عند 65 درجة مئوية ، 3:30 دقيقة عند 95 درجة مئوية ، 3 دقائق عند 65 درجة مئوية). ملاحظة: بعد هذه الخطوة يمكن رؤية الهياكل الموجودة في طبقة SU-8.
  17. ضع الرقاقة في حمام مطور SU-8 لمدة 45 ثانية ، وانقل الرقاقة إلى حاوية ثانية مع مطور SU-8 جديد وقم بتطويرها لمدة 60 ثانية.
  18. اشطف الرقاقة لمدة 20 ثانية بالأيزوبروبانول لإزالة أي بقايا مطور SU-8 ورقاقة جافة باستخدام النيتروجين المضغوط.
  19. أخيرا ، اخبزي الرقاقة بقوة على حرارة 150 درجة مئوية. نتيجة لذلك ، يتم الحصول على الرقاقة النهائية (الشكل 1C) ، والتي سيتم استخدامها كقالب رئيسي لقولبة PDMS.
  20. قم بإجراء قياسات مقياس البروفيلومتر (الشكل 3C) للتحقق من صحة ارتفاعات هيكل SU-8. ملاحظة: قد تؤدي عدم الدقة في ارتفاع الهيكل إلى عدم كفاءة احتجاز الخلايا أو فقدان الخلايا أثناء الزراعة.
فئة < p = "jove_title" >2. تصنيع رقاقة Polydimethylsiloxane

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التالية بشكل مثالي في ظل ظروف التدفق الصفحي لمنع جزيئات الغبار من التداخل مع إجراء التصنيع (يظهر مخطط انسيابي للعملية في الشكل 4).

  1. تحضير خليط من قاعدة بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) وعامل المعالجة بنسبة 10: 1. تخلط بعناية حتى يتم الحصول على محلول متجانس يبدو معتما. قم بإعداد القدر المطلوب لارتفاع الطبقة المطلوب (هنا 3 مم).
  2. قم بإزالة خليط PDMS لمدة 30 دقيقة تقريبا تحت فراغ طفيف حتى تختفي جميع الفقاعات.
  3. قم بإعداد جهاز التشكيل (أو طبق بتري) برقائق SU-8 المناسبة واسكب خليط PDMS فيه (الشكل 1 د).
  4. اخبزي PDMS لمدة 3 ساعات عند 80 درجة مئوية في الفرن.
  5. انزع لوح PDMS بعناية من الرقاقة. قطع اللوح إلى رقائق مفردة باستخدام مشرط نظيف وحاد.
  6. اغسل الرقائق في حمام n-pentane لمدة 90 دقيقة ، متبوعا بحمامين لغسيل الأسيتون (90 دقيقة لكل منهما). جفف الرقائق طوال الليل لإزالة أي بقايا مذيبات. تحذير: قم بإجراء غسيل PDMS تحت غطاء الدخان. ملاحظة: أثناء غسل n-pentane ، تتم إزالة المونومرات والثنائيات من PDMS المعالج وقد يتضاعف حجم الرقاقة مؤقتا أثناء إجراء الغسيل.
  7. قم بتخزين رقائق PDMS الموائع الدقيقة في حاويات قريبة حتى التجربة النهائية.
  8. قبل التجربة مباشرة ، قم بعمل فتحات المدخل والمخرج في شريحة PDMS باستخدام إبرة (أو ثقب) بقطر أصغر قليلا من الموصلات المستخدمة لتوصيل الأنابيب بشريحة PDMS.
  9. قم بتنظيف شريحة PDMS الموائع الدقيقة بعناية باستخدام الأيزوبروبانول واستخدم شريطا لاصقا لإزالة أي جزيئات غبار قد تلتصق بجانب PDMS المنظم. استخدم الشريط اللاصق عدة مرات حتى لا يمكن رؤية أي جسيم على الشريحة.
  10. قم بتنظيف شريحة زجاجية رفيعة 170 ميكرومتر باستخدام الأسيتون والأيزوبروبانول على التوالي. أخيرا ، نظف بالماء منزوع الأيونات وجففه بالنيتروجين المضغوط.
  11. قبل تنشيط البلازما ، قم بتسخين منظف البلازما وقم بتشغيل البلازما لمدة 300 ثانية تقريبا. شريحة زجاجية مؤكسدة بالبلازما ورقاقة PDMS (الطاقة 50 واط ، الوقت = 25 ثانية ، معدل تدفق الأكسجين = 20 sccm).
    12. قم
  12. بمحاذاة PDMS والشريحة الزجاجية قبل الترابط. أخيرا ، ضع شريحة PDMS بعناية على الشريحة الزجاجية (الشكل 1E). سوف يرتبط PDMS والزجاج في غضون ثوان. ملاحظة: لا تدفع بالملاقط على الجزء العلوي من شريحة PDMS أثناء عملية الترابط. قد يؤدي هذا إلى ما يسمى بانهيار سقف القنوات والهياكل الصغيرة.
  13. من أجل تقوية الرابطة ، اخبز شريحة زجاج PDMS النهائية لمدة 10 ثوان عند 80 درجة مئوية.
< ص الفئة = "jove_title" >3. تحضير الثقافة البكتيرية

ملاحظة: يجب تحضير جميع المزارع في وسط مفلتر معقم لمنع تراكم الجسيمات غير المرغوب فيها ، والتي قد تتداخل أثناء الزراعة.

  1. استخدم صفيحة أجار تحتوي على الكائنات الحية المرغوبة (هنا ، C. glutamicum ATCC 13032) وقم بتلقيح مستعمرة واحدة في 20 مل من وسط BHI الطازج ، واحتضنه طوال الليل (≈ 8-14 ساعة) عند 30 درجة مئوية على شاكر دوار (120 دورة في الدقيقة).
  2. انقل 10 ميكرولتر من الزراعة المسبقة إلى الوسط المطلوب (هنا CGXII21) والذي سيتم استخدامه أثناء زراعة الموائع الدقيقة واترك الخلية تنمو طوال الليل عند 30 درجة مئوية على شاكر دوار (120 دورة في الدقيقة).
  3. انقل الكمية المطلوبة من تعليق الخلية (بين 10-500 ميكرولتر ، اعتمادا على بداية التجربة) إلى الوسط المطلوب (هنا CGXII21) والذي سيتم استخدامه أثناء زراعة الخلايا الموائع الدقيقة. ملحوظة: الأفضل هو استخدام الخلايا من المرحلة اللوغاريتمية المبكرة للبذر. بالنسبة لزراعة C. glutamicum ، كانت أفضل كثافة بصرية (OD600) للبذر بين 0.5-2.
  4. انقل 1 مل من المزرعة البكتيرية إلى أنبوب معقم سعة 2 مل. ملاحظة: يجب أن يتم ذلك مباشرة بعد تجميع شريحة PDMS الموائع الدقيقة لتقليل وقت النقل بين قارورة الاهتزاز وزراعة الموائع الدقيقة. عادة ما يكون وقت النقل حوالي 15 دقيقة ويجب أن يظل صغيرا قدر الإمكان لمنع التأثير على التمثيل الغذائي الناجم عن الحد من الأكسجين وتغيرات درجات الحرارة.

4. الإعداد التجريبي

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات باستخدام مجهر مقلوب.

  1. ابدأ حاضنة المجهر قبل ساعتين من التجربة لتسخين النظام. ملاحظة: يجب أن يكون الفحص المجهري مزودا بحاضنة كاملة الحجم للتحكم في درجة الحرارة وتدفق الغاز إذا رغبت في ذلك. التحكم الإضافي في الرطوبة ليس ضروريا لأن نظام الرقائق مملوء باستمرار بالوسائط.
  2. افتح نظام الحاضنة ، وحدد الهدف المطلوب وإذا لزم الأمر أضف زيت الغمر إلى الهدف.
  3. قم بتركيب الشريحة داخل حامل الرقائق. إذا لزم الأمر ، قم بتثبيت اللوحة الزجاجية بشريط لاصق لتجنب رقاقة أي حركة أثناء تشغيل المرحلة.
  4. قم بتوسيط العينة على المجهر وركز على مصفوفات PLBR.
  5. قم بتوصيل المداخل والمنافذ بالأنابيب المناسبة (الشكل 1F). قم بتوصيل الأنبوب بخزان النفايات. يمكن رؤية شريحة تمثيلية في الشكل 4D.
  6. أدخل المحاقن في المضخات وابدأ تدفق الوسائط. استخدم محلول طلاء متوسط أو عازل أو إذا لزم الأمر واشطف قنوات الموائع الدقيقة لمدة 1 ساعة تقريبا. ملاحظة: يستخدم محلول الطلاء لطلاء جدران القناة لمنع التصاق الخلايا غير المحدد.
  7. بالنسبة للإشريكية القولونية ، يتم استخدام محلول 0.1٪ من BSA لتغطية جدران القناة. بالنسبة إلى C. glutamicum لا يلزم الطلاء. بعد إجراء الطلاء ، اغسل الرقاقة ببذر الخلايا المسبق المتوسط.
  8. قبل بذر الخلايا وزراعتها ، تأكد من عدم حدوث تسرب وأن درجة الحرارة ثابتة.
< p class = "jove_title" >5. بذر الخلايا البكتيرية في جهاز الموائع الدقيقة

  1. تأكد من توفر محاليل البكتيريا المرغوبة في محاقن مناسبة متصلة بالأنابيب.
  2. افصل المخزن المؤقت أو محلول الطلاء وقم بتوصيل تعليق الخلية بالشريحة. لتقليل حجم الموت ، فقاعات الهواء غير المرغوب فيها وتقليل الوقت التجريبي ، قم بتغيير الإبرة الكاملة وكذلك الأنابيب ، بدلا من المحاقن فقط.
    3. قم
  3. بغرس تعليق الخلية في القنوات بمعدل تدفق حجمي يبلغ 200 nl / min حتى تمتلئ معظم PLBRs بالكمية المطلوبة من الخلايا (الشكل 5 أ). ملاحظة: تعتمد نتائج البذر المثلى على السلالة البكتيرية ، OD600 ، ووسط نمو ما قبل الزراعة. يجب تكييف هذه المعلمات لزيادة كفاءة الاصطياد والوقت حتى يتم احتجاز عدد كاف من الخلايا في هياكل المفاعل. ل C. glutamicum ، عادة ما تم استخدام تعليق خلية OD600 0.5-2 ؛ بالنسبة للإشريكية القولونية ، كان OD600 بين 0.5-1.
  4. إذا تم ملء عدد صغير فقط من PLBRs ، فقم بزيادة معدل التدفق إلى 800-1,200 nl / دقيقة.
  5. افصل تعليق الخلية وقم بتوصيل وسط النمو بالرقاقة (الشكل 5 ب). تأكد من عدم إدخال فقاعة هواء أثناء التغيير المتوسط. Perfuse مع وسائط النمو الجديدة عند 100 nl / دقيقة.
< p class = "jove_title" >6. التصوير بفاصل زمني

  1. حدد PLBRs محددة للتصوير بفاصل زمني. عادة ما يتم اختيار PLBRs التي تحتوي على خلية أم واحدة في بداية التجربة. يعتمد عدد مناطق الاهتمام التي يمكن التحقيق فيها في تجربة واحدة على معدل الإطارات المطلوب والإعداد المجهري.
  2. حدد معدل إطارات مناسبا اعتمادا على عدد PLBRs. تأكد من أن المجهر يمكنه التعامل مع المقدار المطلوب من عائد الاستثمار في الفاصل الزمني للفاصل الزمني.
  3. اختر مجموعات المرشحات المناسبة (هنا YFP). أغلق الغالق تلقائيا أثناء حركة المسرح وبعد كل قياس لقطات متتابعة لمنع تبييض الكروموفور.
  4. قم بتكوين تسلسل المجهر بفاصل زمني وابدأ التجربة.
  5. بعد أن تتضخم جميع PLBRs ، يمكن إيقاف التجربة ، ويمكن التخلص من شريحة PDMS الموائع الدقيقة ويمكن تقييم التجربة.

7. التحليل

ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات التالية أو أجزاء الإجراء يدويا أو عن طريق برامج تحليل الصور مثل ImageJ، وما إلى ذلك.

  1. تحديد PLBRs ذات الأهمية حيث تفي الزراعة بجميع المعايير المطلوبة ، على سبيل المثال عدد الخلايا الأم ، وموضع الخلايا الأم ، وما إلى ذلك.
  2. لتحديد معدل نمو مستعمرة دقيقة واحدة ، احسب عدد الخلايا في كل إطار زمني.
  3. احسب الحد الأقصى لمعدل النمو عن طريق رسم الوقت مقابل ln (رقم الخلية). يمثل منحدر المؤامرة معدل النمو في [1 / ساعة] (انظر الشكل 6).
  4. يعتمد تحليل بيانات التألق بشدة على التجربة التي تم إجراؤها. في هذا التقرير ، تم اختيار مثال لتوضيح عدم التجانس من مستعمرة إلى أخرى ومن خلية إلى أخرى بين المستعمرات الدقيقة المتساوية الوراثة المختلفة (انظر الشكل 7).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فئة

تصنيع الجهاز

< p class = "jove_content" >يتم تصنيع نظام PLBR الموائع الدقيقة بواسطة طبقة واحدة من PDMS مرتبطة بشريحة زجاجية رقيقة مناسبة للفحص المجهري عالي الدقة. يتكون التصنيع من خطوتين رئيسيتين: أولا تصنيع سيد النسخ المتماثل (الأشكال 1 أ و 1 ب و 1ج) وثانيا تصنيع الرقائق (الأشكال 1D و 1E و 1F). وفقا للبروتوكول ، يتم استخدام تقنيات التصنيع الدقيق القياسية للطباعة الحجرية الضوئية لإنشاء القالب الرئيسي. يمكن للمختبرات التي لا تحتوي على مرافق غرفة نظيفة الحصول على قوالب SU-8 الرئيسية المخصصة المتوفرة تجاريا. باستخدام قولبة PDMS المتكررة (الأشكال 1 أ و 1 ب و 1ج) يمكن إنتاج مئات الرقائق التي تستخدم لمرة واحدة. يمكن إجراء صب PDMS وتجميع الرقائق في أي مختبر ولا يتطلب مرافق غرفة نظيفة ، ومع ذلك ، فإن أماكن عمل تدفق الهواء الصفحي مواتية. < p class = "jove_content">تبدأ العملية بتصميم نظام رقاقة الموائع الدقيقة. عادة ما يتم استخدام برنامج CAD لتصميم شريحة الموائع الدقيقة (الشكل 1 أ). بعد CAD ، يتم إنشاء قناع بواسطة كاتب شعاع إلكتروني (الشكل 1 ب) بدقة دون ميكرون. في هذه الدراسة ، تم إنشاء قناع 5 في الكروم والذي تم استخدامه في الطباعة الحجرية لرقاقة SU-8. يتم استخدام رقاقة السيليكون النهائي - SU - 8 لقولبة PDMS (الشكل 1 د). بعد خطوة الخبز ، يتم تقطيع لوح PDMS إلى رقائق يتم ربطها بشكل لا رجعة فيه على الشرائح الزجاجية (الشكل 1E). أخيرا يتم توصيل الأنبوب (الشكل 1F).

يوضح الشكل 2 تصميم نظام الموائع الدقيقة بالتفصيل. يتكون من مدخلين للبذر ، ومولد متدرج لخلط ركائز أو وسائط مختلفة ومخرج واحد. يبلغ طول القنوات الرئيسية 50 ميكرومتر × 10 ميكرومتر (العرض × الارتفاع). يتكون كل جهاز من ستة مصفوفات من PLBRs ، تحتوي كل منها على 5 PLBRs. ينتج عن هذا 30 مفاعلا متوازيا داخل جهاز واحد ميكروفيليديك.

يوضح الشكل 3 الإنتاج الرئيسي للنسخ المتماثل. كما هو موضح بالتفصيل في البروتوكول ، يتم تصنيع أول طبقة SU-8 بواسطة الطباعة الحجرية SU-8 (الشكل 3 أ). يتم تطبيق إجراء مماثل على الطبقة الثانية (الشكل 3 ب). للتحقق من هندسة القناة ، قمنا بالتحقيق في ارتفاع PLBRs والقنوات الرئيسية باستخدام مقياس التجديد. في المثال الموضح في الشكل 3 ج ، تم قياس الطبقة الأولى (طبقة الزراعة). تظهر الطبقة هنا ارتفاعا ثابتا يبلغ 1,200 نانومتر ، وهو مناسب لزراعة C. glutamicum في وسط BHI.

< p class = "jove_content" >يوضح الشكل 4 إجراء قولبة PDMS بدءا من خلط PDMS (الشكل 4 أ) متبوعا بعملية التشكيل (الشكل 4 ب) وأخيرا خطوة الترابط (الشكل 4 ج). يوضح الشكل 4D رقاقة الموائع الدقيقة النهائية التي تتضمن الصفيحة الزجاجية بسمك 170 ميكرومتر ، وشريحة PDMS (ارتفاع 3 مم) مع مداخل ومخارج وإبر فولاذية متصلة بالأنابيب. بعد التجربة ، يمكن التخلص من الشريحة ولا يلزم التنظيف الشامل. علاوة على ذلك ، من السهل تجميعها والتعامل معها. لا يلزم إجراء تعبئة معقدة وصعبة.

مبدأ الجهاز

يوضح الشكل 5 مبدأ عمل نظام المفاعل. يتم غرس الخلايا في جهاز الموائع الدقيقة وتظل الخلايا الفردية محاصرة داخل PLBR ببساطة عن طريق تفاعلات جدار الخلية. نظرا للاختلاف في المقاومة الهيدروديناميكية للقناة و PLBR ، يحدث الحد الأدنى من التدفق داخل PLBR. بعد بذر PLBR (الشكل 5 أ) ، تبدأ مرحلة النمو والمراقبة بالتغيير من محلول البكتيريا إلى وسط النمو (الشكل 5 ب). بعد أن تتضخم PLBRs (الشكل 5C) ، عادة ما يتم إيقاف التجربة ويمكن تحليل صور الفاصل الزمني. بالنسبة لآليات الاصطياد وملف تعريف التدفق داخل PLBR ، تتم إحالة القارئ إلى Grünberger et al.13 لمزيد من التفاصيل.

تحليل معدل النمو

يمكن تطبيق النظام الحالي لدراسة الأنواع البكتيرية المختلفة فيما يتعلق بالمعلمات البيولوجية المختلفة مثل النمو أو التشكل أو إشارة الفلورسنت. في المثال الأول C. glutamicum ، تم استزراع كائن إنتاج ذي صلة صناعيا في ظل ظروف الزراعة القياسية (T = 30 °C ، CGXII medium21). يوضح الشكل 6 أ منحنيات النمو المشتقة من ثلاث مستعمرات دقيقة متساوية الجين. يتم الحفاظ على النمو الأسي حتى تمتلئ PLBRs مما يشير إلى عدم حدوث قيود على العناصر الغذائية. يعرض الشكل 6 ب أربع صور مجهرية بفاصل زمني DIC لمستعمرة C. glutamicum المتنامية.

فئة

تحليل التألق

بالنسبة للفحص المجهري الفلوري أحادي الخلية ، غالبا ما يستخدم الباحثون بروتينات فلورية محددة ، على سبيل المثال GFP أو مشتقاتها ، لإقران نمط ظاهري معين ذي أهمية بمخرجات قابلة للقياس (إشارة فلورسنت). لإثبات قابلية تطبيق PBLR لدراسات الفاصل الزمني القائمة على التألق ، قمنا بالتحقيق في انبعاث مضان C. غلوتاميكوم سلالة تنتج بروتين اندماج YFP-TetR مشفر بالبلازميد تحت سيطرة محفز Ptac (pEKEx2-yfp-tetR) 18،22. في وجود تركيزات محفزة منخفضة (IPTG) ، من المعروف أن التعبير من Ptac يؤدي إلى تباين كبير من خلية إلى أخرى في مجموعات البكتيريا متساوية الجين. بدءا من زراعة مسبقة واحدة ، تم اتباع النمو والتألق أحادي الخلية للعديد من المستعمرات الدقيقة متساوية الجين. كما يتضح من الشكل 7 ، لاحظنا عدم تجانس النمط الظاهري بين المستعمرات الدقيقة المختلفة وعدم التجانس على مستوى الخلية المفردة داخل المستعمرات بدءا من خلية أم واحدة. أظهرت مستعمرة واحدة (الشكل 7 ب ، PLBR 1) أي انبعاث مضان تقريبا ، في حين أظهرت خلايا PLBR 2 انبعاثا مضونا منخفضا بسبب تعبير yfp-tetR القاعدي من محفز Ptac. في PLBR 3 كان انبعاث التألق قويا جدا مقارنة بالمستعمرات الأخرى ولوحظ توزيع واسع للسكان. يوضح هذا المثال قابلية تطبيق PBLR لدراسات الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني. بالمقارنة مع قياس التدفق الخلوي ، حيث يمكن تحديد تألق الخلايا المفردة في نقطة زمنية واحدة ، تسمح الأنظمة الحالية بتتبع الخلايا ودراسة التألق أحادي الخلية في الوقت الفعلي على مدى أجيال عديدة.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-1
الشكل 1.نظرة عامة على عملية إنتاج رقائق PLBR. تصنيع القوالب الرئيسية: بدءا من (أ) التصميم ، (ب) تصنيع قناع الطباعة الحجرية ، و (ج) إنتاج الرقاقة. إنتاج رقائق زجاج PDMS: بدءا من (D) من قولبة PDMS متبوعا ب (E) الزجاج وربط PDMS و (F) تجميع الرقائق النهائي. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-2
الشكل 2. تصميم شريحة PLBR. (أ) رسم CAD لشريحة الموائع الدقيقة بأكملها ؛ (ب) تكبير مواضع التخطيط المختارة: يحتوي المخطط على مدخلين متوسطين (a1) ومولد تدرج مع قنوات خلط (a2) و 6 مصفوفات PLBR متوازية (b1). يظهر b2 PLBR واحد ، وهو مدمج في قناة سائلة بعرض 100 ميكرومتر. يبلغ قطر PLBR الداخلي 40 ميكرومتر وقنوات مغذية بعرض 2 ميكرومتر. يبلغ طول مدخل البذر 40 ميكرومتر. يمثل اللون الوردي الطبقة الأولى (منطقة المحاصرة والزراعة) ويمثل اللون الأزرق الطبقة الثانية (نقل السوائل). < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-3
الشكل 3.رسم توضيحي لعملية تصنيع الرقاقة من طبقتين. (أ) تصنيع الطبقة الأولى التي تحتوي على هياكل محاصرة؛ (ب) تصنيع الطبقة الثانية التي تحتوي على قنوات ومداخل ومخارج سائلة؛ (ج) الملامح السطحية التمثيلية للطبقة الأولى. في هذه الحالة ، كان ارتفاع الطبقة الأولى 1,200 نانومتر ويستخدم لزراعة C. glutamicum في وسط معقد. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-4
الشكل 4.تصنيع الجهاز والرقاقة التمثيلية. رسم توضيحي لعملية صب PDMS: (أ) خلط وتفريغ PDMS. (ب) صب PDMS. (ج) إطلاق القالب وقطعه وترابط الرقاقة. رقاقة نهائية (مستنسخة بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء13): (د) صورة لشريحة PDMS مع مداخل 2 ومخرج واحد ؛ (ه) صورة CAD لست مصفوفات متوازية تحتوي كل منها على 5 مصفوفات PLBR؛ (و) صورة التسويق بالجلوس لواحد PLBR. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-5
الشكل 5. مبدأ عمل نظام PLBR. (أ) مرحلة البذر؛ (ب) مرحلة نمو المستعمرات الدقيقة البكتيرية. (ج) مرحلة الفائض. مستنسخة بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-6
الشكل 6.تحديد معدل نمو C. glutamicum WT المستعمرات الدقيقة. (أ) قطعة نمو لثلاث مزارع PLBR والمنحنيات الأسية الناتجة (الأجزاء المستنسخة بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء) 13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (ب) صور الفاصل الزمني لمستعمرة C. glutamicum المتنامية. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-7
الشكل 7. تحليل قائم على PBLR لعدم التجانس السكاني. يظهر C. glutamicum يعبر عن اندماج yfp-tetR تحت سيطرة محفز Ptac (pEKEx2-yfp-tetR) في غياب المحفز IPTG. (أ) سير العمل التجريبي؛ (ب) ثلاث مستعمرات دقيقة متساوية الجين تظهر عدم التجانس من مستعمرة إلى أخرى وعدم التجانس من خلية إلى خلية؛ (ج) توزيع التألق أحادي الخلية داخل المستعمرات الدقيقة المعنية. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-8
الشكل 8. مسح الصور الإلكترونية لمختلف PLBRs. صور التسويق عبر محرك البحث (SEM) التي تظهر مداخل البذر لتحسين كفاءة التراكب اللوني. (أ) مداخل بذر الجعة (ب) مداخل بذر أصغر (ج) مداخل بذر "مفتوحة" أكبر (د) مدخلان للبذر. <حدود الجدول = "0" cellpadding = "0" cellspacing = "0" العرض = "1276"> <عمود span="4" /> درج مشكلة السبب المحتمل حل < ارتفاع TD = "20" نمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" >تصنيع الرقاقة فقاعات هواء محاصرة في SU-8 أثناء الخبز الناعم زيادة درجة الحرارة بسرعة اخبز في 95 درجة مئوية و 65 درجة مئوية عدة مرات < ارتفاع TD = "20" نمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" >تصنيع الرقاقة هياكل SU-8 المختفية والمكسورة ليس إجراء التصنيع الأمثل ؛ الإجهاد الميكانيكي في هياكل SU-8 تحسين المعلمة مثل وقت الخبز ووقت التعرض < ارتفاع TD = "20" نمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" >تصنيع الرقاقة طبقات SU-8 إلى سماكة طبقة منخفضة أو عالية أو غير متساوية مشكلة أثناء طلاء الدوران تحقق من معلمات المغطي الدوار وظرف الرقاقة < td height = "20" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" > رقاقة الترابط والتجميع انهيار PLBRs معلمات ربط PDMS ليست مثالية ضبط الطاقة ووقت التعرض للبلازما. ووقت الخبز بعد الترابط < td height = "20" نمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" > ربط الرقاقة والتجميع الهياكل والجزيئات المتسخة في PLBRs لم يتم تنظيف الرقاقة بشكل صحيح ضع شريط لاصق لتنظيف الأسطح < td height = "20" نمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" > ربط الرقاقة والتجميع عدم كفاية الترابط الزجاجي PDMS معلمات الترابط ليست مثالية أو غير كافية التنظيف تحقق من إعدادات بلازما الأكسجين تجربة الموائع الدقيقة تسرب السوائل لم يتم ثقب فتحة المدخل / المخرج بشكل صحيح تحسين عملية تثقيب الثقب تجربة الموائع الدقيقة العديد من جزيئات PDMS الصغيرة أثناء التعبئة لم يتم ثقب الثقب بشكل صحيح تحسين عملية تثقيب الثقب ارتفاع <ارتفاع td = "40" النمط = "الارتفاع: 40 بكسل ؛" >تجربة الموائع الدقيقة ، الجانب البيولوجي لا نمو الخلايا بقايا المذيبات من إجراء التنظيف قم بتنظيف الرقاقة على نطاق واسع قبل تحميل الخلية أو ترك المذيب يتبخر قبل الترابط < td height = "20" style = "الارتفاع: 20 بكسل ؛ ">تجربة الموائع الدقيقة ، الجانب البيولوجي معدلات النمو المتغيرة أسباب مختلفة تحقق من ما قبل الزراعة ودرجة الحرارة < td height = "20" style = "الارتفاع: 20 بكسل ؛ ">تجربة الموائع الدقيقة ، الجانب البيولوجي تغيرات مورفولوجيا الخلية أثناء الزراعة قيود المغذيات أو تغير درجة الحرارة تحقق من الحاضنة والتدفق تجربة الموائع الدقيقة ، الجانب الفني الانجراف في الموضع أثناء الفحص المجهري بفاصل زمني تقلبات درجات الحرارة تحقق من ملف تعريف درجة الحرارة والتجارب السابقة حتى لا يوجد تذبذب تجربة الموائع الدقيقة ، الجانب الفني فقدان الخلايا أثناء الزراعة ارتفاع المفاعل قليلا إلى المرتفع تحسين ارتفاع المفاعل تجربة الموائع الدقيقة ، الجانب الفني لا محاصرة ارتفاع مفاعل منخفض جدا تحسين ارتفاع المفاعل

الجدول 1. استكشاف الأخطاء وإصلاحها. يلخص هذا الجدول الجوانب الحرجة والأخطاء الشائعة والحلول الممكنة أثناء العمل التجريبي.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد وصفنا التصنيع والإعداد التجريبي وإجراءات التشغيل ذات الصلة لجهاز PDMS الموائع الدقيقة الذي يحتوي على العديد من (PLBRs) لتحليل الخلية المفردة للبكتيريا.

يسمح التصنيع الدقيق باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة بإجراء تعديلات سريعة لأبعاد الجهاز لمختلف الأحجام وأشكال البكتيريا. نقوم حاليا بتحسين المفاعل الحيوي بيكوليتر فيما يتعلق بزراعة الكائنات الحية الميكروبية المختلفة وإنتاجية الزراعة. من أجل زيادة كفاءة المحاصرة ، فإن هندسة المفاعل أيضا قيد التحسين. يوضح الشكل 8 أربعة أجهزة PLBR جديدة تم التحقق من صحتها حاليا. في جميع الأشكال ، أعيد تصميم قناة البذر فيما يتعلق بالعرض والشكل. من الناحية العملية ، يبدو أن هذا له تأثير على عدد الخلايا المحاصرة ، ولكنه يحتاج إلى مزيد من التحقيقات. كما تم تحقيق تحسينات كبيرة فيما يتعلق بكفاءة المحاصرة من خلال دمج قنوات فائضة إضافية مما يؤدي إلى ارتفاع التدفق الحراري عبر المفاعل ومحاصرة المزيد من الخلايا. ومع ذلك ، في نفس الوقت يزيد المرء من خطر غسل الخلايا أثناء الزراعة.

يعد الجهاز بديلا مثيرا للاهتمام للزراعة على نطاق واسع والتي تم استخدامها لعقود للتحقيق في عمليات النمو والإنتاج على مستوى الخلية الواحدة. ومع ذلك ، فإن لديها بعض المتطلبات المهمة: للمراقبة المتوازية للعديد من المفاعلات الحيوية بيكوليتر ، يعد الإعداد المجهري عالي الدقة والمحرك بالكامل مع تعويض انحراف التركيز إلزاميا. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى نظام حضانة للحفاظ على درجة حرارة الزراعة المطلوبة ثابتة طوال القياسات.

نحقق معدل نجاح بنسبة 95٪ في تصنيع الأجهزة. ترتبط المشكلات الرئيسية بالربط الزجاجي غير الفعال PDMS ، أو انهيار سقف PDMS ، أو تسرب السوائل (انظر الجدول 1 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها لمعظم المشكلات التي تحدث). على الرغم من أن العمل التجريبي يتم جزئيا في ظل ظروف غير معقمة ، إلا أننا نادرا ما نرى تلوثا أثناء التجارب ، بسبب نظام السوائل المغلق. تتميز أجهزة الموائع الدقيقة PDMS بشفافية بصرية ، وبالتالي ، يمكن استخدامها للحصول على دقة عالية في التصوير في الجسم الحي . على الرغم من أن PDMS يبدو مثاليا للتطبيق ، إلا أنه يتمتع بتقارب كبير مع الجزيئات الكارهة للماء ، مما يجعل استخدام المذيبات المستخدمة على نطاق واسع في عمليات التحفيز الحيوي للخلية بأكملها محدودا. ومع ذلك ، تتوفر الطلاءات المناسبة لتكييف البروتوكول مع هذه الأنواع من التطبيقات.

يعد PLBR المقترح مناسبا تماما للتحليل المكاني والزماني للأحداث الخلوية وحتى تحت الخلوية لأنواع مختلفة من البكتيريا. تكمن الميزة الرئيسية للنهج الحالي في القدرة على قياس نمو المستعمرات الدقيقة بشكل مباشر على عكس الطرق التقليدية. علاوة على ذلك ، يسمح PLBR بالزراعة في ظل ظروف محددة وثابتة. نظرا لأن النظام يسهل استخدام كميات صغيرة من الكواشف أو المواد ، فإنه يحمل مزايا كونه غير مكلف وقابل للتخصيص وقابل للتعديل إلى إنتاجية عالية. في الطرق التقليدية ، يتم أخذ متوسط قيم جميع السكان في الاعتبار عند تحليل الزراعة الميكروبية. علاوة على ذلك ، تحتاج الطرق الحالية إلى أخذ عينات يدوية يمكن أن تؤدي إلى تدهور العينات وبالتالي إلى أخطاء في القياس. يقدم PLBR وجهات نظر جديدة لتطوير العمليات الحيوية وتحليل عدم التجانس السكاني في علم الأحياء الدقيقة. يعد PLBR أداة واعدة لتطبيقات مختلفة في تطوير العمليات الحيوية ويمكن تطبيقه في مجالات البحث المختلفة ، مثل تحليل عدم التجانس من خلية إلى خلية ، وتحليل مجموعات خلايا معينة داخل سلالات الخلايا ، وفحص سلالات الإنتاج الميكروبي والتحقيق في الوقت الفعلي للأنماط الظاهرية للخلايا.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا الفني أغنيس مولر-شرور على مساهمتها القيمة. تم تنفيذ هذا العمل جزئيا في منشأة هيلمهولتز للإلكترونيات النانوية (HNF) في Forschungszentrum Jülich GmbH. المؤلفون ممتنون للمساعدة والدعم السخيين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
رقاقة السيليكون بقطر 100 مم ، P / BOR < ؛ 100>Si-MAT ، مواد السيليكون ، ألمانيا
مقاومة للضوء SU-8 2000.5Micro Resist Technology GmbH ، ألمانيا
مقاومة للضوء SU-8 2010Micro Resist Technology GmbH ، ألمانيا
SU-8 Developer mr DEV- 600Micro Resist Technology GmbH ، ألمانيا
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 مجموعةالمطاط الصناعي المصنوعة من السيليكونداو كورنينج. Farnell GmbH ، ألمانيا
توزيع الإبر نصائح دقيقة   27 G; المعرف = 0.2 مم ، OD = 0.42 ممNordson EFD Deutschland ، ألمانيا
ألواح زجاجية D263 T eco ، 30 مم × 25 مم × 0.17 ممSchott AG ، ألمانيا
ثقب الثقب AKA 5130-B-90Harris Uni-Core
Tubing Tygon S-54-HL ، المعرف = 0.25 مم ، OD = 0.76 ممSaint Gobain ؛ VWR International GmbH ، ألمانيا
محاقن يمكن التخلص منها &ndash ؛ Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo ، 1 ملB. Braun Melsungen AG ، ألمانيا552-183143
محاقن ، 1 مل محاقن زجاجية معقمةINNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS) ، ألمانيا
المواد الكيميائية
(NH4< / sub>) 2< / sub>SO4< / sub>Carl Roth GmbH + Co. KG ، ألمانيا
UreaCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
KH2PO4Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany
K2HPO4Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany
MgSO4& bull; 7H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, ألمانيا
MOPSCarl Roth GmbH + Co. KG, ألمانيا
FeSO4& bull; 7H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
MnSO4& bull; H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
ZnSO4& bull; 7H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
CuSO4Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany
NiCl2& bull; 6H2OCarl Roth GmbH + Co. KG ، ألمانيا
CaCl2< / sub>Carl Roth GmbH + Co. KG ، ألمانيا
BiotinCarl Roth GmbH + Co. KG ، ألمانيا
حمض البروكاتيتشويكCarl Roth GmbH + Co. KG ، ألمانيا
Glucose-MonohydrateCarl Roth GmbH + Co. KG ، ألمانيا
BHIBecton ، Dickinson
< em >Corynebacterium glutamicum < / em > ATTC 13032DSMZ ؛ Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany
Escherichia coli MG 1655DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany
Equipment
Wafer Cleaner SSEC 3300Solid State Equipment LLC
Spin Coater SPIN150 -NPPSPS Europe B.V.
قناع التقويم MA-6كارل سويس
لوح ساخن HP30A - 2علمي
Memmert UN 200منظف
بلازما FEMTODiener Electronics ، ألمانيا
مضخات حقنة MESYSCetoni GmbH ، ألمانيا
محرك مغناطيسي CB 162ستيوارتVWR 442-0304
مجهر نيكون اكليبس تينيكون
حاضنة مجهرPecon GmbH ، ألمانيا
الطرد المركزي minispin plus " الخط الأسود"Eppendorf9776501
مقياس الضوء الحيوي plus Eppendorf6132000008
هز قارورة شاكر / حاضنة 3031GFL - Gesellschaft fü r Labortechnik mbH ، ألمانيا
Profilometer ، Dektak 150 Stylus ProfilerVeeco
< td colspan = "4" >Cells فرن مختبر توري باينز مجهري

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Single Cells. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 301-327 (2009).
  2. Wei, P., et al. Bacterial virulence proteins as tools to rewire kinase pathways in yeast and immune cells. Nature. 488, 384-388 (2012).
  3. Park, S., et al. Influence of topology on bacterial social interaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13910-13915 (1073).
  4. Lee, P. J., Helman, N. C., Lim, W. A., Hung, P. J. A microfluidic system for dynamic yeast cell imaging. BioTechniques. 44, 91-95 (2008).
  5. Kobel, S. A., et al. Automated analysis of single stem cells in microfluidic traps. Lab Chip. 12, 2843-2849 (2012).
  6. Carlo, D. D., Wu, L. Y., Lee, L. P. Dynamic single cell culture array. Lab Chip. 6, 1445-1449 (2006).
  7. Locke, J. C. W., Young, J. W., Fontes, M., Jimenez, M. J. H., Elowitz, M. B. Stochastic Pulse Regulation in Bacterial Stress Response. Science. 334, 366-369 (2011).
  8. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Fritzsch, F. S. O., et al. Picoliter nDEP traps enable time-resolved contactless single bacterial cell analysis in controlled microenvironments. Lab Chip. 13, 397-408 (2013).
  10. Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  11. Mather, W., Mondragon-Palomino, O., Danino, T., Hasty, J., Tsimring, L. S. Streaming Instability in Growing Cell Populations. Phys. Rev. Lett. 104, (2010).
  12. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr. Biol. 20, 1099-1103 (2010).
  13. Grunberger, A., et al. A disposable picolitre bioreactor for cultivation and investigation of industrially relevant bacteria on the single cell level. Lab Chip. 12, 2060-2068 (2012).
  14. Walden, M., Elf, J. Studying transcriptional interactions in single cells at sufficient resolution. Curr. Opin. Biotech. 22, 81-86 (2011).
  15. Keymer, J. E., Galajda, P., Lambert, G., Liao, D., Austin, R. H. Computation of mutual fitness by competing bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20269-20273 (2008).
  16. Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17290-17295 (2006).
  17. Grunberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnol. Bioeng. 110, 220-228 (2013).
  18. Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13, (2012).
  19. Mustafi, N., Grunberger, A., Kohlheyer, D., Bott, M., Frunzke, J. The development and application of a single-cell biosensor for the detection of L-methionine and branched-chain amino acids. Metab. Eng. 14, 449-457 (2012).
  20. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb. Cell Fact. 8, (2009).
  21. Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J. Bacteriol. 175, 5595-5603 (1993).
  22. Frunzke, J., Bramkamp, M., Schweitzer, J. E., Bott, M. Population Heterogeneity in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 caused by prophage CGP3. J. Bacteriol. 190, 5111-5119 (2008).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Microfluidic Picoliter BioreactorSingle Cell AnalysisCorynebacterium GlutamicumPDMS Chip FabricationSU 8 PhotolithographyTime lapse MicroscopyBacterial Culture PreparationContinuous Media FlowIsogenic MicrocoloniesAutomated Imaging

مقالات ذات صلة