مقالة منهجية

المفاعل الحيوي Picoliter Microfluidic لتحليل الخلية الميكروبية أحادية الخلية: التصنيع وإعداد النظام والتشغيل

15.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50560

⸱

ديسمبر 6, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Bio- and Geosciences, IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Juelich GmbH

في هذه المقالة

ملخص

في هذا البروتوكول ، يتم تقديم تصنيع وإعداد وتشغيل أساسي لمفاعل حيوي بيكوليتر ميكروسويديك (PLBR) لتحليل الخلية المفردة للكائنات الحية الدقيقة بدائية النواة. تم تحليل الكائنات الحية الدقيقة ذات الصلة صناعيا كدليل على المبدأ مما يسمح برؤى حول معدل النمو والتشكل وعدم تجانس النمط الظاهري خلال فترات زمنية معينة ، وهو أمر يصعب تحقيقه بالطرق التقليدية.

الملخص

في هذا البروتوكول ، يتم وصف التصنيع والإعداد التجريبي والتشغيل الأساسي للمفاعل الحيوي الموائع الدقيقة (PLBR) الذي تم إدخاله مؤخرا بالتفصيل. يمكن استخدام PLBR لتحليل البكتيريا المفردة والمستعمرات الدقيقة للتحقيق في الأسئلة المتعلقة بالتكنولوجيا الحيوية والميكروبيولوجية المتعلقة ، مثل نمو الخلايا ، والتشكل ، والاستجابة للإجهاد ، وإنتاج المستقلب أو البروتين على مستوى الخلية الواحدة. يتميز الجهاز بتدفق مستمر للوسائط يتيح ظروفا بيئية ثابتة لدراسات الاضطراب ، ولكنه بالإضافة إلى ذلك يسمح بتغييرات متوسطة سريعة بالإضافة إلى ظروف متذبذبة لتقليد أي حالة بيئية مرغوبة. لتصنيع الأجهزة ذات الاستخدام الفردي ، كانت رقاقة السيليكون التي تحتوي على هياكل SU-8 بحجم ميكرومتر فرعي بمثابة قالب النسخ المتماثل لصب بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان السريع. تم قطع الرقائق وتجميعها وتوصيلها وإعدادها على مجهر عالي الدقة ومؤتمت بالكامل مناسب للتصوير بفاصل زمني ، وهي أداة قوية لتحليل الخلايا المكانية والزمانية. هنا ، تم زرع كائن منصة التكنولوجيا الحيوية Corynebacterium glutamicum في PLBR وتمت متابعة نمو الخلايا والتألق داخل الخلايا على مدار عدة ساعات لكشف عدم تجانس السكان المعتمد على الوقت على مستوى الخلية المفردة ، وهو أمر غير ممكن مع طرق التحليل التقليدية مثل قياس التدفق الخلوي. إلى جانب الأفكار حول تصنيع الجهاز ، علاوة على ذلك ، يتم توضيح تحضير الزراعة المسبقة ، وتحميل البكتيريا ، ومحاصرتها ، وزراعة PLBR للخلايا المفردة والمستعمرات. ستضيف هذه الأجهزة بعدا جديدا في البحوث الميكروبيولوجية لتحليل الظواهر المعتمدة على الوقت للبكتيريا المفردة تحت رقابة بيئية مشددة. نظرا لعملية التصنيع البسيطة والقصيرة نسبيا ، يمكن تكييف التكنولوجيا بسهولة في أي مختبر للموائع الدقيقة وتصميمها ببساطة لتلبية الاحتياجات المحددة.

المقدمة

يعد الفحص المجهري بفاصل زمني أداة قوية لدراسة الخلايا الحية في الجسم الحي1. وفي الوقت نفسه ، يتم تطبيق منصات الفحص المجهري المؤتمتة بالكامل المتوفرة تجاريا بما في ذلك تعويض انجراف التركيز المستحث حراريا بشكل شائع في البحث البيولوجي لدراسة الظواهر المعتمدة على الوقت ، بدءا من أبحاث الخلايا السرطانية والخلايا العصبية على هندسة الأنسجة والدراسات الديناميكية مع الخميرة المفردة أو الخلايا البكتيرية2-6.

< p class = "jove_content" >عادة ما يتم تطبيق ألواح الآبار الشفافة أو منصات أجار أو ببساطة شرائح الفحص المجهري لتوفير بيئات زراعة الخلايا أثناء التصوير بفاصل زمني7. على الرغم من أنها مناسبة لأبحاث معينة ، إلا أن هذه الأنظمة البسيطة لها سيطرة محدودة للغاية على الظروف البيئية ولا تسمح باضطرابات أكثر تعقيدا أو تغييرات متوسطة محددة جيدا وسريعة. تم طرح أجهزة رقائق الموائع الدقيقة التي تستخدم لمرة واحدة والتي يتم إنتاجها عن الإنتاج الضخم في السوق مؤخرا ولكنها مصممة في الغالب لأنواع الخلايا حقيقية النواة الأكبرحجما 4. على الرغم من أنه يمكن متابعة النمو ، إلا أن تحقيقات النمو المحددة جيدا فيما يتعلق ، على سبيل المثال ، بمحاصرة الخلايا الدقيقة ، وحجم المستعمرة ، واتجاه النمو ، والقدرة على إزالة الخلايا محدودة. الموائل والمفاعلات الدقيقة ، التي يتم فيها زراعة الخلايا البكتيرية في بيئات ثلاثية الأبعادتم تطويرها من 8 إلى 10 ، لها عيوب عند التعامل مع الدراسات الكمية على مستوى الخلية الواحدة. بينما يمكن تحليل عدم التجانس الكلي للسكان ، لا يمكن تحديد العديد من معلمات الخلية بدقة بدقة من خلال دقة الخلية المفردة لأن النمو لا يقتصر على الطبقات الأحادية.

< p class = "jove_content"> أدى هذا القيد إلى تطوير أنظمة دقيقة تمكن من زراعة الخلايا في قنوات وموائل محددة جيدا مع نمو الخلايا في طبقات أحادية مسطحة بدقة خلية واحدة وتحكم صارم بشكل خاص في إمدادات الوسائط والظروف البيئية6،11،12. تم عرض أمثلة قليلة على أنظمة الموائع الدقيقة لزراعة الخلاياالبكتيرية 12-14. تظهر البكتيريا عادة معدلات نمو سريعة جدا وتتطلب هياكل موائع دقيقة في حدود بضعة ميكرومترات وأقل ، خاصة عندما تكون الطبقات الأحادية للخلية مطلوبة للفحص المجهري. كيمر وآخرون. أظهر النمو والانتشار لسلالات الإشريكية القولونية في المناظر الطبيعية الدقيقة15،16. نظرا لأنهم كانوا مهتمين بديناميكيات السكان ، لم يحققوا بدقة الخلية الواحدة.

< p class = "jove_content">لقد قمنا بتطوير المفاعل الحيوي picoliter (PLBR) 13 ، والذي يتم تطبيقه حاليا للتحقيق في مؤشرات أداء التكنولوجيا الحيوية المختلفة مثل النمو17 وتحليل الإنتاجية المقترنة بالتألق على مستوى الخلية المفردة18،19. يسمح جهاز الموائع الدقيقة الحالي بالتحكم في المفاعل البيئي بحجم ثقافة محدد يبلغ حوالي بيكوليتر واحد ومراقبة مستمرة لخلية واحدة في وقت واحد. بالمقارنة مع أنظمة الصناديق أحادية الطبقةالمفتوحة 11،14 ، حيث يكون أحد الجانبين مفتوحين لقناة إمداد الوسائط ، يسمح PLBR بالاصطياد والاستزراع المتحكم فيه. يسمح التصميم بزراعة البكتيريا على المدى الطويل دون التعرض لخطر تكوين عدة مستعمرات مجاورة مجموعة كبيرة واحدة. علاوة على ذلك ، يشتمل النظام على مناطق زراعة بارتفاع 1 ميكرومتر (بترتيب قطر الخلية) لتقييد نمو البكتيريا في طبقات وحيدة الخلية. في المقابل ، تكون قنوات الإمداد أعمق 10 أضعاف لتقليل المقاومة الهيدروليكية.

< p class = "jove_content">بالمقارنة مع أنظمة زراعة الدفعاتالمصغرة 20 ، يسمح النظام الحالي بالزراعة بمعايير بيئية ثابتة بسبب التدفق المستمر للوسائط. علاوة على ذلك ، يمكن التحكم بسهولة في المعلمات البيئية مثل التركيب المتوسط ودرجة الحرارة ومعدلات التدفق وتبادل الغاز وتغييرها في غضون ثوان. يسمح هذا بإجراء تحقيقات محددة للاستجابة الخلوية للتغيرات البيئية فيما يتعلق على سبيل المثال بتوافر المغذيات أو محفزات الإجهاد. إن الطلب على أحجام الوسائط المخفضة ، أي في نطاق بضعة ميكرولتر فقط ، يمكن الباحثين من إجراء دراسات جديدة ، على سبيل المثال اضطراب الخلايا أثناء التصوير بفاصل زمني مع طاف للتجارب واسعة النطاق التي تكشف استجابة الخلية في ظل هذه الظروف البيئية المحددة17. يوفر المفاعل الحيوي للباحثين نظاما قويا يتحكم بإحكام في الظروف الفيزيائية الحيوية ويتم تشغيله باستخدام مضخات حقنة عالية الدقة ومجهر المجال الساطع الآلي والفحص المجهري الفلوري للتصوير بفاصل زمني. هنا ، نبلغ عن بروتوكول كامل بما في ذلك تصميم الجهاز والتصنيع والتطبيقات المثالية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تصنيع الرقاقة

  1. صمم جهاز الموائع الدقيقة الذي يحتوي على مداخل ومنافذ وقنوات رئيسية و PLBRs (الشكل 1 أ) باستخدام برنامج CAD.
  2. يتكون التصميم المقدم في هذا البروتوكول (الشكل 2) من مدخلين للبذر ، ومولد متدرج لخلط ركيزتين مختلفتين ، ومخرج واحد ، وستة مصفوفات من PLBRs. تحتوي كل مصفوفة على 5 PLBRs ، مما ينتج عنه 30 PLBRs متوازية داخل جهاز واحد ميكروفيليديك.
  3. قم بإنشاء قناع ضوئي للطباعة الحجرية يحتوي على تخطيطات الرقاقة المطلوبة (الشكل 1 ب). تم إنتاج القناع الضوئي داخليا عن طريق كتابة شعاع الإلكترون بدقة دون الميكرون. يتكون القناع المستخدم من طبقة من الكروم على صفيحة زجاجية 5 في2.
    ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية في ظل ظروف غرف الأبحاث من الفئة 100 أو أفضل (يظهر مخطط انسيابي للعملية في الشكلين 3 أ و 3 ب).
  4. نظف رقاقة السيليكون 4 بوصات مع سمكة البيرانا (نسبة 10: 1 من حمض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين) وحمض الهيدروفلوريك لعدة دقائق (تحذير: مواد كيميائية خطرة). اشطفه بالماء منزوع الأيونات (DI) لمدة 10 ثوان تقريبا.
  5. تجفيف الرقاقة لمدة 20 دقيقة عند 200 درجة مئوية.
  6. تدور الطبقة 1 ميكرومتر SU-8 2000.5 مقاومة للضوء على الرقاقة (طبقة 1) (مقاومة 4 مل ، تدور 10 ثوان مع ، v = 500 دورة في الدقيقة ، و a = 100 دورة في الدقيقة / ثانية ، تدور 30 ثانية مع v = 1,000 دورة في الدقيقة و a = 300 دورة في الدقيقة / ثانية).
  7. ضع الرقاقة المطلية على لوح تسخين عند 95 درجة مئوية للتخلص من المذيبات الزائدة (1.5 دقيقة عند 65 درجة مئوية ، و 1.5 دقيقة عند 95 درجة مئوية ، و 1 دقيقة عند 65 درجة مئوية ؛ من الناحية المثالية استخدم لوحين تسخين).
  8. أدخل قناع ضوئي من الطبقة 1 (هنا مناطق الاصطياد لمفاعلات البيكوليتر) ورقاقة داخل محاذاة القناع وقم بتعريض الرقاقة إلى 350-400 نانومتر (ملامسة الفراغ ، 64 مللي جول / سم² ، ر = 3 ثوان ، أنا = 7 ميجاوات / سم²).
  9. قم بإجراء خبز ما بعد التعرض على لوح تسخين عند 95 درجة مئوية لبدء بلمرة SU-8 (دقيقة واحدة عند 65 درجة مئوية ، ودقيقة واحدة عند 95 درجة مئوية ، ودقيقة واحدة عند 65 درجة مئوية). ملاحظة: بعد هذه الخطوة يمكن رؤية الهياكل الموجودة في طبقة SU-8.
  10. ضع الرقاقة في حمام مطور SU-8 لمدة 1 دقيقة وانقل الرقاقة إلى حاوية ثانية مع مطور SU-8 الطازج لبضع ثوان.
  11. اشطف الرقاقة في الأيزوبروبانول لإزالة مطور SU-8 والرقاقة الجافة باستخدام تدفق النيتروجين لغزل الرقاقة.
  12. اخبزي الرقاقة لمدة 10 دقائق عند 150 درجة مئوية.
  13. تدور طبقة 9 ميكرومتر SU-8 2010 مقاومة للضوء على الرقاقة (الطبقة الثانية) (الاستغناء عن مقاومة 4 مل ، تدور 10 ثوان مع V = 500 دورة في الدقيقة ، أ = 100 دورة في الدقيقة / ثانية ، وتدور 30 ثانية مع V = 4,000 دورة في الدقيقة ، أ = 300 دورة في الدقيقة / ثانية).
  14. ضع الرقاقة مع SU-8 على لوح تسخين عند 95 درجة مئوية للتخلص من المذيبات الزائدة (15 دقيقة عند 65 درجة مئوية ، 45-60 دقيقة عند 95 درجة مئوية ، و 10 دقائق عند 65 درجة مئوية). ملاحظة: يجب الانتباه إلى التجاعيد والفقاعات. إذا تم تسخين الرقاقة بسرعة تصل إلى 95 درجة مئوية ، فقد يتم تغليف المذيب المتبخر في فقاعات غاز صغيرة.
  15. أدخل قناع ضوئي بالتخطيط المطلوب (هنا القنوات الرئيسية لإمداد المغذيات) والرقاقة في تقويم القناع وعرضها إلى 350-400 نانومتر (اتصال صلب ، 64 مللي جول / سم² ، ر = 10 ثوان ، أنا = 7 ميجاواط / سم²)
  16. قم بإجراء خبز ما بعد التعرض على لوح تسخين عند 95 درجة مئوية لإنهاء بلمرة SU-8 (5 دقائق عند 65 درجة مئوية ، 3:30 دقيقة عند 95 درجة مئوية ، 3 دقائق عند 65 درجة مئوية). ملاحظة: بعد هذه الخطوة يمكن رؤية الهياكل الموجودة في طبقة SU-8.
  17. ضع الرقاقة في حمام مطور SU-8 لمدة 45 ثانية ، وانقل الرقاقة إلى حاوية ثانية مع مطور SU-8 جديد وقم بتطويرها لمدة 60 ثانية.
  18. اشطف الرقاقة لمدة 20 ثانية بالأيزوبروبانول لإزالة أي بقايا مطور SU-8 ورقاقة جافة باستخدام النيتروجين المضغوط.
  19. أخيرا ، اخبزي الرقاقة بقوة على حرارة 150 درجة مئوية. نتيجة لذلك ، يتم الحصول على الرقاقة النهائية (الشكل 1C) ، والتي سيتم استخدامها كقالب رئيسي لقولبة PDMS.
  20. قم بإجراء قياسات مقياس البروفيلومتر (الشكل 3C) للتحقق من صحة ارتفاعات هيكل SU-8. ملاحظة: قد تؤدي عدم الدقة في ارتفاع الهيكل إلى عدم كفاءة احتجاز الخلايا أو فقدان الخلايا أثناء الزراعة.
فئة < p = "jove_title" >2. تصنيع رقاقة Polydimethylsiloxane

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التالية بشكل مثالي في ظل ظروف التدفق الصفحي لمنع جزيئات الغبار من التداخل مع إجراء التصنيع (يظهر مخطط انسيابي للعملية في الشكل 4).

  1. تحضير خليط من قاعدة بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) وعامل المعالجة بنسبة 10: 1. تخلط بعناية حتى يتم الحصول على محلول متجانس يبدو معتما. قم بإعداد القدر المطلوب لارتفاع الطبقة المطلوب (هنا 3 مم).
  2. قم بإزالة خليط PDMS لمدة 30 دقيقة تقريبا تحت فراغ طفيف حتى تختفي جميع الفقاعات.
  3. قم بإعداد جهاز التشكيل (أو طبق بتري) برقائق SU-8 المناسبة واسكب خليط PDMS فيه (الشكل 1 د).
  4. اخبزي PDMS لمدة 3 ساعات عند 80 درجة مئوية في الفرن.
  5. انزع لوح PDMS بعناية من الرقاقة. قطع اللوح إلى رقائق مفردة باستخدام مشرط نظيف وحاد.
  6. اغسل الرقائق في حمام n-pentane لمدة 90 دقيقة ، متبوعا بحمامين لغسيل الأسيتون (90 دقيقة لكل منهما). جفف الرقائق طوال الليل لإزالة أي بقايا مذيبات. تحذير: قم بإجراء غسيل PDMS تحت غطاء الدخان. ملاحظة: أثناء غسل n-pentane ، تتم إزالة المونومرات والثنائيات من PDMS المعالج وقد يتضاعف حجم الرقاقة مؤقتا أثناء إجراء الغسيل.
  7. قم بتخزين رقائق PDMS الموائع الدقيقة في حاويات قريبة حتى التجربة النهائية.
  8. قبل التجربة مباشرة ، قم بعمل فتحات المدخل والمخرج في شريحة PDMS باستخدام إبرة (أو ثقب) بقطر أصغر قليلا من الموصلات المستخدمة لتوصيل الأنابيب بشريحة PDMS.
  9. قم بتنظيف شريحة PDMS الموائع الدقيقة بعناية باستخدام الأيزوبروبانول واستخدم شريطا لاصقا لإزالة أي جزيئات غبار قد تلتصق بجانب PDMS المنظم. استخدم الشريط اللاصق عدة مرات حتى لا يمكن رؤية أي جسيم على الشريحة.
  10. قم بتنظيف شريحة زجاجية رفيعة 170 ميكرومتر باستخدام الأسيتون والأيزوبروبانول على التوالي. أخيرا ، نظف بالماء منزوع الأيونات وجففه بالنيتروجين المضغوط.
  11. قبل تنشيط البلازما ، قم بتسخين منظف البلازما وقم بتشغيل البلازما لمدة 300 ثانية تقريبا. شريحة زجاجية مؤكسدة بالبلازما ورقاقة PDMS (الطاقة 50 واط ، الوقت = 25 ثانية ، معدل تدفق الأكسجين = 20 sccm).
    12. قم
  12. بمحاذاة PDMS والشريحة الزجاجية قبل الترابط. أخيرا ، ضع شريحة PDMS بعناية على الشريحة الزجاجية (الشكل 1E). سوف يرتبط PDMS والزجاج في غضون ثوان. ملاحظة: لا تدفع بالملاقط على الجزء العلوي من شريحة PDMS أثناء عملية الترابط. قد يؤدي هذا إلى ما يسمى بانهيار سقف القنوات والهياكل الصغيرة.
  13. من أجل تقوية الرابطة ، اخبز شريحة زجاج PDMS النهائية لمدة 10 ثوان عند 80 درجة مئوية.
< ص الفئة = "jove_title" >3. تحضير الثقافة البكتيرية

ملاحظة: يجب تحضير جميع المزارع في وسط مفلتر معقم لمنع تراكم الجسيمات غير المرغوب فيها ، والتي قد تتداخل أثناء الزراعة.

  1. استخدم صفيحة أجار تحتوي على الكائنات الحية المرغوبة (هنا ، C. glutamicum ATCC 13032) وقم بتلقيح مستعمرة واحدة في 20 مل من وسط BHI الطازج ، واحتضنه طوال الليل (≈ 8-14 ساعة) عند 30 درجة مئوية على شاكر دوار (120 دورة في الدقيقة).
  2. انقل 10 ميكرولتر من الزراعة المسبقة إلى الوسط المطلوب (هنا CGXII21) والذي سيتم استخدامه أثناء زراعة الموائع الدقيقة واترك الخلية تنمو طوال الليل عند 30 درجة مئوية على شاكر دوار (120 دورة في الدقيقة).
  3. انقل الكمية المطلوبة من تعليق الخلية (بين 10-500 ميكرولتر ، اعتمادا على بداية التجربة) إلى الوسط المطلوب (هنا CGXII21) والذي سيتم استخدامه أثناء زراعة الخلايا الموائع الدقيقة. ملحوظة: الأفضل هو استخدام الخلايا من المرحلة اللوغاريتمية المبكرة للبذر. بالنسبة لزراعة C. glutamicum ، كانت أفضل كثافة بصرية (OD600) للبذر بين 0.5-2.
  4. انقل 1 مل من المزرعة البكتيرية إلى أنبوب معقم سعة 2 مل. ملاحظة: يجب أن يتم ذلك مباشرة بعد تجميع شريحة PDMS الموائع الدقيقة لتقليل وقت النقل بين قارورة الاهتزاز وزراعة الموائع الدقيقة. عادة ما يكون وقت النقل حوالي 15 دقيقة ويجب أن يظل صغيرا قدر الإمكان لمنع التأثير على التمثيل الغذائي الناجم عن الحد من الأكسجين وتغيرات درجات الحرارة.

4. الإعداد التجريبي

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات باستخدام مجهر مقلوب.

  1. ابدأ حاضنة المجهر قبل ساعتين من التجربة لتسخين النظام. ملاحظة: يجب أن يكون الفحص المجهري مزودا بحاضنة كاملة الحجم للتحكم في درجة الحرارة وتدفق الغاز إذا رغبت في ذلك. التحكم الإضافي في الرطوبة ليس ضروريا لأن نظام الرقائق مملوء باستمرار بالوسائط.
  2. افتح نظام الحاضنة ، وحدد الهدف المطلوب وإذا لزم الأمر أضف زيت الغمر إلى الهدف.
  3. قم بتركيب الشريحة داخل حامل الرقائق. إذا لزم الأمر ، قم بتثبيت اللوحة الزجاجية بشريط لاصق لتجنب رقاقة أي حركة أثناء تشغيل المرحلة.
  4. قم بتوسيط العينة على المجهر وركز على مصفوفات PLBR.
  5. قم بتوصيل المداخل والمنافذ بالأنابيب المناسبة (الشكل 1F). قم بتوصيل الأنبوب بخزان النفايات. يمكن رؤية شريحة تمثيلية في الشكل 4D.
  6. أدخل المحاقن في المضخات وابدأ تدفق الوسائط. استخدم محلول طلاء متوسط أو عازل أو إذا لزم الأمر واشطف قنوات الموائع الدقيقة لمدة 1 ساعة تقريبا. ملاحظة: يستخدم محلول الطلاء لطلاء جدران القناة لمنع التصاق الخلايا غير المحدد.
  7. بالنسبة للإشريكية القولونية ، يتم استخدام محلول 0.1٪ من BSA لتغطية جدران القناة. بالنسبة إلى C. glutamicum لا يلزم الطلاء. بعد إجراء الطلاء ، اغسل الرقاقة ببذر الخلايا المسبق المتوسط.
  8. قبل بذر الخلايا وزراعتها ، تأكد من عدم حدوث تسرب وأن درجة الحرارة ثابتة.
< p class = "jove_title" >5. بذر الخلايا البكتيرية في جهاز الموائع الدقيقة

  1. تأكد من توفر محاليل البكتيريا المرغوبة في محاقن مناسبة متصلة بالأنابيب.
  2. افصل المخزن المؤقت أو محلول الطلاء وقم بتوصيل تعليق الخلية بالشريحة. لتقليل حجم الموت ، فقاعات الهواء غير المرغوب فيها وتقليل الوقت التجريبي ، قم بتغيير الإبرة الكاملة وكذلك الأنابيب ، بدلا من المحاقن فقط.
    3. قم
  3. بغرس تعليق الخلية في القنوات بمعدل تدفق حجمي يبلغ 200 nl / min حتى تمتلئ معظم PLBRs بالكمية المطلوبة من الخلايا (الشكل 5 أ). ملاحظة: تعتمد نتائج البذر المثلى على السلالة البكتيرية ، OD600 ، ووسط نمو ما قبل الزراعة. يجب تكييف هذه المعلمات لزيادة كفاءة الاصطياد والوقت حتى يتم احتجاز عدد كاف من الخلايا في هياكل المفاعل. ل C. glutamicum ، عادة ما تم استخدام تعليق خلية OD600 0.5-2 ؛ بالنسبة للإشريكية القولونية ، كان OD600 بين 0.5-1.
  4. إذا تم ملء عدد صغير فقط من PLBRs ، فقم بزيادة معدل التدفق إلى 800-1,200 nl / دقيقة.
  5. افصل تعليق الخلية وقم بتوصيل وسط النمو بالرقاقة (الشكل 5 ب). تأكد من عدم إدخال فقاعة هواء أثناء التغيير المتوسط. Perfuse مع وسائط النمو الجديدة عند 100 nl / دقيقة.
< p class = "jove_title" >6. التصوير بفاصل زمني

  1. حدد PLBRs محددة للتصوير بفاصل زمني. عادة ما يتم اختيار PLBRs التي تحتوي على خلية أم واحدة في بداية التجربة. يعتمد عدد مناطق الاهتمام التي يمكن التحقيق فيها في تجربة واحدة على معدل الإطارات المطلوب والإعداد المجهري.
  2. حدد معدل إطارات مناسبا اعتمادا على عدد PLBRs. تأكد من أن المجهر يمكنه التعامل مع المقدار المطلوب من عائد الاستثمار في الفاصل الزمني للفاصل الزمني.
  3. اختر مجموعات المرشحات المناسبة (هنا YFP). أغلق الغالق تلقائيا أثناء حركة المسرح وبعد كل قياس لقطات متتابعة لمنع تبييض الكروموفور.
  4. قم بتكوين تسلسل المجهر بفاصل زمني وابدأ التجربة.
  5. بعد أن تتضخم جميع PLBRs ، يمكن إيقاف التجربة ، ويمكن التخلص من شريحة PDMS الموائع الدقيقة ويمكن تقييم التجربة.

7. التحليل

ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات التالية أو أجزاء الإجراء يدويا أو عن طريق برامج تحليل الصور مثل ImageJ، وما إلى ذلك.

  1. تحديد PLBRs ذات الأهمية حيث تفي الزراعة بجميع المعايير المطلوبة ، على سبيل المثال عدد الخلايا الأم ، وموضع الخلايا الأم ، وما إلى ذلك.
  2. لتحديد معدل نمو مستعمرة دقيقة واحدة ، احسب عدد الخلايا في كل إطار زمني.
  3. احسب الحد الأقصى لمعدل النمو عن طريق رسم الوقت مقابل ln (رقم الخلية). يمثل منحدر المؤامرة معدل النمو في [1 / ساعة] (انظر الشكل 6).
  4. يعتمد تحليل بيانات التألق بشدة على التجربة التي تم إجراؤها. في هذا التقرير ، تم اختيار مثال لتوضيح عدم التجانس من مستعمرة إلى أخرى ومن خلية إلى أخرى بين المستعمرات الدقيقة المتساوية الوراثة المختلفة (انظر الشكل 7).

النتائج

تصنيع الجهاز

يتم تصنيع نظام PLBR الموائع الدقيقة من طبقة واحدة من PDMS مرتبطة بشريحة زجاجية رقيقة مناسبة للمجهر عالي الدقة. يتكون التصنيع من خطوتين رئيسيتين: أولاً تصنيع القالب الرئيسي (الأشكال 1A و1B و1C) وثانياً تصنيع الشريحة (الأشكال 1D و1E و1F). وفقاً للبروتوكول، تُستخدم تقنيات التصنيع الدقيق الفوتوليثوغرافي القياسية لإنشاء القالب الرئيسي. ويمكن للمختبرات التي لا تتوفر لديها مرافق الغرف النظيفة الحصول على قوالب SU-8 رئيسية مخصصة متاحة تجارياً. وباستخدام صب PDMS المتكرر (الأشكال 1A و1B و1C)، يمكن إنتاج المئات من الشرائح القابلة للاستخدام لمرة واحدة. يمكن إجراء صب PDMS وتجميع الشريحة في أي مختبر ولا تتطلب مرافق الغرف النظيفة، ومع ذلك، يُفضل استخدام أماكن العمل ذات تدفق الهواء الصفائحي.

تبدأ العملية بتصميم نظام الشريحة الموائعية الدقيقة. عادةً ما يتم استخدام برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) لتصميم الشريحة الموائعية الدقيقة (الشكل 1A). بعد التصميم بمساعدة الكمبيوتر، يتم إنشاء قناع بواسطة كاتب شعاع الإلكترونات (الشكل 1B) بدقة أقل من الميكرون. في الدراسة الحالية، تم إنشاء قناع كروم بسمك 5 في الذي استُخدم في عملية الليثوغرافيا لرقاقة SU-8. تُستخدم رقاقة السيليكون-SU-8 النهائية في تشكيل PDMS (الشكل 1D). بعد خطوة الخبز، يتم قطع لوح PDMS إلى شرائح تُربط بشكل غير قابل للعكس على الشرائح الزجاجية (الشكل 1E). وأخيرًا، يتم توصيل الأنابيب (الشكل 1F).

يوضح الشكل 2 تصميم النظام الموائع الدقيق بالتفصيل. يتكون النظام من مدخلين للاستزراع، ومولد تدرج لخلط الركائز أو الأوساط المختلفة، ومخرج واحد. تبلغ أبعاد القنوات الرئيسية 50 µm x 10 µm (عرض × ارتفاع). يتكون كل جهاز من ست مصفوفات من مفاعلات PLBRs، تحتوي كل منها على 5 PLBRs. وينتج عن ذلك 30 مفاعلاً متوازياً داخل جهاز موائع دقيقة واحد.

الشكل 3 يوضح إنتاج القالب الرئيسي للتكرار. وكما هو موضح بالتفصيل في البروتوكول، يتم تصنيع طبقة أولى من SU-8 عن طريق التصوير الضوئي لـ SU-8 (الشكل 3أ). ويتم تطبيق إجراء مماثل للطبقة الثانية (الشكل 3ب). وللتحقق من هندسة القناة، قمنا بفحص ارتفاع PLBRs والقنوات الرئيسية باستخدام جهاز قياس المرتسمات (profilometer). في المثال الموضح في الشكل 3ج، تم قياس الطبقة الأولى (طبقة الاستزراع). وتظهر الطبقة هنا ارتفاعاً ثابتاً قدره 1,200 nm، وهو مناسب لاستزراع C. glutamicum في وسط BHI.

يوضح الشكل 4 إجراء تشكيل PDMS بدءاً من خلط PDMS (الشكل 4A) متبوعاً بعملية التشكيل (الشكل 4B) وأخيراً خطوة الربط (الشكل 4C). ويظهر الشكل 4D الشريحة الموائعية الدقيقة النهائية التي تدمج لوحاً زجاجياً بسمك 170 µm، وشريحة PDMS (بارتفاع 3 mm) تحتوي على مداخل ومخارج وإبر فولاذية متصلة بأنابيب. بعد التجربة، يمكن التخلص من الشريحة ولا يلزم إجراء تنظيف شامل. علاوة على ذلك، فإنها سهلة التجميع والتعامل، ولا تتطلب إجراء تعبئة معقد أو صعب.

مبدأ عمل الجهاز

يوضح الشكل 5 مبدأ عمل نظام المفاعل. يتم ضخ الخلايا في الجهاز الموائع الدقيقة، حيث تظل الخلايا الفردية محاصرة داخل PLBR ببساطة عن طريق التفاعلات مع جدار الخلية. ونظراً للاختلاف في المقاومة الهيدروديناميكية بين القناة وPLBR، يحدث تدفق أدنى فقط داخل PLBR. بعد استزراع PLBR (الشكل 5أ)، تبدأ مرحلة النمو والمراقبة عن طريق تغيير المحلول البكتيري إلى وسط نمو (الشكل 5ب). وبمجرد نمو الخلايا بشكل مفرط في PLBRs (الشكل 5ج)، يتم إيقاف التجربة عادةً، ويمكن حينها تحليل الصور المأخوذة بفاصل زمني. وللمزيد من التفاصيل حول آليات الاحتجاز وملف التدفق داخل PLBR، يُرجى مراجعة Grünberger et al.13 .

تحليل معدل النمو

يمكن تطبيق النظام الحالي لدراسة أنواع بكتيرية مختلفة فيما يتعلق بمعايير بيولوجية متنوعة مثل النمو أو المورفولوجيا أو الإشارة الفلورية. وفي مثال أول، تم استزراع C. glutamicum، وهو كائن إنتاجي ذو أهمية صناعية، تحت ظروف استزراع قياسية (T=30 °C، وسط CGXII21). يوضح الشكل 6A منحنيات النمو المشتقة من ثلاث مستعمرات ميكروبية متماثلة جينياً. ويستمر النمو الأسي حتىما تم ملء مفاعلات PLBRs، مما يشير إلى عدم حدوث نقص في المغذيات. ويعرض الشكل 6B أربع صور مجهرية بنظام DIC بتقنية التصوير الزمني لمستعمرة C. glutamicum نامية.

التحليل الفلوري

فيما يخص المجهر الفلوري أحادي الخلية، غالبًا ما يستخدم الباحثون بروتينات فلورية محددة، مثل GFP أو مشتقاته، لربط نمط ظاهري معين مثير للاهتمام بمخرج قابل للقياس (إشارة فلورية). ولإثبات قابلية تطبيق PBLR في دراسات التصوير الزمني القائمة على الفلورة، بحثنا في انبعاث الفلورة لـ *C. glutamicum* سلالة تنتج بروتين اندماج YFP-TetR مشفراً على بلازميد تحت تحكم Pتآزر الخلايا (tac) المحفز (pEKEx2-البروتين الفلوري الأصفر (YFP)-tetR)18,22في ظل وجود تركيزات منخفضة من المحدث (IPTG)، يكون التعبير عن Pتأكيد القبول (tac) يُعرف أنه يؤدي إلى تباين ملحوظ بين الخلايا في المجموعات البكتيرية متماثلة الجينات. وبدءاً من مستنبت أولي واحد، تم تتبع النمو والفلورة الخلوية الفردية لعدة مستعمرات دقيقة متماثلة الجينات. وكما يمكن ملاحظته في شكل 7لاحظنا تباينًا ظاهريًا بين المستعمرات الدقيقة المختلفة، وتباينًا على مستوى الخلية الواحدة داخل المستعمرات التي بدأت من خلية أم واحدة. إحدى المستعمرات (الشكل 7بأظهرت PLBR 1 عدم وجود انبعاث فلوري تقريبًا، بينما أظهرت خلايا PLBR 2 انبعاثًا فلوريًا منخفضًا بسبب المستوى القاعدي yfp-tetR التعبير عن Pتعبير TAC (اختصار لـ Tacrolimus) المُحفز. في PLBR 3، كان انبعاث الفلورة قوياً بشكل ملحوظ مقارنة بالمستعمرات الأخرى، ولوحظ توزيع واسع للمجتمع الخلوي. يوضح هذا المثال مدى قابلية تطبيق PLBR في دراسات مجهر الفلورة بنظام التصوير الزمني (time-lapse fluorescence microscopy). وبالمقارنة مع قياس التدفق الخلوي، الذي يمكن من خلاله تحديد فلورة الخلايا المفردة في نقطة زمنية واحدة، فإن الأنظمة الحالية تسمح بتتبع الخلايا ودراسة فلورة الخلية المفردة في الوقت الفعلي عبر أجيال عديدة.

مخطط لعملية إنتاج الرقاقة الإلكترونية يتضمن مراحل التصميم، والقناع، والرقاقة، والصب، والربط، والتجميع.
الشكل 1. نظرة عامة على عملية إنتاج رقاقة PLBR. تصنيع القالب الرئيسي: يبدأ بـ (A) التصميم، و(B) تصنيع قناع الطباعة الحجرية، و(C) إنتاج الرقاقة. إنتاج رقاقة PDMS-glass: يبدأ بـ (D) صب PDMS، يليه (E) ربط الزجاج و PDMS، و(F) التجميع النهائي للرقاقة.

مخططات لشريحة مائعات دقيقة مع قنوات تدفق محددة، لأبحاث فصل الخلايا وتحليلها.
الشكل 2. تصميم شريحة PLBR. (A) رسم CAD للشريحة المائعية الدقيقة بأكملها؛ (B) تكبير لمواقع مختارة من المخطط: يحتوي المخطط على مدخلين للوسط الغذائي (a1)، ومولد تدرج مع قنوات خلط (a2) و6 مصفوفات PLBR متوازية (b1). يوضح الشكل b2 وحدة PLBR واحدة، مدمجة في قناة سائلة بعرض 100 µm. يبلغ القطر الداخلي لـ PLBR 40 µm مع قنوات مغذيات بعرض 2 µm. ويبلغ طول مدخل الاستزراع 40 µm. يمثل اللون الوردي الطبقة الأولى (منطقة الاحتجاز والاستزراع) ويمثل اللون الأزرق الطبقة الثانية (نقل السوائل).

مخطط عملية التصنيع الدقيق مع خطوات الطباعة الضوئية باستخدام SU-8 ونتائج قياس الارتفاع.
الشكل 3. توضيح لعملية تصنيع الرقاقة المكونة من طبقتين. (A) تصنيع الطبقة الأولى التي تحتوي على هياكل الاحتجاز؛ (B) تصنيع الطبقة الثانية التي تحتوي على القنوات السائلة ومداخلي ومخارج السوائل؛ (C) مقاطع سطحية ممثلة للطبقة الأولى. في هذه الحالة، كان ارتفاع الطبقة الأولى 1,200 nm وتُستخدم لاستزراع C. glutamicum في وسط غذائي معقد.

مخطط عملية قالب PDMS؛ بنية شريحة الموائع الدقيقة مع طبقات SU8 وPDMS والزجاج؛ المداخل/المخارج.
الشكل 4. تصنيع الجهاز وشريحة نموذجية. توضيح لعملية قالب PDMS: (أ) خلط PDMS وإزالة الغازات؛ (ب) تشكيل قالب PDMS؛ (ج) تحرير القالب، والقص، وربط الشريحة. الشريحة النهائية (أُعيد إنتاجها بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء13): (د) صورة فوتوغرافية لشريحة PDMS تحتوي على مدخلين ومخرج واحد؛ (هـ) صورة CAD لست مصفوفات متوازية تحتوي كل منها على 5 من PLBRs؛ (و) صورة SEM لأحد الـ PLBR.

النمو البكتيري في جهاز مائع دقيق؛ قنوات التدفق الطبقي؛ تجهيزات PDMS؛ قنوات الفيضان والتغذية.
الشكل 5. مبدأ عمل نظام PLBR. (أ) مرحلة الاستزراع؛ (ب) مرحلة نمو المستعمرات البكتيرية الدقيقة؛ (ج) مرحلة الفيضان. أعيد إنتاجه بإذن من Royal Society of Chemistry13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.

مخطط نمو الخلايا مع صور مجهرية ميكروبية؛ ومعادلات لتحليل معدل النمو والنتائج.
الشكل 6. تحديد معدل نمو المستعمرات الدقيقة من النوع البري C. glutamicum. (أ) مخطط نمو لثلاث عمليات استنبات في مفاعل PLBR والمنحنيات الأسية الناتجة (أجزاء أعيد إنتاجها بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء)13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (ب) صور مجهرية بفاصل زمني لمستعمرة C. glutamicum أثناء النمو.

مخطط لعملية الزرع الميكروبي مع بيانات الفلورة؛ تظهر التجربة نمو الخلايا وتحليلها.
الشكل 7. تحليل عدم التجانس السكاني القائم على PBLR. يظهر في الشكل بكتيريا C. glutamicum التي تعبر عن اندماج yfp-tetR تحت تحكم محفز Ptac ‏(pEKEx2-yfp-tetR) في غياب المحفز IPTG. (أ) سير العمل التجريبي؛ (ب) ثلاث مستعمرات ميكروبية صغيرة متماثلة جينياً تظهر عدم التجانس من مستعمرة إلى أخرى ومن خلية إلى أخرى؛ (ج) توزيع الفلورة للخلية الواحدة داخل المستعمرات الميكروبية الصغيرة المعنية.

صورة مجهرية تقارن البنى المجهرية بفتحات استزراع مختلفة لتحليل المواد.
الشكل 8. صور بالمجهر الإلكتروني الماسح لمفاعلات PLBRs مختلفة. تظهر صور SEM فتحات الاستزراع لتحسين كفاءة الاحتجاز. (A) فتحات استزراع أكبر (B) فتحات استزراع أصغر (C) فتحات استزراع "مفتوحة" أكبر (D) فتحتان للاستزراع.

الخطوةالمشكلةالسبب المحتملمحلول
تصنيع الرقاقاتفقاعات الهواء المحتبسة في SU-8 أثناء عملية الخَبز اللينزيادة درجة الحرارة بسرعةاخبز عند درجة حرارة 95 °C و 65 °C عدة مرات
تصنيع الرقاقةهياكل SU-8 المختفية والتالفةإجراء تصنيع غير مثالي؛ الإجهاد الميكانيكي في هياكل SU-8تحسين المعايير مثل وقت الخَبز ووقت التعريض
تصنيع الرقائقطبقات SU-8 منخفضة أو عالية أو ذات سمك غير متساوٍمشكلة أثناء الطلاء الدورانيتحقق من معاملات جهاز الطلاء الدوراني وقاعدة تثبيت الرقاقة
ربط وتجميع الرقائق طيّ روابط ربط البروتين بالدهون (PLBRs)معلمات ربط الـ PDMS غير مثالية ضبط القدرة، وزمن التعرض للبلازما، وزمن الخبز بعد الترابط.
ربط وتجميع الرقاقاتالهياكل والجسيمات الملوثة في المفاعلات الحيوية ذات الطبقة المسامية (PLBRs)لم يتم تنظيف الرقاقة بشكل صحيحاستخدم شريط scotch-tape لتنظيف السطح 
ربط وتجميع الرقاقاتعدم كفاية الترابط بين PDMS والزجاجمعاملات الربط غير مثالية أو التنظيف غير كافٍ تحقق من إعدادات بلازما الأكسجين
تجربة الموائع الدقيقةتسرب السوائللم يتم ثقب فتحة المدخل/المخرج بشكل صحيح تحسين عملية ثقب الثقوب
تجربة الموائع الدقيقةتكون العديد من جزيئات PDMS الصغيرة أثناء عملية التعبئةلم يتم ثقب الفتحة بشكل صحيح تحسين عملية ثقب الثقوب
تجربة الموائع الدقيقة، الجانب البيولوجيعدم نمو الخلايابقايا المذيب من إجراء التنظيفقم بغسل الشريحة بشكل أكثر شمولاً قبل تحميل الخلايا، أو اترك المذيب يتبخر قبل عملية الربط.
تجربة الموائع الدقيقة، الجانب البيولوجيتغيير معدلات النموأسباب متنوعةالتحقق من المزرعة الأولية ودرجة الحرارة
تجربة الموائع الدقيقة، الجانب البيولوجيتغيرات مورفولوجيا الخلايا أثناء الزراعةمحدودية العناصر الغذائية أو تغير درجة الحرارةتحقق من الحاضنة والتدفق
تجربة الموائع الدقيقة، الجانب التقنيالانزياح الموضعي أثناء التصوير المجهري بفاصل زمنيتقلبات درجات الحرارةتحقق من مخطط درجة الحرارة قبل بدء التجارب حتى يتوقف التذبذب
تجربة الموائع الدقيقة، الجانب التقنيفقدان الخلايا أثناء الزراعةإلى ارتفاع مفاعل أعلى قليلاً تحسين ارتفاع المفاعل
تجربة الموائع الدقيقة، الجانب التقنيعدم الاحتجازارتفاع المفاعل منخفض للغاية تحسين ارتفاع المفاعل

الجدول 1. استكشاف الأخطاء وإصلاحها. يلخص هذا الجدول الجوانب الحرجة، والأخطاء الشائعة، والحلول الممكنة أثناء العمل التجريبي.

المناقشة

لقد وصفنا التصنيع والإعداد التجريبي وإجراءات التشغيل ذات الصلة لجهاز PDMS الموائع الدقيقة الذي يحتوي على العديد من (PLBRs) لتحليل الخلية المفردة للبكتيريا.

يسمح التصنيع الدقيق باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة بإجراء تعديلات سريعة لأبعاد الجهاز لمختلف الأحجام وأشكال البكتيريا. نقوم حاليا بتحسين المفاعل الحيوي بيكوليتر فيما يتعلق بزراعة الكائنات الحية الميكروبية المختلفة وإنتاجية الزراعة. من أجل زيادة كفاءة المحاصرة ، فإن هندسة المفاعل أيضا قيد التحسين. يوضح الشكل 8 أربعة أجهزة PLBR جديدة تم التحقق من صحتها حاليا. في جميع الأشكال ، أعيد تصميم قناة البذر فيما يتعلق بالعرض والشكل. من الناحية العملية ، يبدو أن هذا له تأثير على عدد الخلايا المحاصرة ، ولكنه يحتاج إلى مزيد من التحقيقات. كما تم تحقيق تحسينات كبيرة فيما يتعلق بكفاءة المحاصرة من خلال دمج قنوات فائضة إضافية مما يؤدي إلى ارتفاع التدفق الحراري عبر المفاعل ومحاصرة المزيد من الخلايا. ومع ذلك ، في نفس الوقت يزيد المرء من خطر غسل الخلايا أثناء الزراعة.

يعد الجهاز بديلا مثيرا للاهتمام للزراعة على نطاق واسع والتي تم استخدامها لعقود للتحقيق في عمليات النمو والإنتاج على مستوى الخلية الواحدة. ومع ذلك ، فإن لديها بعض المتطلبات المهمة: للمراقبة المتوازية للعديد من المفاعلات الحيوية بيكوليتر ، يعد الإعداد المجهري عالي الدقة والمحرك بالكامل مع تعويض انحراف التركيز إلزاميا. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى نظام حضانة للحفاظ على درجة حرارة الزراعة المطلوبة ثابتة طوال القياسات.

نحقق معدل نجاح بنسبة 95٪ في تصنيع الأجهزة. ترتبط المشكلات الرئيسية بالربط الزجاجي غير الفعال PDMS ، أو انهيار سقف PDMS ، أو تسرب السوائل (انظر الجدول 1 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها لمعظم المشكلات التي تحدث). على الرغم من أن العمل التجريبي يتم جزئيا في ظل ظروف غير معقمة ، إلا أننا نادرا ما نرى تلوثا أثناء التجارب ، بسبب نظام السوائل المغلق. تتميز أجهزة الموائع الدقيقة PDMS بشفافية بصرية ، وبالتالي ، يمكن استخدامها للحصول على دقة عالية في التصوير في الجسم الحي . على الرغم من أن PDMS يبدو مثاليا للتطبيق ، إلا أنه يتمتع بتقارب كبير مع الجزيئات الكارهة للماء ، مما يجعل استخدام المذيبات المستخدمة على نطاق واسع في عمليات التحفيز الحيوي للخلية بأكملها محدودا. ومع ذلك ، تتوفر الطلاءات المناسبة لتكييف البروتوكول مع هذه الأنواع من التطبيقات.

يعد PLBR المقترح مناسبا تماما للتحليل المكاني والزماني للأحداث الخلوية وحتى تحت الخلوية لأنواع مختلفة من البكتيريا. تكمن الميزة الرئيسية للنهج الحالي في القدرة على قياس نمو المستعمرات الدقيقة بشكل مباشر على عكس الطرق التقليدية. علاوة على ذلك ، يسمح PLBR بالزراعة في ظل ظروف محددة وثابتة. نظرا لأن النظام يسهل استخدام كميات صغيرة من الكواشف أو المواد ، فإنه يحمل مزايا كونه غير مكلف وقابل للتخصيص وقابل للتعديل إلى إنتاجية عالية. في الطرق التقليدية ، يتم أخذ متوسط قيم جميع السكان في الاعتبار عند تحليل الزراعة الميكروبية. علاوة على ذلك ، تحتاج الطرق الحالية إلى أخذ عينات يدوية يمكن أن تؤدي إلى تدهور العينات وبالتالي إلى أخطاء في القياس. يقدم PLBR وجهات نظر جديدة لتطوير العمليات الحيوية وتحليل عدم التجانس السكاني في علم الأحياء الدقيقة. يعد PLBR أداة واعدة لتطبيقات مختلفة في تطوير العمليات الحيوية ويمكن تطبيقه في مجالات البحث المختلفة ، مثل تحليل عدم التجانس من خلية إلى خلية ، وتحليل مجموعات خلايا معينة داخل سلالات الخلايا ، وفحص سلالات الإنتاج الميكروبي والتحقيق في الوقت الفعلي للأنماط الظاهرية للخلايا.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا الفني أغنيس مولر-شرور على مساهمتها القيمة. تم تنفيذ هذا العمل جزئيا في منشأة هيلمهولتز للإلكترونيات النانوية (HNF) في Forschungszentrum Jülich GmbH. المؤلفون ممتنون للمساعدة والدعم السخيين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
رقاقة السيليكون بقطر 100 مم ، P / BOR < ؛ 100>Si-MAT ، مواد السيليكون ، ألمانيا
مقاومة للضوء SU-8 2000.5Micro Resist Technology GmbH ، ألمانيا
مقاومة للضوء SU-8 2010Micro Resist Technology GmbH ، ألمانيا
SU-8 Developer mr DEV- 600Micro Resist Technology GmbH ، ألمانيا
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 مجموعةالمطاط الصناعي المصنوعة من السيليكونداو كورنينج. Farnell GmbH ، ألمانيا
توزيع الإبر نصائح دقيقة   27 G; المعرف = 0.2 مم ، OD = 0.42 ممNordson EFD Deutschland ، ألمانيا
ألواح زجاجية D263 T eco ، 30 مم × 25 مم × 0.17 ممSchott AG ، ألمانيا
ثقب الثقب AKA 5130-B-90Harris Uni-Core
Tubing Tygon S-54-HL ، المعرف = 0.25 مم ، OD = 0.76 ممSaint Gobain ؛ VWR International GmbH ، ألمانيا
محاقن يمكن التخلص منها &ndash ؛ Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo ، 1 ملB. Braun Melsungen AG ، ألمانيا552-183143
محاقن ، 1 مل محاقن زجاجية معقمةINNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS) ، ألمانيا
المواد الكيميائية
(NH4< / sub>) 2< / sub>SO4< / sub>Carl Roth GmbH + Co. KG ، ألمانيا
UreaCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
KH2PO4Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany
K2HPO4Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany
MgSO4& bull; 7H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, ألمانيا
MOPSCarl Roth GmbH + Co. KG, ألمانيا
FeSO4& bull; 7H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
MnSO4& bull; H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
ZnSO4& bull; 7H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
CuSO4Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany
NiCl2& bull; 6H2OCarl Roth GmbH + Co. KG ، ألمانيا
CaCl2< / sub>Carl Roth GmbH + Co. KG ، ألمانيا
BiotinCarl Roth GmbH + Co. KG ، ألمانيا
حمض البروكاتيتشويكCarl Roth GmbH + Co. KG ، ألمانيا
Glucose-MonohydrateCarl Roth GmbH + Co. KG ، ألمانيا
BHIBecton ، Dickinson
< em >Corynebacterium glutamicum < / em > ATTC 13032DSMZ ؛ Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany
Escherichia coli MG 1655DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany
Equipment
Wafer Cleaner SSEC 3300Solid State Equipment LLC
Spin Coater SPIN150 -NPPSPS Europe B.V.
قناع التقويم MA-6كارل سويس
لوح ساخن HP30A - 2علمي
Memmert UN 200منظف
بلازما FEMTODiener Electronics ، ألمانيا
مضخات حقنة MESYSCetoni GmbH ، ألمانيا
محرك مغناطيسي CB 162ستيوارتVWR 442-0304
مجهر نيكون اكليبس تينيكون
حاضنة مجهرPecon GmbH ، ألمانيا
الطرد المركزي minispin plus " الخط الأسود"Eppendorf9776501
مقياس الضوء الحيوي plus Eppendorf6132000008
هز قارورة شاكر / حاضنة 3031GFL - Gesellschaft fü r Labortechnik mbH ، ألمانيا
Profilometer ، Dektak 150 Stylus ProfilerVeeco
< td colspan = "4" >Cells فرن مختبر توري باينز مجهري

المراجع

  1. Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Single Cells. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 301-327 (2009).
  2. Wei, P., et al. Bacterial virulence proteins as tools to rewire kinase pathways in yeast and immune cells. Nature. 488, 384-388 (2012).
  3. Park, S., et al. Influence of topology on bacterial social interaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13910-13915 (1073).
  4. Lee, P. J., Helman, N. C., Lim, W. A., Hung, P. J. A microfluidic system for dynamic yeast cell imaging. BioTechniques. 44, 91-95 (2008).
  5. Kobel, S. A., et al. Automated analysis of single stem cells in microfluidic traps. Lab Chip. 12, 2843-2849 (2012).
  6. Carlo, D. D., Wu, L. Y., Lee, L. P. Dynamic single cell culture array. Lab Chip. 6, 1445-1449 (2006).
  7. Locke, J. C. W., Young, J. W., Fontes, M., Jimenez, M. J. H., Elowitz, M. B. Stochastic Pulse Regulation in Bacterial Stress Response. Science. 334, 366-369 (2011).
  8. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Fritzsch, F. S. O., et al. Picoliter nDEP traps enable time-resolved contactless single bacterial cell analysis in controlled microenvironments. Lab Chip. 13, 397-408 (2013).
  10. Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  11. Mather, W., Mondragon-Palomino, O., Danino, T., Hasty, J., Tsimring, L. S. Streaming Instability in Growing Cell Populations. Phys. Rev. Lett. 104, (2010).
  12. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr. Biol. 20, 1099-1103 (2010).
  13. Grunberger, A., et al. A disposable picolitre bioreactor for cultivation and investigation of industrially relevant bacteria on the single cell level. Lab Chip. 12, 2060-2068 (2012).
  14. Walden, M., Elf, J. Studying transcriptional interactions in single cells at sufficient resolution. Curr. Opin. Biotech. 22, 81-86 (2011).
  15. Keymer, J. E., Galajda, P., Lambert, G., Liao, D., Austin, R. H. Computation of mutual fitness by competing bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20269-20273 (2008).
  16. Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17290-17295 (2006).
  17. Grunberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnol. Bioeng. 110, 220-228 (2013).
  18. Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13, (2012).
  19. Mustafi, N., Grunberger, A., Kohlheyer, D., Bott, M., Frunzke, J. The development and application of a single-cell biosensor for the detection of L-methionine and branched-chain amino acids. Metab. Eng. 14, 449-457 (2012).
  20. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb. Cell Fact. 8, (2009).
  21. Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J. Bacteriol. 175, 5595-5603 (1993).
  22. Frunzke, J., Bramkamp, M., Schweitzer, J. E., Bott, M. Population Heterogeneity in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 caused by prophage CGP3. J. Bacteriol. 190, 5111-5119 (2008).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

بكتيريا Corynebacterium Glutamicumتصنيع رقاقة PDMSالطباعة الضوئية باستخدام SU-8المجهر المسرع (Time-lapse microscopy)تحضير المزرعة البكتيريةالتدفق المستمر للوسط الغذائيمستعمرات دقيقة متماثلة جينياًالتصوير الآلي
المفاعل الحيوي Picoliter Microfluidic لتحليل الخلية الميكروبية أحادية الخلية: التصنيع وإعداد النظام والتشغيل
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.