مقالة منهجية

من المنتج الطبيعي إلى Its العنقودية السكروز جين: تظاهرة طريق Polyketomycin من السبحية diastatochromogenes Tü6028

18.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54952

⸱

يناير 13, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Biology and Biotechnology, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Germany, 2Department of Chemistry and Biology, Universität Siegen

في هذه المقالة

ملخص

هنا نقدم بروتوكول مفصلة من (أ) تحديد نتاج طبيعي مع النشاط المضاد الحيوي، (ب) تطهير المجمع (C) النموذج الأول من الحيوي لها، (D) تسلسل الجينوم / -mining و( E) التحقق من الكتلة التخليق الحيوى الجينات.

الملخص

ومن المعروف أن سلالات السبحية لقدرتها على إنتاج الكثير من مركبات مختلفة مع مختلف bioactivities. زراعة في ظل ظروف مختلفة وغالبا ما يؤدي إلى إنتاج مركبات جديدة. لذلك، يتم استخراج الثقافات إنتاج سلالات مع خلات الإيثيل ويتم تحليل المستخلصات الخام بواسطة HPLC. وعلاوة على ذلك، يتم اختبار مقتطفات عن النشاط الحيوي من خلال فحوصات مختلفة. لبنية توضيح وتنقية مجمع الفائدة عن طريق مزيج من أساليب اللوني مختلفة.

تسلسل الجينوم جانب التعدين الجينوم يسمح بتحديد مجموعة المنتجات الطبيعية التخليق الحيوى الجينات باستخدام برامج الكمبيوتر المختلفة. لتأكيد أن تم التعرف على مجموعة الجينات الصحيحة، والتجارب تثبيط الجين يجب أن تؤديها. ويتم تحليل المسوخ الناتجة عن إنتاج منتج طبيعي معين. مرة واحدة وقد تم المعطل الكتلة الجينات الصحيحة،يجب أن تفشل سلالة لإنتاج مركب.

يظهر العمل للpolyketomycin مركب مضاد للجراثيم التي تنتجها السبحية diastatochromogenes Tü6028. منذ حوالي عشر سنوات، عندما كان تسلسل الجينوم لا تزال مكلفة للغاية، وكان الاستنساخ وتحديد مجموعة الجينات عملية تستغرق وقتا طويلا جدا. سريع تسلسل الجينوم جنبا إلى جنب مع التعدين الجينوم يسرع محاكمة تحديد العنقودية ويفتح طرق جديدة لاستكشاف الحيوي وتوليد المنتجات الطبيعية رواية بالطرق الوراثية. بروتوكول وصفها في هذه الورقة يمكن أن تسند إلى أي مركب آخر المستمدة من سلالة السبحية أو الكائنات الحية الدقيقة آخر.

المقدمة

وكانت منتجات الطبيعية من النباتات والكائنات الحية الدقيقة دائما مصدرا هاما لتطوير العقاقير السريرية والبحوث. تم اكتشاف أول البنسلين المضادات الحيوية في عام 1928 من فطر بواسطة الكسندر فليمنغ 1. في الوقت الحاضر، وتستخدم العديد من منتجات طبيعية أكثر في العلاج السريري.

واحد جنس المعروف عن قدرته على إنتاج أنواع مختلفة من المركبات الثانوية مع bioactivities المختلفة هو السبحية. السبحية هي إيجابية الجرام البكتيريا وتنتمي إلى فئة من شعاويات والنظام الشعاوات. وتستمد ما يقرب من ثلثي من المضادات الحيوية المستخدمة سريريا من الشعاوات، ومعظمهم من السبحية، مثل أمفوتيريسين 2، daptomycin 3 أو التتراسيكلين (4). وقد تم منح جائزتي نوبل في مجال السبحية البحوث المضادات الحيوية. ذهب أول من سلمان واكسمان لاكتشاف الستبرتوميسين، وعلى الأولtibiotic فعالة ضد مرض السل. 5 في عام 2015، كجزء من جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء والطب، وحصل على اكتشاف أفيرميكتين من avermitilis S. كذلك. يستخدم أفيرميكتين لعلاج الأمراض الطفيلية 6،7.

النهج التقليدي لاكتشاف المنتجات الطبيعية في الكائنات الحية الدقيقة مثل السبحية ينطوي عموما زراعة سلالة في ظل ظروف النمو المختلفة، وكذلك استخراج وتحليل المركبات الثانوية. يتم إجراء فحوصات النشاط الحيوي (على سبيل المثال فحوصات للنشاط مضاد للبكتيريا ومضاد للسرطان) للكشف عن نشاط المجمع. وأخيرا، يتم عزل مجمع الفائدة وإجمال التركيب الكيميائي.

وغالبا ما تتكون هياكل المنتجات الطبيعية من الأنصاف واحدة والتي تشكل الجزيئات المعقدة. وهناك عدد قليل، ولكن محدودة، مسارات السكروز الرئيسية المؤدية إلى بناء كتلةكانساس، والتي تستخدم لالحيوي من المنتجات الطبيعية. مسارات السكروز الرئيسية هي مسارات متعدد الكيتيد والممرات المؤدية إلى تيربينويدس وقلويدات والممرات باستخدام الأحماض الأمينية، والممرات المؤدية إلى الأنصاف السكر. ويتميز كل مسار من قبل مجموعة من إنزيمات معينة (8). وبناء على هيكل المركبة، هذه الإنزيمات السكروز يمكن التنبؤ بها.

في الوقت الحاضر، فإن التحليل الهيكلي التفصيلي للمجمع في تركيبة مع تسلسل الجيل القادم وتحليل بيوينفورمتيك يمكن أن تساعد على تحديد الكتلة الجين السكروز المسؤولة. يفتح المعلومات العنقودية طرقا جديدة لإجراء مزيد من البحوث المنتجات الطبيعية. وهذا يشمل تعبير مغايرة لزيادة الغلة من المنتجات الطبيعية، وتعديل المجمع الذي استهدفته الغارة بالحذف الجينات أو التعديل والحيوي اندماجي مع جينات من المسارات الأخرى.

تم عزل Polyketomycin بشكل مستقل من مرق ثقافةسلالتين، السبحية ليرة سورية. MK277-AF1 9 و السبحية diastatochromogenes Tü6028 10. تم توضيح الهيكل من خلال تحليل الرنين المغناطيسي والأشعة السينية. يتكون Polyketomycin من decaketid tetracyclic وحمض الصفصاف ثنائي ميثيل، وترتبط من قبل اثنين من الأنصاف deoxysugar β-D-amicetose وα-L-axenose. فإنه يعرض السامة للخلايا ونشاط المضادات الحيوية، حتى ضد سلالات البكتيريا إيجابية الغرام المقاوم للأدوية المتعددة مثل هذه الجرثومة 11.

تم إنشاء مكتبة كوزميد الجينومية س diastatochromogenes Tü6028 وفحص منذ سنوات عديدة. باستخدام جين معين تحقيقات الكتلة الجين polyketomycin بحجم 52.2 كيلوبايت، التي تحتوي على 41 الجينات، وتبين بعد عدة أشهر من العمل المكثف 12. مؤخرا، تم الحصول على تسلسل مشروع جينوم diastatochromogenes س تؤدي إلى تحديد سريع من الكتلة الجين السكروز polyketomycin. في هذا الاستعراض، وهي طريقة تساعد في الاتساعمنظمة حددت منتج طبيعي وتوضيح وسوف نتناول مجموعة الجين السكروز، وذلك باستخدام polyketomycin كمثال على ذلك.

نحن هنا شرح الخطوات واحدة والتي تؤدي من نتاج طبيعي لمجموعة لها الجين السكروز تعرض لpolyketomycin التي تنتجها السبحية diastatochromogenes Tü6028. ويضم بروتوكول تحديد وتنقية نتاج طبيعي مع خصائص المضادات الحيوية. التحليل البنيوي أخرى، ومقارنة مع النتائج من الجينوم التعدين تؤدي إلى تحديد مجموعة الجينات السكروز. ويمكن تطبيق هذا الإجراء على أي مركبة أخرى مستمدة من سلالة السبحية أو أي الكائنات الحية الدقيقة الأخرى.

البروتوكول

1. تحديد نتاج طبيعي مع المضادات الحيوية الملكية

  1. زراعة الكائنات الحية الدقيقة في ظل ظروف مختلفة (مثل الوقت ودرجة الحرارة، ودرجة الحموضة، وسائل الإعلام) في أعقاب "OSMAC (سلالة واحدة، العديد من المركبات) نهج" 13. اختر واحدة متوسطة الذي لوحظ إنتاج مركب.
  2. زراعة السبحية diastatochromogenes Tü6028 وفقا للشروط التالية
    1. تنمو السبحية diastatochromogenes سلالة Tü6026 على لوحات MS (طحين الصويا 20 غراما، D-مانيتول 20 غراما، MgCl 2 10 ملم، أجار 1.5٪، صنبور الماء 1 لتر). تطعيم حلقة صغيرة من الجراثيم من هذه السلالة إلى 20 مل TSB السائل المتوسطة (فول الصويا زيتية مرق 30 ز، ماء الصنبور 1 لتر، ودرجة الحموضة 7.2، preculture المتوسطة) في دورق مخروطي مع دوامة. هز قارورة على شاكر دوارة (28 درجة مئوية، 180 دورة في الدقيقة، 2 أيام).
    2. تطعيم ثقافة الرئيسية في 100 مل المتوسطة HA (الجلوكوز 4 ز، خلاصة الخميرة 4 ز، الشعيراستخراج 10 غرام، صنبور الماء 1 لتر، ودرجة الحموضة 7.2) مع 2 مل من preculture. ثقافة السلالة في 28 درجة مئوية لمدة 6 أيام على شاكر دوارة في 180 دورة في الدقيقة.
  3. إعداد استخراج النفط الخام
    1. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي (10 دقيقة، 3000 x ج).
    2. للخطوات التالية التعامل مع المذيبات العضوية تحت غطاء الدخان.
    3. لاستخراج المركب من المشيجة، وخلايا resuspend في حجم مزدوج من الأسيتون ويهز في أنبوب لمدة 30 دقيقة، 180 دورة في الدقيقة. تصفية السائل من خلال ورقة مرشح التجارية وتتبخر الأسيتون بواسطة المبخر الدوار عند 40 درجة مئوية و 550 بار. حل استخراج في 20 مل من الماء: خلات الإيثيل (1: 1) والتخلص منه في قمع فصل لمدة 30 دقيقة في 180 دورة في الدقيقة.
    4. لاستخراج المركب من مستنبت، وضبط مرق الثقافة لدرجة الحموضة 4.0 بإضافة 1 M حمض الهيدروكلوريك. إضافة 100 مل خلات الإيثيل والتخلص منه في قمع فصل لمدة 30 دقيقة، 180 دورة في الدقيقة.
    5. جمع مرحلة خلات الإيثيل وتتبخر قبل تعفن تبخر آرى عند 40 درجة مئوية و 240 بار.
  4. تحليل استخراج النفط الخام من قبل HPLC
    1. حل مقتطفات في 1 مل MeOH، تصفية لهم من خلال مرشح حجم 0.45 ميكرون المسام وتشغيل عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) 14.
    2. في حالة polyketomycin، تجهيز نظام HPLC مع precolumn C18 (4.6 × 20 ملم 2) وعمود C18 (4.6 × 100 مم 2). استخدام الانحدار الخطي من الأسيتونتريل + 0.5٪ حامض الخليك تتراوح ما بين 20٪ إلى 95٪ في H 2 O + 0.5٪ (معدل التدفق: 0.5 مل دقيقة -1) حامض الخليك.
      ملاحظة: Polyketomycin لديه الوقت الإبقاء على 25.9 دقيقة (انظر الشكل 1A). الطيف للأشعة فوق البنفسجية / فيما ديه ماكسيما في 242 نانومتر و 282 نانومتر و 446 نانومتر والدنيا في 262 نانومتر و 359 نانومتر (انظر الشكل 1B). في عمل سلبي كتلة من 863.2 [MH] - يمكن كشفها (انظر الشكل 1C).

"SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54952 / 54952fig1.jpg "/>
الشكل 1: LC / MS تحليل Polyketomycin. (A) HPLC اللوني (λ = 430 نانومتر) من استخراج النفط الخام بعد زراعة السبحية diastatochromogenes Tü6028 لمدة 6 أيام. Polyketomycin لديه الوقت الإبقاء على 25.9 دقيقة (B) للأشعة فوق البنفسجية / فيما أطياف Polyketomycin. (C) قداس أطياف Polyketomycin في عمل سلبي. ذروة الرئيسي مع م / ض 863.2 [MH] -. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. التعرف على النشاط المضاد الحيوي باستخدام القرص نشر فحص
    1. تطعيم سلالات اختبار مثل الرقيقة إيجابية الجرام البكتيريا العصوية (في LB المتوسطة، LB 20 غراما، صنبور الماء 1 لتر، ودرجة الحموضة 7.4) وغيرها من السلالات المتسلسلة (في TSB المتوسطة. زيتية مرق الصويا 30 غراما، صنبور الماء 1 لتر، ودرجة الحموضة 70.2)، والبكتيريا سالبة الجرام كولاي (في LB المتوسطة) والسلالات الفطرية (في وسائل الإعلام مثل YPD المتوسطة، خلاصة الخميرة 10 ز، ببتون 20 غراما، الجلوكوز 20 غراما، صنبور الماء 1 لتر، ودرجة الحموضة 7.4). أخذ 100 ميكرولتر من اختبار سلالة preculture ونشرها على لوحات أجار منها.
    2. حل استخراج النفط الخام أو المركب النقي في 500 ميكرولتر من الميثانول (بدلا من الماء أو DMSO) وماصة 20-50 ميكرولتر على أقراص رقة معقمة. أقراص ورقية جافة لمدة 30 دقيقة تحت مقاعد البدلاء العمل ووضعها على لوحات مع الثقافات اختبار. إعداد سيطرة سلبية (المذيبات) والسيطرة الايجابية (المضادات الحيوية، مثل أبراميسين [1 ملغ]).
    3. احتضان لوحات في ظل ظروف مناسبة حتى تزرع سلالات اختبار واضح وتحديد منطقة التثبيط، إذا اضحة. احتضان E. coli و س العصوية. عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة، السبحية ليرة سورية. عند 28 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام، سلالة الفطرية (التي تعتمد أساسا على سلالة اختبار دقيق) لر 30 درجة مئوية لمدة 2 أيام).

2. كبير استخراج مقياس وتنقية والبنية توضيح من مجمع

  1. زراعة diastatochromogenes س في 5 L المتوسطة HA (الجلوكوز 4 ز، خلاصة الخميرة 4 ز، الشعير استخراج 10 غرام، ماء الصنبور 1 لتر، ودرجة الحموضة 7.2). تطعيم 2 مل من preculture في 30 × 500 قوارير مل مخروطي يحتوي على 150 مل HA المتوسطة. احتضان سلالة عند 28 درجة مئوية لمدة 6 أيام على شاكر دوارة في 180 دورة في الدقيقة.
  2. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي (10 دقيقة، 15000 x ج، RT) واستخراج المركبات باستخدام خلات الإيثيل (انظر القسم 1.3).

figure-protocol-1
الشكل 2: سير العمل لبنية التوضيح. وتشمل عملية (1) زراعة سلالة، (2) استخراج، (3) تنقية عن طريق استخراج الصلبة مرحلة (SPE)، طبقة رقيقة اللوني (TLC)، إعدادي عالية الأداء اللوني السائل (HPLC)، وحجماللوني الاستبعاد (SEC) و (4) توضيح الهيكل عن طريق التحليل الشامل (MS)، الرنين النووي المغناطيسي (NMR) وقياسات الأشعة السينية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تنقية Polyketomycin
    ملاحظة: عملية تنقية وبنية التوضيح هو مبين في الشكل 2.
    1. يجزئ استخراج النفط الخام بحسب هذا العامود C18 الصلبة مرحلة الاستخراج (SPE) باستخدام 10٪ -stepwise التدرج MeOH تتراوح ما بين 30٪ إلى 100٪ MeOH في H 2 O، 100 مل لكل حالة.
    2. تنقية جزء التي تحتوي على مركب مزيد من إعدادي اللوني طبقة رقيقة (TLC) 15 باستخدام CH 2 الكلورين 2 / MeOH (7: 1) كنظام شطف.
    3. تنقية المركب من قبل HPLC إعدادي 16. تجهيز نظام HPLC مع precolumn C18 (5 ميكرون، 9.4 × 20 ملم) والعمود الرئيسي (5 ميكرون، 9.4 X 150 مم). استخدام التدرج من حمض الخليك الأسيتونتريل + 0.5٪ تتراوح بين 20٪ إلى 95٪ في H حامض الخليك 2 O + 0.5٪ (معدل التدفق: 2.0 مل / دقيقة).
    4. لإزالة المذيبات وغيرها من الشوائب الصغيرة، وإجراء تنقية الخطوة الأخيرة قبل استبعاد حجم اللوني باستخدام عمود في MeOH 17. جمع المركب النقي النهائي وتتبخر MeOH عن طريق التبخر دوار عند 40 درجة مئوية و 240 بار.
  2. توضيح هيكل
    1. حل المركب النقي (أكثر من 2 ملغ) في 600-700 ميكرولتر (هذا يعتمد على الجهاز) من DMSO- د 6، سجل 1D NMR (1 H، 13 C) و 2D NMR (HSQC، HMBC، 1 ح 1 ح مريح) الأطياف على مطياف الرنين المغناطيسي النووي (18). التعبير عن التحولات الكيميائية في القيم δ (جزء في المليون) باستخدام DMSO- د 6.
    2. تسجيل الطيف الكتلي عالية الدقة (HRESI-MS) 19 من polyketomycin باستخدام عالية الدقةمطياف الكتلة.
    3. توضيح الهيكل من خلال تفسير نتائج تحليل البيانات الرنين المغناطيسي النووي وMS 10.

3. اقتراح السكروز نموذج للمجمع معزولة جديد

  1. تحليل بنية مجمع معزول والتنبؤ والإنزيمات، والتي قد يكون متورطا في التركيب الحيوي لها. التنازل عنها لمتعدد الكيتيد (النوع الأول أو الثاني أو الثالث)، الببتيد التوليف غير الريباسي، lantipeptide، terpenoid، أو السكر الأيض المسار 8.
  2. مثال polyketomycin
    1. تقسيم الهيكل إلى الأنصاف واضحة واحدة: شاردة tetracyclic، واثنين من السكريات الأحادية وحمض الصفصاف ثنائي ميثيل.
    2. معرفة، حيث يمكن أن تستمد الأنصاف من: يمكن أن تستمد شاردة tetracyclic من نوع متعدد الكيتيد سينسيز الثاني ويمكن أن تستمد شاردة حمض الساليسيليك ثنائي ميثيل قبل تكرارية متعدد الكيتيد نوع سينسيز أولا الأنصاف السكر اثنين، والتي هي 6 deoxysugars ، قد يكون synthesiزد من الجلوكوز التي تنطوي على TDP-الجلوكوز 4،6-نازعة الماء أثناء الحيوي وتعلق على الأرجح من قبل اثنين من glycosyltransferases (انظر الشكل 3) 8.
    3. التنبؤ الجينات المفترضة في الكتلة. اعتقد من الانزيمات التي تشارك في توليف الأنصاف واحدة، في ربط وحدة، وكذلك في تعديل وتكييف الجزيء. الكتلة التخليق الحيوى الجينات من Polyketomycin على الأرجح يحتوي على جينات ترميز نوع متعدد الكيتيد سينسيز الثاني (وبالتالي الحد الأدنى لACP، KS α اوند KS β لربط وحدات الموسع)، والتكرار نوع متعدد الكيتيد سينسيز أنا (على الأقل ACP، AT، KS)، وهو TDP-الجلوكوز 4،6-نازعة الماء (ضروري للخطوة: الجلوكوز → deoxyglucose) واثنين من glycosyltransferases (ربط اثنين أحادية السكر إلى الجزء اللاسكري) 8.

figure-protocol-2
الرقم 3: هيكل Polyketomycin Dividإد في واحدة لبنات البناء. يتكون Polyketomycin من decaketid tetracyclic (PKS النوع الثاني) وثنائي ميثيل حمض الصفصاف (تكرارية PKS النوع الأول)، ويربطها به الأنصاف deoxysugar اثنين β-D-amicetose وα-L-axenose (الحاكم الجلوكوز-4،6- نازعة الماء واثنين من ناقلة الغليكوزيل المطلوبة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. تسلسل الجينوم / التعدين

  1. الجيل القادم التسلسل
    1. تسلسل الحمض النووي الجيني من تقنيات التسلسل الجيل القادم مثل البورشيد، 454 سلسلة البايرو أو الصلبة 20. محاذاة احد يقرأ لتسلسل إشارة أو التجمع من جديد.
      ملاحظة: تم التسلسل الجينوم س diastatochromogenes Tü6028 في مركز التكنولوجيا الحيوية (CeBiTec) في جامعة بيليفيلد. جميع يقرأ تم تجميعها لمشروع الجينوم7.9 ميجا بايت.
  2. التعدين الجينوم
    1. البحث عن أطر القراءة المفتوحة (ORFS) عن استخدام على سبيل المثال NCBI بدائيات النوى الجينوم الشرح خط 21،22، راست (الشرح السريع باستخدام تكنولوجيا الفرعي) 23،24،25، Prokka (السريع في بدائيات النواة الجينوم الشرح) 26 أو GenDB 27. كما تقترح هذه البرامج وظائفهم. تحليل S. diastatochromogenes Tü6028 مشروع الجينوم تسلسل أدى إلى التعرف على أكثر من 7000 ORFS.
    2. تشغيل انفجار معين (أساسي المحلية محاذاة البحث أداة) تحليل للحصول على المزيد من المعلومات مثل التحالفات مع جينات أخرى مماثلة والمجالات الحفازة 28،29،30.
    3. للتعرف على البرامج العنقودية المدى الثانوية الأيض الجينات مثل antiSMASH 31،32،33، NaPDoS 34 و NRPSpredictor 35،36. في مشروع جينوم السبحية diastatochromogenes antiSMASH 31،32،33 هوية منذfied 22 مجموعات الجينات.
    4. تحليل مجموعات الجينات المفترضة للمسار على الأنزيمي (ق) (متعدد الكيتيد سينسيز (النوع الأول أو الثاني أو الثالث)، غير الريبوسومي مخلقة الببتيد، lanthipeptide، terpenoid، التمثيل الغذائي للسكر ...). البحث عن الكتلة (ق) التي تحتوي على الجينات التي قد يكون متورطا في تركيب المركب (انظر القسم 3). في diastatochromogenes S. المشروح المجموعة 2 تحتوي متعدد الكيتيد نوع سينسيز الثاني الجينات، ثلاثة متعدد الكيتيد نوع سينسيز أنا الجينات، الجينات TDP-الجلوكوز 4،6-نازعة الماء واثنين من الجينات ناقلة الغليكوزيل (انظر الشكل 4).
    5. التركيز على جينات مفردة داخل الكتلة. لنوع PKS الأول وNRPS خصوصية acyltransferases والمجالات adenylation، وبالتالي إدراج وحدات الموسع واحد، ويمكن التنبؤ بها. أيضا مقارنة أجل وحدة الموسع تدمج مع الجزيء. يظهر antiSMASH 31،32،33 أيضا مجموعات مماثلة من مركبات معروفة، مع وصلة الى قاعدة بيانات MIBiG 37.
      6. قارن هيكل المركب مع هذه المركبات الأخرى، وتحقق من أوجه التشابه.

figure-protocol-3
الشكل 4: إخراج antiSMASH من Polyketomycin السكروز جين العنقودية ونظرة عامة على مجموعات أخرى في S. diastatochromogenes Tü6028. (أ) لمحة عامة عن مجموعات الجينات السكروز توقع في جينوم S. diastatochromogenes Tü6028. (ب) المجموعة 2 Polyketomycin مجموعة التخليق الحيوى الجينات مع الجينات المستهدفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. التأكيد من الكتلة السكروز جين

  1. بحث عن الجينات مع وظائف واضحة ومهمة (الأساسية) لالحيوي للمجمع. للتحقق من polyketoمجموعة الجينات mycin وpokPI الجينات، والترميز للα ketosynthase من نوع PKS الثاني، وقد تم اختيار والمعطل من قبل خارج الإطار -deletion (انظر الشكل 5B). بدلا من ذلك، يقطع الجينات عن طريق الاستنساخ شظية الداخلي (انظر الشكل 5C).

figure-protocol-4
الرقم 5: التحقق من كتلة جين واحد من قبل كروس. (A) الجينات الأصلية يؤدي إلى ترجمة بروتين فعال. (ب) الاستنساخ من الجينات مع حذف الداخلي في ناقلات انتحاري يؤدي إلى تقاطع واحد مما أدى إلى تحول الإطار في الجينات المستهدفة والترجمة اللاحقة للبروتين غير وظيفية. (ج) الاستنساخ لجزء الداخلي من الجينات في ناقلات انتحاري يؤدي إلى اقتطاع من الجين وترجمته لاحقة من بروتين غير وظيفية. أوريت: أصل رransfer. R المضادات الحيوية: المقاومة للمضادات الحيوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. استنساخ للبناء-كروس واحد
    1. تضخيم جزء يحتوي على pokPI بواسطة PCR 38 مع الاشعال pokPI_for وpokPI_rev.
    2. pKC1132 المنتج استنساخ PCR إلى ناقلات انتحاري 39 (أبراميسين R [50 ملغ / مل]). متجه الانتحار ليس قادرا على تكرار في سلالة السبحية، وبالتالي يجب أن الاندماج في الجينات المستهدفة من إعادة التركيب مثلي لتوفير أبراميسين المقاومة. نقل متجه إلى كولاي استنساخ المضيف عن طريق الحرارة صدمة التحول 40.
    3. عزل ناقلات التي كتبها قلوية تحلل 41.
    4. هضم الحمض النووي ناقلات مع واحد قطع انزيم التقييد الذي يمر داخل شظية. وpokPI جنرالتم هضمها ه مع انزيم كبن أولا
    5. علاج هضم الحمض النووي ناقلات مع كبير البلمرة DNA الأول (klenow) جزء، التي لديها 5 '→ 3 "النشاط البلمرة و3' → 5" نوكلياز خارجية النشاط. تصد من نهايات لزجة وreligation اللاحقة يؤدي إلى فقدان أربع قواعد. تحقق من فقدان هذه القواعد عن طريق تحويل الخطوات إلى كولاي XL1 الأزرق، واختيار المستعمرات واحد، وعزل DNA البلازميد، و41 و تحليل مزيد من الهضم التقييد والتسلسل.
  2. الإقتران للعبور واحد بناء في السبحية
    1. نقل ناقلات الانتحارية التي تحتوي على الجين pokPI (pKC1132_ pokPI ديل) مع الحذف في كولاي ET12567 pUZ8002 42 (كانامايسين R) عن طريق الحرارة صدمة التحول 40. احتضان الخلايا في 100 مل الإعلام LB (كانامايسين 50 ميكروغرام مل -1، أبراميسين 50 ميكروغرام مل -1
    2. مزيج 500 ميكرولتر كولاي pUZ8002 pKC1132_ pokPI ديل مع الثقافة 500 ميكرولتر السبحية diastatochromogenes (بدلا من استخدام الجراثيم). نشر الخليط على لوحات MS (طحين الصويا 20 غراما، D-مانيتول 20 غراما، MgCl 2 10 ملم، أجار 1.5٪، ماء الصنبور 1 لتر). احتضان لوحات لمدة 20 ساعة عند 28 درجة مئوية.
    3. تراكب كل لوحة مع أبراميسين (1.25 ملغ) وفوسفوميسين (5 ملغ) الذائبة في 1 مل من الماء والسماح لهم الجافة. احتضان لوحات لعدة أيام عند 28 درجة مئوية حتى exconjugants تكون مرئية.
  3. تحقق طفرات-كروس واحد
    1. تطعيم exconjugants واحدة في 20 مل المتوسطة TSB (أبراميسين 50 ملغ مل -1)، واحتضان لهم عند 28 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام و 180 دورة في الدقيقة.
    2. عزل الحمض النووي الجيني 43 وتحقق انقطاع الجين pokPI بواسطة PCR.
    3. تطعيم الحيوانات المستنسخة واحدة مع انقطاع الجينات التحقق منها والسبحية سلالة wildtype في 100 مل المتوسطة HA واحتضان لهم لمدة 6 أيام في 28 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. استخراج استخراج النفط الخام (انظر القسم 1.3). تحقق إنتاج المجمع من خلال تحليل HPLC-MS (انظر القسم 1.4). ذروة المقابلة في اللوني HPLC وكتلة المجمع لا ينبغي أن يكون اكتشاف أي أكثر (انظر الشكل 6).

figure-protocol-5
الشكل 6: تحليل HPLC من diastatochromogenes S. مع المعطل pokPI جين. HPLC اللوني (λ = 430 نانومتر) من استخراج النفط الخام س diastatochromogenes WT (أعلى) وسلالة متحولة مع توقف pokPI -Gen (أدناه). سلالة متحولة لا ينتج polyketomycin بعد الآن.الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

في هذا الاستعراض وصفنا الخطوات واحدة من التعرف على مضاد حيوي يؤدي إلى مجموعة لها الجين السكروز. قبل عدة سنوات ونحن المستنسخة مكتبة كوزميد، وتعبئتها لهم في فاجات، transduced E. القولونية الخلايا المضيفة، وكان لفحص الآلاف من المستعمرات للتعرف على الحيوانات المستنسخة وجود مناطق متداخلة من مجموعة polyketomycin. كان تسلسل cosmids أيضا عملية صعبة ومكلفة 12.

من أجل إجراء المزيد من الدراسات على سلالة نحن التسلسل الجينوم كله من السبحية diastatochromogenes Tü6028. مع مشروع تسلسل الجينوم حددنا بسهولة الكتلة الجين السكروز من polyketomycin والمجموعات الأخرى ترميز مركبات واعدة. يقارن الشكل 7 طريقة "القديم" من تحديد الكتلة السكروز عن طريق الاستنساخ من مكتبة كوزميد وفحص مسهب، والطريقة "الجديدة" من قبل تسلسل الجينوم كله مع التعدين الجينوم لاحقا على نطاق ووقت عصيب. تقنيات التسلسل الجديدة والبرامج التعدين الجينوم جديدة تسريع العملية برمتها.

figure-results-1
الرقم 7: مقارنة بين "القديم" وأسلوب "جديد" من تعيين لجين العنقودية السكروز. ويتألف أسلوب "القديمة" استنساخ مكتبة كوزميد مع نخبة من الحيوانات المستنسخة الإيجابية وتسلسل كوزميد منها (ق) (أعلاه)؛ يتضمن أسلوب "الجديد" كامل تسلسل الجينوم و-mining لتحديد جميع مجموعات الجينات الأيض الثانوية تقع على الجينوم من سلالة (أدناه). وترد مدة من الخطوات واحدة على نطاق ووقت عصيب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

في هذا المختبر تم إنشاء مكتبة كوزميد الجينومية من diastatochromogenes السبحية وفحص قبل سنوات عديدة، مما أدى إلى تحديد الكتلة polyketomycin الجينات من خلال عملية للغاية تستغرق وقتا طويلا. كان توصيف جينات مفردة من الممكن استخدام الحذف الجينات المستهدفة وتحليل المسوخ الناتج 12. مؤخرا، تم الحصول على تسلسل مشروع جينوم diastatochromogenes S. السماح تحديد سريع من الكتلة الجين السكروز polyketomycin. نحن يمكن بسهولة اكتشاف جينات السكروز، على الرغم من أن تسلسل مشروع الجينوم يحتوي يزال العديد من contigs. عملية وصفها لا يمكن أن يتحقق في غضون أشهر. ومع ذلك، يشتمل الإجراء العديد من الخطوات. قد تفشل الخطوات واحدة عدة مرات، ومنع التقدم إلى الخطوات اللاحقة:

ومن المعروف أن جنس السبحية لقدرتها على إنتاج المركبات الحيوية النشطة. في حين أنها تحمل في كثير من الأحيان أكثر من 20 السيرمجموعات الجينات ynthetic، وعادة ما يتم إنتاج مركبات احد أو اثنين فقط تحت ظروف المختبر. تطبيق نهج OSMAC (زراعة سلالة واحدة في ظل ظروف مختلفة) أن يستيقظ مجموعات الجينات الصامتة أحيانا قد لا يكون كافيا. التلاعب الجيني للجينات التنظيمية، مثل الجينات منظم عديد المظاهر adpA 44 و bldA 45،46، هو أيضا وسيلة فعالة لتنشيط إنتاج المركبات الثانوية الأخرى.

للتوضيح لهيكل المجمع، مثلا عن طريق تحليل الرنين المغناطيسي، عادة ما تكون أكثر من 2 ملغ من مجمع تنقية ضروري. لذلك، غالبا ما يتطلب تخمر الثقافة أكثر من 10 لتر. بدون تخمير قادرة على الحفاظ على الأكسجين، ودرجة الحموضة ودرجة الحرارة الظروف، قد يكون تحديا في مختبر صغير للتعامل مع هذا القدر من الثقافة واستخراج لاحق. خلال تنقية، قد يتم تغيير المجمع بسبب الأكسدة والإشعاع أو درجة الحرارة.أيضا، يتم استخدام مزيد من الخطوات لتنقية، وارتفاع فرصة للتدهور.

عند تحليل هيكل المنتجات الطبيعية، ومجموعات في الجينوم، وأحيانا ليس من السهل تحديد الكتلة المناسبة. أولا، إذا كان هناك ليست سوى سلسلة مشروع الجينوم جزء من الكتلة قد يكون في عداد المفقودين. ثانيا، ليست كل الجينات التي مطلوبة من أجل الحيوي هي في الكتلة. ثالثا، وأحيانا يتم تقسيم مجموعة إلى قسمين فصلها عن بعضها البعض من خلال العديد من kilobases. رابعا، قد يكون من الصعب تحديد واحد الذي هو الكتلة الجينات المناسبة. في حالة كبيرة نوع PKS أنا أو أنظمة NRPS، حيث أنه من الممكن لحساب عدد الوحدات الموسع استنادا إلى عدد من وحدات، أو حتى تحديد وحدات الموسع واحدة من خلال تحليل المجالات اختيار، فإنه يتحول بسهولة. ومع ذلك، في حالة العمل بشكل متكرر الانزيمات التنبؤ من المركبات توليفها في كثير من الأحيان غير ممكن، وخاصة إذا كان سترافي أكثر من 40 مجموعات الجينات. خامسا، والطبيعة هي معقدة للغاية ومليئة المركبات غير معروف حتى الآن. في كثير من الأحيان الحيوي هو خليط من مسارات مختلفة. إذا لم يتم تحديد المركب الجديد بعد، أو لا علاقة لمركب آخر، قد يكون من الصعب تحديد الكتلة، إلى اقتراح نموذج الحيوي ولاثبات ذلك.

بعد أن يتم تحديد الكتلة، وتقنية كروس واحد هو وسيلة جيدة وسريعة للتحقق من فرضية. PCR، استنساخ في ناقلات الانتحار، الاقتران، واختيار من الحيوانات المستنسخة إيجابية، وفحص الانتاج هي الخطوات المطلوبة فقط. عيب واحد من هذه التقنية هو أن التكامل بين ناقلات في كروموسوم غير مستقر بسبب المزيد من الأحداث إعادة التركيب. ولذلك، من أجل مواصلة تحليل الجينات واحدة، يطلب حذف الجينات دقيقة. كما أنها قد تكون صعبة للتلاعب سلالات السبحية على المستوى الجيني.

الإجراء الموضح يمكن تعيين رس أي مركبة أخرى تنتجها سلالة السبحية أو الكائنات الحية الدقيقة آخر. المعرفة حول مجموعة الجين السكروز ومجمعها توليفها يعطينا مزيدا من الفرص لتعديل بالفعل الجزيئات الموجودة بهدف تحسينها لمكافحة الجراثيم المقاومة للأدوية المتعددة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

S. Zhang ممول من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني. يعرب المؤلفون عن امتنانهم الشديد للأشخاص السابقين الذين يعملون في مشروع polyketomycin في هذا المختبر والبروفيسور الدكتور هانز بيتر فيدلر ، جامعة توبنغن ، لتوفير منتج البوليكيتومايسين. تم دعم البحث من قبل DFG (RTG 1976).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
agarCarl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيا5210.4
agaroseCarl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيا6352.4
D-mannitol Carl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيا4175.1
جلوكوز Carl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيا6780.1
LB Carl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانياX964.3
مستخلص الشعير   ؛Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, GermanyX976.2
MgCl2Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany2189.1
Peptone Carl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيا
دقيق الصويا   ؛W.Schoenemberger GmbH ، Magstadt ، ألمانيامرق
الصويا التريبتيكCarl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانياX938.3Caso-Bouillon
  ؛Carl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيا2363.2
Solvents< / strong >
acidicacid Carl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيا3738.5
Acetone  ؛Carl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيا9372.2
AcetonitrileAvantor Performance Materials B.V. ، Deventer ، هولنداJT-9012-03
Dichlorofrom  ؛Fisher Scientific GmbH ، Schwerte ، ألمانيا1530754
DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) CarlRoth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيا4720.1
DMSO-d6< / sub> (ثنائي ميثيل سلفوكسيد-د6< / sub>) 99.9 ذرة٪ DARMAR Chemicals ، D & ouml ؛ تينغن ، سويسرا15200.204
أسيتات الإيثيلCarl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيا6784.4
حمض الهيدروكلوريكCarl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيا6331.4
ميثانولCarl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيا7342.1
Enzymes< / قوي>
إنزيمات التقييد NewEngland Biolabs GmbH ، فرانكفورت أم ماين ، ألمانيا
البوليميراز   ؛New England Biolabs GmbH ، فرانكفورت أم ماين ، ألمانيا
DNA Polymerase I Large (Klenow) FragmentPromega GmbH ، مانهايم ، ألمانيا
Antibiotics< / strong>
apramycinAppliChem GmbH ، دارمشتات ، ألمانيا   ؛A7682.0005
fosfomycinSigma-Aldrich Chemie GmbH ، Taufkirchen ، ألمانياP5396-50G
kanamycinCarl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانياT832.2
Plasmid / Vectors< / strong>
pKC1132Bierman et al.< / em> 1992
primer& نب سب. < / strong>
pokPI_forTGATGGTGCCGCTGGCCATGGالتمهيدي لتضخيم الجزء الذي يحتوي على جين
pokPI_revAGCGTTCACTGTTCCGCCCCGAC
<قوي>سلالات بكتيرية< قوية>
Bacillus subtilis< / em> COHN ATCC6051سلالة اختبار إيجابية الجرام 
الإشريكية القولونية ET12567 pUZ8002 MacNeil et al.< / em> 1992سلالة للاقتران
الإشريكية القولونية < / em> XL1 BlueAgilient Technologies ، سانتا كلارا ، الولايات المتحدة الأمريكيةسلالة اختبار سلبية الجرام + مضيف الاستنساخ   ؛
Streptomyces diastatochromogenes< / em> Tü 6028Paululat et al.< / em> ، 1999Polyketomycin
Online services< / strong>
antismash (المضادات الحيوية وقذيفة تحليل المستقلب الثانوي)http://antismash.secondarymetabolites.org/الكشف عن مجموعة
BLAST (أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية)http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiيجد مناطق التشابه بين التسلسلات البيولوجية
GenDBhttps://www.uni-giessen.de/fbz/fb08/Inst/bioinformatik/software/gendbالتعليق التوضيحي ل ORFs   ؛
MiBIG (الحد الأدنى من المعلومات حول مجموعة جينات التخليق الحيوي)http://mibig.secondarymetabolites.org/قاعدة بيانات مجموعات الجينات التخليقية الحيوية
NaPDoShttp://napdos.ucsd.edu/الكشف عن مجموعة
NCBI خط أنابيب التعليقات التوضيحية للجينوم بدائية النواة NCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/شرح ORFs & nbsp ؛
NRPSpredictorhttp://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/الكشف عن مجالات
Prokka (تعليق توضيحي سريع للجينوم بدائية النواة)http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtmlل ORFs & nbsp ؛
RAST (التعليق التوضيحي السريع باستخدام تقنية الأنظمة الفرعية)http://rast.nmpdr.org/التعليق التوضيحي ل ORFs 
برامج أخرى
Chem Station Rev. A.09.03Agilent Technologies, Waldbronn, GermanyHandling program for HPLC 
Clone Manager Suite 7Scientific and Educational Software, Cary, USADesigning Simulator Experiment 
Newbler v2.8Roche Diagnosticsمحاذاة التسلسل يقرأ
Machines  جهاز طرد مركزي < / strong>
Avanti J-6000 ، Rotor JA-10Beckman Coulter GmbH ، Krefeld ، ألمانيا
HPLC / MSAgilent Technologies ، Waldbronn ، ألمانيا
_Autosampler: G1313AAgilent Technologies ، Waldbronn ، ألمانيا
_Pre العمود: XBridge C18 (20 مم × 4.6 مم ؛ حجم الجسيمات: 3.5 & micro; م)شركة Agilent Technologies، والدبرون، ألمانيا
_Column:Xbridge C18 (100 مم وأورات؛ 4.6 مم؛ حجم الجسيمات: 3.5 & م)Agilent Technologies ، Waldbronn ، ألمانيا
_semi إعداد العمود المسبق: Zorbax B-C18 (9.4 × 150 مم ؛ حجم الجسيمات: 5 & ميكرو; م)Agilent Technologies ، Waldbronn ، ألمانيا
_semi عمود الإعداد: Zorbax B-C18 (9.4 × 20 مم ؛ حجم الجسيمات: 5 & ميكرو; م)Agilent Technologies، Waldbronn، ألمانيا
_Degasser: G1322A ؛Agilent Technologies ، والدبرون ، ألمانيا
_Quarternary المضخة: G1311AAgilent Technologies ، والدبرون ، ألمانيا
_Diode كاشف المصفوفة (DAD) G1315B (&lambda ؛ = 254 نانومتر و 400 نانومتر) AgilentTechnologies ، والدبرون ، ألمانيا
_Quadrupole كاشف الكتلة (MSD) G1946D (2-3000 م / ز)Agilent Technologies ، والدبرون ، ألمانيا
المبخر
الدوار _heating حمام Hei-VAP Value / G3Heidolph Instruments GmbH & Co.KG ، شواباخ ، ألمانيا
_vacuum نظام المضخة SC 920 GKNF & nbsp ؛ الاستراتيجيات العالمية  AG, Sursee, Switzerland
مواد أخرى
Sephadex LH20GE Healthcare, 
Chromafil PVDF-45 / 15MS (حجم المسام 0.45 وميكرو ؛ m; مرشح Ø 15 مم)MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Dü ren, Germany
SPE column Oasis HLB 20 35 cc (6g)Waters GmbH, Eschborn, Germany 
الإشريكية القولونية  < / em>Carl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيامتوسط: LB ، التركيب: LB ، المبلغ إلى 1 L H2< / sub>O: 20 g
Bacillus  < / em>Carl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيامتوسط: LB ، التركيب: LB ، المبلغ إلى 1 لتر H 2 < / sub >O: 20 g
Streptomyces < / em > sp.Carl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيامتوسط: TSB ، التركيب: CASO Boullion ، المبلغ إلى 1 لتر H2< / sub>O: 30 جرام
فطر   ؛Carl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيامتوسط: YPD ، التركيب: مستخلص الخميرة ، الكمية إلى 1 لتر H2< / sub>O: 10 جرام
فطر   ؛Carl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيامتوسط: YPD ، التركيب: Peptone ، المبلغ إلى 1 لتر H2< / sub>O: 20 جرام
فطر   ؛Carl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه ، ألمانيامتوسط: YPD ، التركيب: الجلوكوز ، الكمية حتى 1 لتر H2< / sub>O: 20 g
لألواح أجار تضاف 2٪ أجار
Hensec-Vollsoja مستخلص خميرة pokPI منتج جينات المستقلب الثانويةجينات المستقلب المنفصلNRPS تعليق توضيحي

المراجع

  1. Fleming, A. On the antibacterial action of cultures of a penicillin, with special reference to their use in isolation of B. influenzae. Br J Exp Pathol. 10 (3), 226-236 (1929).
  2. Lemke, A., Kiderlen, A. F., Kayser, O. Amphotericin B. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68 (2), 151-162 (2005).
  3. Kirkpatrick, P., Raja, A., LaBonte, J., Lebbos, J. Daptomycin. Nat. Rev. Drug Discov. 2 (12), 943-944 (2003).
  4. Zakeri, B., Wright, G. D. Chemical biology of tetracycline antibiotics. Biochem. cell Biol. 86 (2), 124-136 (2008).
  5. Schatz, A., Bugle, E., Waksman, S. A. Streptomycin, a Substance Exhibiting Antibiotic Activity Against Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria. Exp. Biol. Med. 55 (1), 66-69 (1944).
  6. Burg, R. W., et al. Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: producing organism and fermentation. Antimicrob. Agents Chemother. 15 (3), 361-367 (1979).
  7. Egerton, J. R., Ostlind, D. A., et al. Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: efficacy of the B1a component. Antimicrob. Agents Chemother. 15 (3), 372-378 (1979).
  8. Walsh, C. T., Fischbach, M. A. Natural products version 2.0: connecting genes to molecules. J. Am. Chem. Soc. 132 (8), 2469-2493 (2010).
  9. Momose, I., et al. Polyketomycin, a new antibiotic from Streptomyces sp. MK277-AF1. II. Structure determination. J. Antibiot. (Tokyo). 51 (1), 26-32 (1998).
  10. Paululat, T., Zeeck, A., Gutterer, J. M., Fiedler, H. P. Biosynthesis of polyketomycin produced by Streptomyces diastatochromogenes.Tü6028. J. Antibiot. (Tokyo). 52 (2), 96-101 (1999).
  11. Momose, I., et al. Polyketomycin, a new antibiotic from Streptomyces. sp. MK277-AF1. I. Taxonomy, production, isolation, physico-chemical properties and biological activities. J. Antibiot. (Tokyo). 51 (1), 21-25 (1998).
  12. Daum, M., et al. Organisation of the biosynthetic gene cluster and tailoring enzymes in the biosynthesis of the tetracyclic quinone glycoside antibiotic polyketomycin. Chembiochem. 10 (6), 1073-1083 (2009).
  13. Bode, H. B., Bethe, B., Höfs, R., Zeeck, A. Big effects from small changes: possible ways to explore nature's chemical diversity. Chembiochem. 3 (7), 619-627 (2002).
  14. Wolfender, J. -L. HPLC in Natural Product Analysis: The Detection Issue. Planta Med. 75 (07), 719-734 (2009).
  15. Stahl, E. Thin-layer chromatography. A laboratory handbook. , 2nd edition (1967).
  16. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Glajch, J. L. Preparative HPLC Separation. Pract. HPLC Method Dev. , 616-642 (2012).
  17. Granath, K. A., Kvist, B. E. Molecular weight distribution analysis by gel chromatography on sephadex. J. Chromatogr. A. 28, 69-81 (1967).
  18. Jackman, L. M., Sternhell, S. Application of Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy in Organic Chemistry. Int. Ser. Org. Chem. , (1969).
  19. Xian, F., Hendrickson, C. L., Marshall, A. G. High resolution mass spectrometry. Anal. Chem. 84 (2), 708-719 (2012).
  20. Metzker, M. L. Sequencing technologies - the next generation. Nat. Rev. Genet. 11 (1), 31-46 (2010).
  21. Tatusova, T., et al. Prokaryotic Genome Annotation Pipeline. NCBI Handb. 2nd Ed. , (2013).
  22. Angiuoli, S. V., et al. Toward an online repository of Standard Operating Procedures (SOPs) for (meta)genomic annotation. OMICS. 12 (2), 137-141 (2008).
  23. Aziz, R. K., et al. The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology. BMC Genomics. 9, 75(2008).
  24. Overbeek, R., et al. The SEED and the Rapid Annotation of microbial genomes using Subsystems Technology (RAST). Nucleic Acids Res. 42, 206-214 (2014).
  25. Brettin, T., et al. RASTtk: a modular and extensible implementation of the RAST algorithm for building custom annotation pipelines and annotating batches of genomes. Sci. Rep. 5, 8365(2015).
  26. Seemann, T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 30 (14), 2068-2069 (2014).
  27. Meyer, F. GenDB--an open source genome annotation system for prokaryote genomes. Nucleic Acids Res. 31 (8), 2187-2195 (2003).
  28. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  29. Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. NCBI Handb. 2nd Ed. , Chapter 16 (2003).
  30. Marchler-Bauer, A., et al. CDD: NCBI's conserved domain database. Nucleic Acids Res. 43, (Database issue) 222-226 (2014).
  31. Medema, M. H., et al. antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences. Nucleic Acids Res. 39, (Web Server issue) 339-346 (2011).
  32. Blin, K., et al. antiSMASH 2.0--a versatile platform for genome mining of secondary metabolite producers. Nucleic Acids Res. 41, (Web Server issue) 204-212 (2013).
  33. Weber, T., et al. antiSMASH 3.0 - a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Res. 43, (W1) 237-243 (2015).
  34. Ziemert, N., et al. The natural product domain seeker NaPDoS: a phylogeny based bioinformatic tool to classify secondary metabolite gene diversity. PLoS One. 7 (3), 34064(2012).
  35. Rausch, C., Weber, T., Kohlbacher, O., Wohlleben, W., Huson, D. H. Specificity prediction of adenylation domains in nonribosomal peptide synthetases (NRPS) using transductive support vector machines (TSVMs). Nucleic Acids Res. 33 (18), 5799-5808 (2005).
  36. Röttig, M., et al. NRPSSpredictor2--a web server for predicting NRPS adenylation domain specificity. Nucleic Acids Res. 39, (Web Server issue) 362-367 (2011).
  37. Medema, M. H., et al. Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster. Nat. Chem. Biol. 11 (9), 625-631 (2015).
  38. Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51, Pt 1 263-273 (1986).
  39. Bierman, M., et al. Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp. Gene. 116 (1), 43-49 (1992).
  40. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli.using the heat shock method. J. Vis. Exp. (6), e253(2007).
  41. Bimboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  42. MacNeil, D. J., et al. Analysis of Streptomyces avermitilis. genes required for avermectin biosynthesis utilizing a novel integration vector. Gene. 111 (1), 61-68 (1992).
  43. Pospiech, A., Neumann, B. A versatile quick-prep of genomic DNA from Gram-positive bacteria. Trends Genet. 11 (6), 217-218 (1995).
  44. Makitrynskyy, R., et al. Pleiotropic regulatory genes bldA, adpA and absB are implicated in production of phosphoglycolipid antibiotic moenomycin. Open Biol. 3 (10), 130121(2013).
  45. Kalan, L., et al. A cryptic polyene biosynthetic gene cluster in Streptomyces calvus is expressed upon complementation with a functional bldA gene. Chem. Biol. 20 (10), 1214-1224 (2013).
  46. Gessner, A., et al. Changing Biosynthetic Profiles by Expressing bldA in Streptomyces Strains. ChemBioChem. 16 (15), 2244-2252 (2015).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التخليق الحيوي للبوليكيتوميسينتنقيب الجينومتحديد العنقود الجينيتنقية المنتجات الطبيعيةتحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)مقايسة الانتشار القرصيتعطيل الجيناتتحليل AntiSMASH
من المنتج الطبيعي إلى Its العنقودية السكروز جين: تظاهرة طريق Polyketomycin من السبحية diastatochromogenes Tü6028
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.