نحن وصف طريقه لبناء الاجهزه للثقافة 3D والتجريب مع الخلايا والهيكل العضوي متعدد الخلية. يسمح هذا الجهاز بتحليل الاستجابات الخلوية للإشارات القابلة للذوبان في البيئات المجهرية ثلاثية الابعاد مع تدرجات تشيمواتراكتانت محدده. Organoids هي أفضل من خلايا واحده في الكشف عن المدخلات الضعيفة الصاخبة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل ثلاثي الابعاد للاستجابات متعددة الخلايا لتدرجات تشيمواتراكتانت
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد أثارت القيود المختلفة لنظم الثقافة الخلية 2D الاهتمام في ثقافة الخلية 3D ومنصات التحليل ، والتي من شانها ان تحاكي بشكل أفضل التعقيد المكاني والكيميائي للانسجه الحية وتقليد في وظائف الانسجه المجرية. وقد يسرت التطورات الاخيره في تكنولوجيات التصنيع المجهري تطوير بيئات ثلاثية الابعاد في المختبر يمكن فيها دمج الخلايا في مصفوفة واضحة المعالم خارج الخلية (ECM) ومجموعه محدده من الجزيئات البيولوجية المرتبطة القابلة للذوبان أو المصفوفة. غير ان الحواجز التكنولوجية قد حدت من استخدامها علي نطاق واسع في مختبرات البحوث. هنا ، ونحن وصف طريقه لبناء أجهزه بسيطه للثقافة 3D والتجريب مع الخلايا والعضوية المتعددة الخلية في البيئات المجهرية 3D مع التدرج تشيمواتراكتانت محدده. ونحن نوضح استخدام هذه المنصة لتحليل استجابه الخلايا الظهاريه والعضوية العضوية لتدرجات عوامل النمو ، مثل عامل نمو البشرة (EGF). وكانت التدرجات EGF مستقره في الاجهزه لعده أيام مما ادي إلى تشكيل فرع الموجهة في الثدي العضوي. وقد سمح لنا هذا التحليل بالخلوص إلى ان استشعار التدرج الجماعي من قبل مجموعات من الخلايا أكثر حساسية مقارنه بالخلايا المفردة. ونحن أيضا وصف طريقه التصنيع ، والتي لا تتطلب مرافق التصوير الضوئي ولا تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة المتقدمة. سيكون هذا الأسلوب مفيدا لدراسة السلوكيات الخلوية ثلاثية الابعاد في سياق تحليل التطور والحالات المرضية ، بما في ذلك السرطان.
المقدمة
في البيئة الفسيولوجية ، يتم تضمين الخلايا في مصفوفة خارج الخلية (ECM) وتتعرض لكثرة من الجزيئات الحيوية. التفاعلات بين الخلايا والبيئة المجهرية المحيطة تنظم العمليات داخل الخلايا السيطرة علي الأنماط الظاهرية المتنوعة ، بما في ذلك الهجرة والنمو والتمايز والبقاء علي قيد الحياة1،2. وقد تعلمت الكثير عن السلوكيات الخلوية في ثقافة خليه ثنائيه الابعاد التقليدية. ومع ذلك ، مع ظهور التصوير الانترافيتال والتجريب مع الخلايا المضمنة في الهلام المائي ثلاثي الابعاد ، تم التعرف علي الاختلافات الهامه في سلوكيات الخلايا في الثقافات المبسطة ثنائيه الابعاد في المختبر مقابل بيئات تشبه الانسجه ثلاثية الابعاد. بينما تتفاعل الخلايا م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أجريت جميع الاعمال الحيوانية وفقا للبروتوكولات التي استعرضتها ووافقت عليها اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها ، جامعه جونز هوبكنز ، كليه الطب.
1. تصنيع جهاز الجريان الوسطي
- تصميم قناع العفن للجهاز PDMS باستخدام برنامج CAD 3D.
- اطبع القالب باستخدام معدات التصوير الفراغي مع الراتنج المقاوم للحرارة.
ملاحظه: تم تنفيذ الإجراءات الموصوفة هنا بواسطة خدمه طباعه ثلاثية الابعاد تجاريه. - اخلط جيدا محلول مونومير PDMS مع عامل المعالجة بنسبه 10:1. 3 مل من خليط PDMS كان مطلوبا لتصنيع الجهاز. الحجم الكلي يعتمد علي عدد من قوالب لتكون ملفقه.
- Degas الخليط عن طريق تطبيق فراغ مع استخدام فراغ مختبر في المنزل أ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
EGF هو منظم أساسي من النشاه المتفرعة في الغدد الثديية وتشيمواتراكتانت الحرجة توجيه هجره الخلايا الظهاريه الثدي في نمو السرطان الغازية. استخدمنا الاجهزه ميسوسكوبيك فلويديك المذكورة أعلاه لدراسة استجابه الخلايا لتحديد التدرجات egf (الشكل 1a، B)10. الجهاز يعطي مساحة الثقافة 5 ملم واسعه ، 10 ملم طويلة ، و 1 مم طويل القامة. فصلت الجوانب من الثقافة منطقه من ابار مفتوحة باعمده سداسية, اي يكون استعملت ان فخ ال [ECM] سائله وخلي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم اجراء تصنيع قوالب PDMS باستخدام خدمه الطباعة 3D التجارية ، ولكن يمكن أيضا ان يتحقق من قبل الطابعة 3D نهاية عاليه في المنزل. من بين مختلف أساليب التصنيع ثلاثي الابعاد ، ينصح بالتصوير المجسم لتوليد العفن عالي الدقة. لان معالجه PDMS يحدث في درجه حرارة عاليه (80 درجه مئوية) ، يجب ان تكون المواد مقاومه حراريا بما فيه الكفاية ، والتي ينبغي ان تكون محدده بوضوح ، إذا تم الاستعانة بمصادر خارجيه للطباعة. ويمكن مناقشه الحرارية بعد العلاج مع شركه خدمه الطباعة لزيادة المقاومة الحرارية للجزء. يتم تحديد تفاصيل خدمه الطباعة والمواد ف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
وكان هذا العمل مدعوما بالمنح المقدمة إلى الجمعية الخيرية (NSF PD-11-7246 ، ومؤسسه بحوث سرطان الثدي (BCRF) ، والU54 CA210173) وال (U54CA209992).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 22 مم × 22 مم غطاء ؛ | فيشر ساينتفيك | 12-542-B | |
| كولاجين I ، جرذ | فيشر Scientific | CB-40236 | |
| كولاجينيز | سيجما ألدريتش | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | تستخدم لمحاكاة ديناميكيات الانتشار | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME / F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF بروتين الفأر المؤتلف | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) | تقنيات الحياة | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | تستخدم لقياس طول الزوايا المتفرعة | ||
| Gentamicin | GIBCO & nbsp ؛ | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| مناديل منخفضة الوبر | Kimberly-Clark Professional | Kimtech مسح | |
| القالب المواد | مختبرات بروتو | أكورا SL5530 | |
| معدات طباعة القوالب | مختبرات Proto | Stereolithogrphy | الأبعاد القصوى: 127 مم × 127 مم × 63.5 مم ، نعومة الطبقة: 0.0254 مم |
| خدمة طباعة القوالب | مختبرات بروتو | مخصصة | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | VWR | 16777-164P | |
| الغزل متحد البؤر مجموعة المجهر | Solamere Technology | ||
| Group Sylgard 184 | علوم المجهر الإلكتروني | 184 SIL ELAST KIT | مجموعة PDMS |
| تربسين | سيجما ألدريتش | T9935 |
المراجع
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging p....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
