نحن وصف طريقه لبناء الاجهزه للثقافة 3D والتجريب مع الخلايا والهيكل العضوي متعدد الخلية. يسمح هذا الجهاز بتحليل الاستجابات الخلوية للإشارات القابلة للذوبان في البيئات المجهرية ثلاثية الابعاد مع تدرجات تشيمواتراكتانت محدده. Organoids هي أفضل من خلايا واحده في الكشف عن المدخلات الضعيفة الصاخبة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل ثلاثي الابعاد للاستجابات متعددة الخلايا لتدرجات تشيمواتراكتانت
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد أثارت القيود المختلفة لنظم الثقافة الخلية 2D الاهتمام في ثقافة الخلية 3D ومنصات التحليل ، والتي من شانها ان تحاكي بشكل أفضل التعقيد المكاني والكيميائي للانسجه الحية وتقليد في وظائف الانسجه المجرية. وقد يسرت التطورات الاخيره في تكنولوجيات التصنيع المجهري تطوير بيئات ثلاثية الابعاد في المختبر يمكن فيها دمج الخلايا في مصفوفة واضحة المعالم خارج الخلية (ECM) ومجموعه محدده من الجزيئات البيولوجية المرتبطة القابلة للذوبان أو المصفوفة. غير ان الحواجز التكنولوجية قد حدت من استخدامها علي نطاق واسع في مختبرات البحوث. هنا ، ونحن وصف طريقه لبناء أجهزه بسيطه للثقافة 3D والتجريب مع الخلايا والعضوية المتعددة الخلية في البيئات المجهرية 3D مع التدرج تشيمواتراكتانت محدده. ونحن نوضح استخدام هذه المنصة لتحليل استجابه الخلايا الظهاريه والعضوية العضوية لتدرجات عوامل النمو ، مثل عامل نمو البشرة (EGF). وكانت التدرجات EGF مستقره في الاجهزه لعده أيام مما ادي إلى تشكيل فرع الموجهة في الثدي العضوي. وقد سمح لنا هذا التحليل بالخلوص إلى ان استشعار التدرج الجماعي من قبل مجموعات من الخلايا أكثر حساسية مقارنه بالخلايا المفردة. ونحن أيضا وصف طريقه التصنيع ، والتي لا تتطلب مرافق التصوير الضوئي ولا تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة المتقدمة. سيكون هذا الأسلوب مفيدا لدراسة السلوكيات الخلوية ثلاثية الابعاد في سياق تحليل التطور والحالات المرضية ، بما في ذلك السرطان.
المقدمة
في البيئة الفسيولوجية ، يتم تضمين الخلايا في مصفوفة خارج الخلية (ECM) وتتعرض لكثرة من الجزيئات الحيوية. التفاعلات بين الخلايا والبيئة المجهرية المحيطة تنظم العمليات داخل الخلايا السيطرة علي الأنماط الظاهرية المتنوعة ، بما في ذلك الهجرة والنمو والتمايز والبقاء علي قيد الحياة1،2. وقد تعلمت الكثير عن السلوكيات الخلوية في ثقافة خليه ثنائيه الابعاد التقليدية. ومع ذلك ، مع ظهور التصوير الانترافيتال والتجريب مع الخلايا المضمنة في الهلام المائي ثلاثي الابعاد ، تم التعرف علي الاختلافات الهامه في سلوكيات الخلايا في الثقافات المبسطة ثنائيه الابعاد في المختبر مقابل بيئات تشبه الانسجه ثلاثية الابعاد. بينما تتفاعل الخلايا مع ألياف ECM وتستشعر خواصها الميكانيكية داخل المصفوفة ثلاثية الابعاد ، فان الصلابة المادية للجل ليست متغيرا مستقلا تماما في نظام ثنائي الابعاد في المختبر. الابعاد يغير تشكيل التصاق البؤري ، مما يؤدي إلى شكل الخلية المختلفة والسلوك. وعلاوة علي ذلك ، تتعرض الخلايا علي سطح ثنائي الابعاد لإشارات اقل من الخلايا المفتوحة لجميع الاتجاات في الابعاد الثلاثية.
وقد زادت هذه القيود من الاهتمام بالانظمه ثلاثية الابعاد التي تمثل التعقيد المكاني والكيميائي للانسجه الحية والتنبؤ بشكل أفضل بوظائف الانسجه المجرية. وقد وضعت في اشكال كثيره من organoids كما الذاتي تجميع الهياكل الخلوية إلى خلايا تتخللها عشوائيا في ECM3,4. وقد يسرت التطورات الاخيره في تكنولوجيات التصنيع المجهري ظهور أنواع مختلفه من نظم الثقافة ثلاثية الابعاد5، 6،7،8،9 لدراسة التغيرات الظاهرية الاستجابات الخلوية للإشارات القابلة للذوبان; بيد ان الحواجز التكنولوجية تحد من الاستخدام الواسع النطاق في مختبرات البحوث. في كثير من الحالات ، تتطلب عمليات التصنيع تقنيات التصوير الضوئي والمعارف الخلفية للطباعة الحجرية الناعمة. وعلاوة علي ذلك ، يجب السيطرة علي عوامل مختلفه لبناء جهاز بنجاح وتحقيق وظيفة الأمثل للجهاز علي مدي فتره طويلة من الزمن.
طريقتنا يصف كيفيه بناء جهاز PDMS 3D لدمج الخلايا والعضوية المتعددة الخلية في البيئة المجهرية 3D مع التدرجات تشيمواتراكتانت المحددة ومن ثم تحليل الاستجابات الظهاريه إلى EGF10. بياناتنا تكشف عن ان قدره organoids للرد علي التدرجات EGF الضحلة تنشا من اقتران الكيميائية بين الخلايا من خلال تقاطعات الفجوة. وهو يوحي بقدره العضو العضوي علي الكشف بدقه أكبر عن المدخلات الضعيفة والصاخبة المصنفة مكانيا. عمليه التصنيع لا تتطلب مرفق غرفه الأبحاث ولا تقنيات التصوير الضوئي. ومع ذلك ، فان جهاز PDMS ثلاثي الابعاد يتضمن العوامل الضرورية للبيئة الفسيولوجية ثلاثية الابعاد. هذه الطريقة ستكون مفيده لدراسة السلوكيات الخلوية ثلاثية الابعاد ولديها إمكانات بحثيه كبيره مع أنواع مختلفه من الخلايا ، تشيمواتراكتانتس ، وتركيبات ECM.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أجريت جميع الاعمال الحيوانية وفقا للبروتوكولات التي استعرضتها ووافقت عليها اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها ، جامعه جونز هوبكنز ، كليه الطب.
1. تصنيع جهاز الجريان الوسطي
- تصميم قناع العفن للجهاز PDMS باستخدام برنامج CAD 3D.
- اطبع القالب باستخدام معدات التصوير الفراغي مع الراتنج المقاوم للحرارة.
ملاحظه: تم تنفيذ الإجراءات الموصوفة هنا بواسطة خدمه طباعه ثلاثية الابعاد تجاريه. - اخلط جيدا محلول مونومير PDMS مع عامل المعالجة بنسبه 10:1. 3 مل من خليط PDMS كان مطلوبا لتصنيع الجهاز. الحجم الكلي يعتمد علي عدد من قوالب لتكون ملفقه.
- Degas الخليط عن طريق تطبيق فراغ مع استخدام فراغ مختبر في المنزل أو مضخة فراغ في المجفف فراغ لمده 1 ساعة.
- ربت سطح القالب مع شريط لاصق لأزاله الغبار ، ومن ثم صب خليط PDMS إلى العفن. إذا تم إدخال فقاعات في هذه العملية ، وتكرار التفريغ في المجفف فراغ. فقاعات المحاصرين بين أعمده من العفن يمكن ازالتها بدس لهم مع ابره حاده.
ملاحظه: يجب ان يتم عمليه التفريغ في درجه حرارة الغرفة في غضون ساعة واحده أو اقل. - علاج PDMS عن طريق التدفئة في 80 درجه مئوية لمده 2 ساعة. السماح للقالب لتهدئه في درجه حرارة الغرفة.
- قطع الحدود بين العفن و PDMS مع شفره ثم قشر قباله PDMS من العفن بعناية.
- تقليم الجزء pdms لتناسب 22 مم × 22 ملم كوفيرسليب ولكمه ثقب في مدخل.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. - تنظيف الجزء pdms و 22 مم × 22 ملم كوفيرسليب عن طريق مسح الأسطح مع انسجه منخفضه الوبر و 70 ٪ الايثانول. ثم قم بازاله جزيئات الغبار الكبيرة عن طريق الضباب بشريط لاصق.
- تعقيم الجزء pdms وكوفيرسليب اما عن طريق التعقيم (121 درجه مئوية لمده 8 دقائق الرطب ، 15 دقيقه جافه) أو التعرض للاشعه فوق البنفسجية لمده 1 ساعة.
- علاج السطح السفلي للجزء PDMS وتغطيه زلة مع بندقية التفريغ كورونا لمده 5 دقائق في النسيج الثقافة هود ومن ثم السندات لهم معا.
تحذير: وضع اي مواد غير الاجراء مثل رغوة البوليسترين في الجزء السفلي وأزاله جميع المواد التي تجري خلال هذه العملية. حقن الكولاجين في الجهاز علي الفور ، في غضون 5 دقائق ، بعد العلاج لزيادة الترابط بين هلام الكولاجين والزجاج coverslip.
2. اعداد الخلية: العزل العضوي الثديية الاوليه
ملاحظه: يمكن العثور علي تفاصيل العزلة organoid الثديية في العمل السابق11. يمكن اعداد اي نوع من خليه واحده أو organoid وفقا لبروتوكولات العزلة/مفرزه الخاصة بهم.
- فرم نسيج الغدة الثديية من الفئران مع مشرط حتى يرتاح النسيج ويهز لمده 30 دقيقه في 37 درجه مئوية في 50 مل من محلول كولاجيناز/التريبسين (10 مل لكل ماوس) في DEME/F12 تستكمل مع 0.1 غرام من التريبسين ، 0.1 غرام من كولاجيناز ، 5 مل من ال250 الواحدة ، والتي تبلغ μL 1 ميكروغرام/مل الانسولين ، و 50 μL من 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين.
- الطرد المركزي الحل كولاجيناز/التريبسين في 1,250 x g لمده 10 دقيقه أزاله ماده طافي عن طريق الطموح. تفريق الخلايا في 10 مل من DMEM/F12 ، وأجهزه الطرد المركزي في 1,250 x g لمده 10 دقيقه. بعد أزاله DMEM/F12 عن طريق الطموح ، أعاده تعليق الخلايا في 4 مل من DMEM/F12 تستكمل مع 40 μL من DNase (2 وحده/μL).
- يهز حل DNase باليد ل 2-5 دقيقه ومن ثم أجهزه الطرد المركزي في 1,250 x g لمده 10 دقيقه.
- منفصلة organoids من خلايا واحده من خلال أربعه سينتريفوجيشنز التفاضلية (النبض إلى 1,250 x g ووقف الطرد المركزي 3-4 s بعد ان تصل إلى السرعة المقصودة). بين كل نبضه ، يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 10 مل من dmem/F12.
- أعاده تعليق بيليه النهائي في المبلغ المطلوب من متوسط نمو DMEM/F12 مع 1 ٪ البنسلين/ستربتوميسين و 1 ٪ الانسولين-ترانسفيرين-السيلينيوم-X لاعداد الكولاجين.
3. اعداد الكولاجين والحقن
ملاحظه: يمكن اعداد أنواع أخرى من الهلام ECM وفقا لبروتوكولات دبق الخاصة بهم.
- اعداد الكولاجين نوع I الحل (3.78 ملغ/مل) ، 10x DMEM ، 1 N NaOH الحل ، متوسط النمو العادي علي الجليد.
ملاحظه: الاحتفاظ علي الجليد حتى يتم إكمال الاجراء. - أضافه 6 μL من 1 N NaOH الحل ، 200 μL من المتوسطة النمو و 50 μL من 10x DMEM إلى أنبوب الطرد المركزي قبل المبردة ومزيج الحل تماما.
- أضف 425 μL من الكولاجين إلى المحلول المختلط مسبقا واخلطه جيدا عن طريق التنضيد.
- الطرد المركزي خليط الكولاجين لفتره وجيزة (اقل من 5 ثوان) لفصل وأزاله فقاعات من الخليط.
- الحفاظ علي محلول الكولاجين تحييد علي الجليد لمده 1 ساعة للحث علي تشكيل ألياف.
- أضافه 50 μL من تعليق الخلية في خليط الكولاجين وتخلط جيدا.
ملاحظه: تركيز الكولاجين النهائي هو 2 ملغ/مل. - حقن المحلول باستخدام ماصه pipet-x 200 μL من خلال مدخل الجهاز PDMS حتى يتم ملء الغرفة بأكملها في. إذا كان خليط الكولاجين يفيض من خلال الفجوات من الركائز ، وقطع هلام الكولاجين الزائدة مع شفره جراحيه حاده بعد gelation.
- الحفاظ علي الجهاز في الحاضنة في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2 لمده 1 ساعة للحث علي gelation.
- ملء الخزانات علي كلا الجانبين مع متوسط النمو والحفاظ علي الجهاز في الحاضنة في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2 حتى يتم تنفيذ التصوير البؤري.
4-التصوير الثلاثي الابعاد والقياس الكمي
- تثبيت الخلية الحية التصوير الثقافة الغرفة إلى المجهر البؤري وقبل تعيين درجه الحرارة و CO2 إلى 37 درجه مئوية و 5 ٪ ، علي التوالي. للحصول علي الرطوبة ، أضافه الماء في خزان الغرفة ووضع مناديل مبلله في الغرفة إذا لزم الأمر.
- وضع جهاز PDMS في الغرفة وأضافه EGF إلى واحد من الخزان باعتباره ' مصدر ' EGF في تشكيل التدرج. سيخدم الخزان الآخر ' بالوعة ' اللازمة لتطوير توزيع EGF المتدرج مكانيا. تمت أضافه 2.5 nM من EGF في بالوعة لجعل الانحدار من 0.5 nM/mm في هذه الدراسة.
- تعيين نطاق Z-المكدس تغطي حجم العضوية من الاهتمام وبدء التصوير.
تحذير: لتجنب السمية الضوئية ، جرب كثافة الليزر الأقل في التصوير البؤري أو استخدم تقنيات التصوير متعدد الفوتونات. - أعاده بناء صوره ثلاثية الابعاد من مكدسات الصور ثنائيه الابعاد باستخدام برامج تجاريه أو برنامج مخصص. قياس طول وزاوية الفروع الممتدة من الهيكل العضوي أو هجره الخلايا الفردية. هنا ، قم باجراء القياس الكمي عن طريق رسم الخطوط العريضة اليدوية حول الجسم العضوي باستخدام ImageJ.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
EGF هو منظم أساسي من النشاه المتفرعة في الغدد الثديية وتشيمواتراكتانت الحرجة توجيه هجره الخلايا الظهاريه الثدي في نمو السرطان الغازية. استخدمنا الاجهزه ميسوسكوبيك فلويديك المذكورة أعلاه لدراسة استجابه الخلايا لتحديد التدرجات egf (الشكل 1a، B)10. الجهاز يعطي مساحة الثقافة 5 ملم واسعه ، 10 ملم طويلة ، و 1 مم طويل القامة. فصلت الجوانب من الثقافة منطقه من ابار مفتوحة باعمده سداسية, اي يكون استعملت ان فخ ال [ECM] سائله وخلي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم اجراء تصنيع قوالب PDMS باستخدام خدمه الطباعة 3D التجارية ، ولكن يمكن أيضا ان يتحقق من قبل الطابعة 3D نهاية عاليه في المنزل. من بين مختلف أساليب التصنيع ثلاثي الابعاد ، ينصح بالتصوير المجسم لتوليد العفن عالي الدقة. لان معالجه PDMS يحدث في درجه حرارة عاليه (80 درجه مئوية) ، يجب ان تكون المواد مقاومه حراريا بما فيه الكفاية ، والتي ينبغي ان تكون محدده بوضوح ، إذا تم الاستعانة بمصادر خارجيه للطباعة. ويمكن مناقشه الحرارية بعد العلاج مع شركه خدمه الطباعة لزيادة المقاومة الحرارية للجزء. يتم تحديد تفاصيل خدمه الطباعة والمواد ف...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
وكان هذا العمل مدعوما بالمنح المقدمة إلى الجمعية الخيرية (NSF PD-11-7246 ، ومؤسسه بحوث سرطان الثدي (BCRF) ، والU54 CA210173) وال (U54CA209992).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 22 مم × 22 مم غطاء ؛ | فيشر ساينتفيك | 12-542-B | |
| كولاجين I ، جرذ | فيشر Scientific | CB-40236 | |
| كولاجينيز | سيجما ألدريتش | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | تستخدم لمحاكاة ديناميكيات الانتشار | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME / F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF بروتين الفأر المؤتلف | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) | تقنيات الحياة | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | تستخدم لقياس طول الزوايا المتفرعة | ||
| Gentamicin | GIBCO & nbsp ؛ | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| مناديل منخفضة الوبر | Kimberly-Clark Professional | Kimtech مسح | |
| القالب المواد | مختبرات بروتو | أكورا SL5530 | |
| معدات طباعة القوالب | مختبرات Proto | Stereolithogrphy | الأبعاد القصوى: 127 مم × 127 مم × 63.5 مم ، نعومة الطبقة: 0.0254 مم |
| خدمة طباعة القوالب | مختبرات بروتو | مخصصة | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | VWR | 16777-164P | |
| الغزل متحد البؤر مجموعة المجهر | Solamere Technology | ||
| Group Sylgard 184 | علوم المجهر الإلكتروني | 184 SIL ELAST KIT | مجموعة PDMS |
| تربسين | سيجما ألدريتش | T9935 |
المراجع
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720(2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
