يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في النواة مرحبا C في خلايا دروسوفيلا

4.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62106

⸱

سبتمبر 15, 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

في هذه المقالة

ملخص

يتم تنظيم الجينوم في الفضاء النووي في هياكل مختلفة يمكن الكشف عنها من خلال تقنيات التقاط تكوين الكروموسومات. توفر طريقة Hi-C في النواة مجموعة على مستوى الجينوم من تفاعلات الكروماتين في خطوط خلايا Drosophila ، والتي تولد خرائط اتصال يمكن استكشافها بدقة megabase على مستوى جزء التقييد.

الملخص

يتم تنظيم الجينوم في مجالات ربط طوبولوجية (TADs) محددة بحدود تعزل التفاعلات بين المجالات. وفي دروسوفيلا، لا تزال الآليات الكامنة وراء تكوين هذا المرض وحدوده قيد التحقيق. ساعد تطبيق طريقة Hi-C في النواة الموصوفة هنا على تشريح وظيفة مواقع الربط للبروتين المعماري (AP) عند حدود TAD التي تعزل جين Notch. يؤدي التعديل الوراثي لحدود النطاقات التي تسبب فقدان APs إلى دمج TAD ، والعيوب النسخية ، والتعديلات الطوبولوجية طويلة المدى. وقدمت هذه النتائج أدلة تثبت مساهمة العناصر الوراثية في تكوين حدود النطاق والتحكم في التعبير الجيني في دروسوفيلا. هنا، تم وصف طريقة Hi-C في النواة بالتفصيل، والتي توفر نقاط تفتيش مهمة لتقييم جودة التجربة جنبا إلى جنب مع البروتوكول. كما تظهر الأعداد المطلوبة من قراءات التسلسل وأزواج Hi-C الصالحة لتحليل التفاعلات الجينومية على نطاقات جينومية مختلفة. ويمكن أن يكون التحرير الجيني بوساطة CRISPR/Cas9 للعناصر التنظيمية والتنميط عالي الاستبانة للتفاعلات الجينية باستخدام هذا البروتوكول Hi-C في النواة مزيجا قويا للتحقيق في الوظيفة الهيكلية للعناصر الوراثية.

المقدمة

في eukaryotes ، يتم تقسيم الجينوم إلى كروموسومات تحتل مناطق محددة في الفضاء النووي خلال مرحلة ما بين المراحل1. يمكن تقسيم الكروماتين الذي يشكل الكروموسومات إلى ولايتين رئيسيتين: واحدة من الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه والمتساهل نسخيا ، والآخر من الكروماتين المضغوط القمعي النسخي. هذه الدول الكروماتين فصل ونادرا ما تختلط في الفضاء النووي، وتشكيل اثنين من مقصورات متميزة في النواة2. على مقياس قاعدة تحت megabase، حدود مجالات منفصلة من التفاعلات الكروماتين عالية التردد، ودعا TADs، التي علامة المنظمة الكروموسومية3،4،5. في الثدييات، وتحتل حدود TAD من قبل عامل التماسك وCCTC ملزمة (CTCF)6،7،8. المجمع التماسك ينقذ الكروماتين وتوقف في مواقع الربط CTCF التي يتم التخلص منها في اتجاه متقارب في تسلسل الجينوم لتشكيل حلقات الكروماتين مستقرة9،10،13،14. اضطراب وراثي من موقع ربط الحمض النووي CTCF عند الحدود أو الحد من CTCF ووفرة البروتين التماسك النتائج في تفاعلات غير طبيعية بين العناصر التنظيمية، وفقدان تشكيل TAD، والتعبير الجيني إلغاء الضوابطالتنظيمية 9،10،11،13،14.

في Drosophila ، تحتل الحدود بين TADs العديد من APs ، بما في ذلك عامل عنصر الحدود المرتبط 32 kDa (BEAF-32) ، Motif 1 بروتين ملزم (M1BP) ، بروتين سنتروسومي 190 (CP190) ، مثبط للأجنحة المشعرة (SuHW) ، و CTCF ، ويتم إثراء في تعديلات الهستون النشطة وبوليميراز الثاني16،17،18. وقد اقترح أن في Drosophila، TADs تظهر نتيجة للنسخ13،17،19، والدور الدقيق لAPs مستقلة في تشكيل الحدود وخصائص العزل لا يزال قيد التحقيق. وبالتالي، ما إذا كانت المجالات في دروسوفيلا هي نتيجة وحيدة لتجميع مناطق من الدول النسخية المماثلة أو ما إذا كانت الجهات الراعية، بما في ذلك لجنة مكافحة الإرهاب، تساهم في تشكيل الحدود، لا تزال غير مميزة تماما. وقد أمكن استكشاف الاتصالات الجينومية بدقة عالية من خلال تطوير تكنولوجيات التقاط تكوين الكروموسومات إلى جانب تسلسل الجيل التالي. وصف بروتوكول Hi-C لأول مرة مع خطوة الربط التي أجريت "في الحل" 2 فيمحاولة لتجنب منتجات الربط الزائفة بين شظايا الكروماتين. ومع ذلك، أشارت العديد من الدراسات إلى إدراك أن الإشارة المفيدة في البيانات جاءت من منتجات الربط التي تشكلت في نواة مشقوقة جزئيا لم تكن في الحل20،21.

ثم تم تعديل البروتوكول لتنفيذ الربط داخل النواة كجزء من تجربة Hi-C أحادية الخلية22. تم دمج بروتوكول Hi-C في النواة لاحقا في مجموعة الخلايا Hi-C لتحقيق تغطية أكثر اتساقا على النطاق الكامل للمسافات الجينومية وإنتاج بيانات ذات ضوضاء تقنية أقل23و24. ويستند البروتوكول، الموصوف بالتفصيل هنا، على السكان في النواة مرحبا-C بروتوكول23،24، وكان يستخدم للتحقيق في عواقب إزالة وراثيا زخارف الحمض النووي ملزمة لC CTCF و M1BP من حدود المجال في مكان الجين نوتش في Drosophila25. تظهر النتائج أن تغيير الزخارف الملزمة للحمض النووي ل APs عند الحدود له عواقب وخيمة على تكوين نطاق Notch ، وعيوب طوبولوجية أكبر في المناطق المحيطة بموضع Notch ، وإلغاء تحرير التعبير الجيني. وهذا يشير إلى أن العناصر الوراثية عند حدود المجال مهمة للحفاظ على طبولوجيا الجينوم والتعبير الجيني في Drosophila25.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التثبيت

  1. ابدأ بخلايا 10 ملايين شنايدر +S2R+) لإعداد 17.5 مل من تعليق الخلية في شنايدر المتوسط الذي يحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. إضافة الفورمالديهايد خالية من الميثانول للحصول على تركيز النهائي من 2٪. مزيج واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT، مع الحرص على خلط كل دقيقة.
    ملاحظة: الفورمالديهايد مادة كيميائية خطرة. اتبع اللوائح المناسبة للصحة والسلامة، والعمل في غطاء الدخان.
  3. إخماد رد الفعل عن طريق إضافة الجليسين لتحقيق تركيز النهائي من 0.125 M ومزيج. احتضان لمدة 5 دقائق في RT، تليها 15 دقيقة على الجليد.
  4. جهاز طرد مركزي لمدة 400 × غرام في RT لمدة 5 دقائق ثم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية؛ تجاهل العملاق. Resuspend بيليه بعناية في 25 مل من الباردة 1x الفوسفات العازلة المالحة.
  5. جهاز الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية، ثم تجاهل supernatant.
    ملاحظة: إذا استمر مع البروتوكول، انتقل إلى الخطوة 2.1 للتحلل; خلاف ذلك، فلاش تجميد بيليه في السائل N2 وتخزين بيليه في -80 درجة مئوية.

2. ليسيس

  1. Resuspend الخلايا في 1 مل من الجليد الباردة تحلل العازلة (10 mM تريس-HCl, درجة الحموضة 8; 0.2٪ من السطحي غير الأيونية (انظر جدول المواد); 10 M M NaCl; مثبطات البروتيز 1x), وضبط حجم إلى 10 مل مع الجليد الباردة تحلل العازلة. ضبط مستوى الصوت للحصول على تركيز 1 × 106 خلايا / مل. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة، وخلط كل 2 دقيقة عن طريق عكس الأنابيب.
  2. الطرد المركزي النوى في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية، ومن ثم تجاهل بعناية supernatant. غسل بيليه 1x مع 1 مل من العازلة تحلل الباردة، ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. غسل بيليه 1x مع 1 مل من الباردة 1.25x تقييد العازلة، وإعادة إنفاق كل بيليه الخلية في 360 ميكرولتر من 1.25x تقييد العازلة.
  3. إضافة 11 ميكرولتر من 10٪ كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) لكل أنبوب (0.3٪ تركيز نهائي)، مزيج بعناية عن طريق pipetting، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، تهتز في 700-950 دورة في الدقيقة. Pipet صعودا وهبوطا لتعطيل كتل عدة مرات خلال الحضانة.
  4. إخماد SDS بإضافة 75 ميكرولتر من السطحي غير الأيونية (حل 10٪، انظر جدول المواد)لكل أنبوب (1.6٪ التركيز النهائي)، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، تهتز في 950 دورة في الدقيقة. Pipet صعودا وهبوطا عدة مرات لتعطيل كتل أثناء الحضانة.
    ملاحظة: إذا كانت الكتل كبيرة ويصعب تعطيلها، فقلل سرعة الدوران إلى 400 دورة في الدقيقة أثناء علاجات SDS والعلاجات السطحية. إذا كان من الصعب تقسيم الكتل عن طريق الأنابيب ، وتقسيم العينة إلى قسمين ؛ ضبط وحدات التخزين المؤقت تقييد SDS و السطحي; والمضي قدما في permeabilization. بعد ذلك ، تدور النوى في الحد الأدنى للسرعة (200 × غرام)، وتجاهل بعناية supernatant ، تجمع العينات معا في 1X تقييد العازلة ، والمضي قدما في الهضم. خذ 10 ميكرولتر aliquot كعينة غير مهضومة (UD).

3. الهضم الأنزيمي

  1. هضم الكروماتين بإضافة 200 وحدة (U) من Mbo I لكل أنبوب ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لفترة تتراوح بين 4 ساعات إلى بين عشية وضحاها أثناء الدوران (950 دورة في الدقيقة).
  2. في اليوم التالي، إضافة إضافية 50 U من مبو الأول لكل أنبوب، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة أثناء الدوران (950 دورة في الدقيقة).
  3. تعطيل الانزيم عن طريق احتضان الأنابيب في 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ضع الأنابيب على الثلج.
    ملاحظة: خذ a aliquot 10 ميكرولتر كعينة هضم (D).

4. نهايات البيوتينيل من الحمض النووي

  1. لملء جزء التقييد الذي يتدلى وتسمية ينتهي الحمض النووي مع البيوتين، إضافة 1.5 ميكرولتر لكل من 10 mM dCTP، dGTP، dTTP، 20 ميكرولتر من 0.4 m البيوتين dATP، 17.5 ميكرولتر من تريس منخفضة EDTA (TLE) العازلة [10 mM تريس-HCl، 0.1 mM EDTA، درجة الحموضة 8.0]، و 10 ميكرولتر من 5 U/μL من كلينو (DNA polymerase I جزء كبير) لجميع الأنابيب. تخلط بعناية واحتضان لمدة 75 دقيقة في 37 درجة مئوية. يهز في 700 دورة في الدقيقة كل 10 ق لمدة 30 ق. ضع جميع الأنابيب على الجليد أثناء إعداد مزيج الربط.

5. الربط

  1. نقل كل خليط الكروماتين المهضوم إلى أنبوب منفصل 1 مل مع مزيج الربط (100 ميكرولتر من العازلة ربط 10x، 10 ميكرولتر من 10 ملغم / مل ألبوم مصل البقري، 15 U من T4 الحمض النووي ليغانيس، و 425 ميكروغرام من الماء المقطر المزدوج [ddH2O]). تخلط جيدا عن طريق pipetting لطيف، واحتضان بين عشية وضحاها في 16 °C.

6. انعكاس الربط العرضي وتنقية الحمض النووي

  1. تتحلل البروتينات بإضافة 50 ميكرولتر من 10 ملغم/مل بروتيناز K لكل أنبوب، وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. عكس الروابط المتقاطعة عن طريق زيادة درجة الحرارة إلى 65 درجة مئوية واحتضان بين عشية وضحاها.
  2. تتحلل الحمض النووي الريبي بإضافة 20 ميكرولتر من 10 ملغم / مل RNase A، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. أداء الفينول: استخراج الكلوروفورم تليها هطول الأمطار الإيثانول.
    1. إضافة 1 حجم الفينول-الكلوروفورم، وتخلط جيدا عن طريق عكس للحصول على مرحلة بيضاء متجانسة.
      ملاحظة: الفينول مادة كيميائية خطرة. اتبع اللوائح المناسبة للصحة والسلامة. العمل في غطاء الدخان.
    2. جهاز طرد مركزي عند 15,000 × غرام لمدة 15 دقيقة. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد 2 مل. إجراء الاستخراج الخلفي للطبقة السفلى مع 100 ميكرولتر من TLE العازلة، ونقل المرحلة المائية في نفس أنبوب 2 مل.
    3. تسريع الحمض النووي بإضافة 2 مجلدات من الكحول الإيثيلي 100٪ (EtOH)، 0.1 مجلد من خلات الصوديوم 3 M، و 2 ميكرولتر من 20 ملغم / مل الجليكوجين. حضانة في -20 درجة مئوية لفترة تتراوح بين 2 ساعة إلى بين عشية وضحاها.
    4. تدور في 15،000 × غرام لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية، وغسل الكريات 2x مع الجليد الباردة 70٪ EtOH. جفف الكريات في RT، وأعيد إنفاقها في 100 ميكرولتر من حاجز TLE. قياس الحمض النووي باستخدام صبغة فلورية التي تربط بشكل انتقائي إلى الحمض النووي ومقياس الفلور وفقا لتعليمات الشركة المصنعة(جدول المواد).
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. تخزين منتجات الربط عند 4 درجة مئوية على المدى القصير أو عند -20 درجة مئوية على المدى الطويل. استخدام aliquot (100 نانوغرام) من المواد كعينة ربط (L) لمراقبة الجودة.

7. تقييم جودة قالب Hi-C

  1. الهضم وربط الضوابط النوعية
    1. تنقية الحمض النووي من UD وD aliquots عن طريق عكس الوصلات المتقاطعة، وأداء phenol:استخراج الكلوروفورم وهطول الأمطار الإيثانول كما هو موضح أعلاه.
    2. تحميل 100 نانوغرام من UD، D، وعينات L في هلام agarose 1.5٪. ابحث عن مسحة تركزت حول 500 نقطة أساس في العينة D مقابل نطاق عالي الوزن الجزيئي لعينة L (انظر النتائج التمثيلية).
  2. التحكم الكمي لكفاءة الهضم
    ملاحظة: لتقييم كفاءة الهضم بشكل أكثر دقة، استخدم عينات UD وD كنماذج لتنفيذ التفاعلات المتسلسلة البوليميراز الكمية (qPCR) باستخدام التهيئة المصممة على النحو التالي.
    1. تصميم زوج التمهيدي الذي يضخم جزء الحمض النووي التي تحتوي على موقع تقييد الحمض النووي للإنزيم المستخدم للهضم (Mbo الأول في البروتوكول الحالي)، ودعا R في الصيغة في الخطوة 7.2.3.
    2. تصميم زوج التمهيدي الذي يضخم جزء الحمض النووي التحكم الذي لا يحتوي على موقع تقييد للإنزيم المستخدم للهضم (Mbo I للبروتوكول الحالي)، ودعا C في الصيغة في الخطوة 7.2.3.
    3. استخدم قيم عتبة الدورة (قيم Ct) للتضخيم لحساب كفاءة التقييد وفقا للصيغة الموضحة أدناه:
      ٪ تقييد = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
      حيث تشير CtR إلى قيمة Ct للقسم R، ويشير CtC إلى القيمة Ct للقطعة C للعينة D وعينة UD.
      ملاحظة: تعكس نسبة التقييد كفاءة إنزيم التقييد الذي يلتصق بشظايا الحمض النووي المقيدة (R) مقارنة بجزأ الحمض النووي (C) عنصر التحكم الذي لا يحتوي على موقع الحمض النووي التقييدي. ينصح بكفاءة تقييد ≥ 80٪.
  3. الكشف عن التفاعلات المعروفة
    1. إجراء PCR لتضخيم عنصر تحكم ربط داخلي لفحص التفاعلات قصيرة المدى و/أو متوسطة أو طويلة المدى (انظر النتائج التمثيلية).
    2. بدلا من ذلك، تصميم التمهيديات لتضخيم منتج الربط الذي التمهيديات هي في اتجاه إلى الأمام أو عكس عكس في شظايا تقييد المجاورة.
  4. التحكم في التعبئة ووضع العلامات على البيوتين
    1. تحقق من كفاءة وضع العلامات وربط Hi-C عن طريق تضخيم وهضم تفاعل معروف أو منتج ربط بين شظايا التقييد المجاورة في الجينوم ، كما هو موضح أعلاه.
      ملاحظة: نجاح التعبئة في وربط موقع Mbo I (GATC) بإنشاء موقع جديد للإنزيم تقييد Cla I (ATCGAT) عند تقاطع الربط وتجديد موقع Mbo I.
    2. هضم المنتج PCR مع مبو I، Cla I، أو كليهما. بعد تشغيل العينات على هلام 1.5-2٪، وتقدير العدد النسبي للتقاطعات ربط 3C ومرحبا C عن طريق تحديد كثافة قطع والعصابات غير المصقول26.
      ملاحظة: مطلوب كفاءة > 70٪ (راجع النتائج التمثيلية).

8. سونيكيشن

  1. Sonicate العينات للحصول على شظايا الحمض النووي 200-500 نقطة أساس. للآلة المستخدمة في هذا البروتوكول (انظر جدول المواد)،تمييع العينة (من 5 إلى 10 ميكروغرام) في 130 ميكرولتر من ddH2O لكل أنبوب، وتعيين الصك إلى سونيكاتي إلى 400 نقطة أساس: مستوى التعبئة: 10؛ عامل الواجب: 10٪؛ ذروة قوة الحادث (ث): 140؛ دورات لكل انفجار: 200; الوقت (ق): 80.

9. إزالة البيوتين / إصلاح نهاية

ملاحظة: يتم تعديل الخطوات الموضحة أدناه ل 5 ميكروغرام من الحمض النووي Hi-C.

  1. لإجراء إزالة البيوتين، نقل العينة (130 ميكرولتر) إلى أنبوب طرد دقيق جديد. إضافة 16 ميكرولتر من 10x ربط العازلة، 2 ميكرولتر من 10 mM dATP، 5 ميكرولتر من T4 DNA بوليمراسي (15U)، و 7 ميكرولتر من ddH2O (160 ميكرولتر من الحجم الإجمالي). حضانة عند 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. إضافة 5 ميكرولتر من 10 mM dNTPs، 4 ميكرولتر من 10x الربط العازلة، 5 ميكرولتر من T4 كيناز البولي نوكليوتيد (10 U/μL)، 1 ميكرولتر من كلينو، و 25 ميكروغرام من DDH2O (200 ميكروغرام من الحجم الإجمالي). حضانة عند 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

10. اختيار الحجم

  1. لتحديد شظايا معظمها في نطاق حجم 250-550 نقطة أساس، وتنفيذ مرحلة الصلبة تسلسلي عكسها تعطيل (SPRI) اختيار حجم أولا مع 0.6x، تليها 0.90x وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، وelute الحمض النووي باستخدام 100 ميكروغرام من TLE.

11. البيوتين المنسدلة / A - الذيل / ربط محول

ملاحظة: قم بإجراء الغسيل عن طريق إعادة تعليق الخرز المغناطيسي عن طريق الدوامة، وتناوب العينات لمدة 3 دقائق على عجلة دوارة، ثم قم بتدوير العينة لفترة وجيزة ووضعها على الحامل المغناطيسي. السماح للخرزات التمسك المغناطيس، والتخلص من supernatant، والمضي قدما في خطوة غسل التالية. قم بإجراء الغسيل عند درجة حرارة 55 درجة مئوية على كتلة حرارية مع دوران بدلا من العجلة الدوارة.

  1. تشكل وحدة التخزين النهائية إلى 300 ميكرولتر لكل عينة مع TLE لسحب لأسفل. إعداد مخازن الغسيل الخرز: 1x توين العازلة (السل: 5 م م تريس-HCl pH 8.0، 0.5 mM EDTA، 1 M NaCl، 0.05٪ توين)، 0.5x السل، 1x لا توين العازلة (NTB) (5 متر تريس-HCl pH 8.0، 0.5 m M EDTA، 1 M NaCl)، 2x NTB.
  2. استخدم 150 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المرتبط بالستريبتافيدين (انظر جدول المواد)لكل مكتبة. غسل الخرز 2x مع 400 ميكرولتر من السل 1x. ثم حبات resuspend في 300 ميكرولتر 2x NTB.
  3. مزيج الخرز مع 300 ميكرولتر مرحبا-C المواد واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة على عجلة دوارة للسماح ربط البيوتين إلى حبات streptavidin.
  4. اغسل الخرز ب 400 ميكرولتر من 0.5 تيرابايت، واحتضنه عند 55 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، بالتناوب عند 750 دورة في الدقيقة. غسل الخرز في 200 ميكرولتر من 1x تقييد المخزن المؤقت.
  5. Resuspend الخرز في 100 ميكرولتر من مزيج المخلفات dATP (5 ميكرولتر من 10 mM dATP، 10 ميكرولتر من العازلة تقييد 10x، 5 ميكرولتر من كلينو exo-، و 80 ميكرولتر من DDH2O). حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  6. إزالة supernatant، وغسل الخرز 2x مع 400 ميكرولتر من 0.5x السل عن طريق احتضان في 55 درجة مئوية لمدة 3 دقائق وتناوب في 750 دورة في الدقيقة.
  7. غسل الخرز مع 400 ميكرولتر من NTB 1x ثم مع 100 μL من العازلة ربط 1x.
  8. Resuspend الخرز في 50 ميكرولتر من العازلة ربط 1x، ونقل التعليق إلى أنبوب جديد. إضافة 4 ميكرولتر من محولات PE قبل المماليد (15 ميكرومتر من المخزون) و 2 ميكرولتر من T4 ligase (400 U/μL، أي 800 U/tube)؛ احتضان في RT لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: قبل أنال المحولات بإضافة كميات متساوية من كل من PE 1.0 و PE 2.0 محولات (30 ميكرومتر مخزون) واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT (انظر جدول المواد).
  9. استعادة الخرز عن طريق إزالة supernatant وغسل الخرز 2x مع 400 ميكروغرام من السل. غسل الخرز مع 200 ميكرولتر من NTB 1x، ثم مع 100 ميكرولتر من 1x تقييد العازلة، وإعادة إنفاق الخرز في 40 ميكرولتر من 1x تقييد المخزن المؤقت.

12. تضخيم PCR

  1. إعداد وحدات PCRs بحجم 25 ميكرولتر مع 5 و6 و7 و8 دورات. لكل PCR، استخدم:
    رد فعل وصفة
    مرحبا C الخرز2.5 ميكرولتر
    10 ميكرومتر PE PCR التمهيدي 1 (جدول المواد)0.75 ميكرولتر
    10 ميكرومتر PE PCR التمهيدي 2 (جدول المواد)0.75 ميكرولتر
    10 mM dNTP0.6 ميكرولتر
    5x رد فعل العازلة5 ميكرولتر
    بوليمرات الحمض النووي0.3 ميكرولتر
    ddH2O14.65 ميكرولتر
    مجموع25 ميكرولتر
    دوراتدرجة الحرارةالوقت
    198 درجة مئوية30 ق
    ن دورات98 درجة مئوية10 ق
    65 درجة مئوية30 ق
    72 درجة مئوية30 ق
    172 درجة مئوية7 دقائق

13. تضخيم PCR النهائي

  1. إجراء تضخيم PCR النهائي باستخدام نفس الشروط كما هو موضح أعلاه وعدد الدورات المحددة. تقسيم العينة باستخدام 5 ميكرولتر من الخرز مرحبا C كقالب في ردود الفعل 50 ميكرولتر.
  2. جمع جميع ردود الفعل PCR ونقلها إلى أنبوب جديد. استخدام المغناطيس لإزالة الخرز streptavidin واستعادة supernatant (PCR المنتجات). نقل الخرز إلى أنبوب جديد، وغسل الخرز كما هو مبين في الخطوة 11.2.9، وتخزينها في 1x تقييد العازلة في 4 درجة مئوية كنس احتياطي.
  3. تنقية منتجات PCR باستخدام 0.85x حجم الخرز SPRI وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. Elute مع 30 ميكرولتر من مخزن TLE المؤقت.
  4. قياس كميا مكتبة Hi-C باستخدام أداة قياس الفلورومترية، وتأكيد جودة المكتبة عن طريق الكهروفلوريس الشعري القائم على رقاقة.
  5. كنقطة تفتيش جودة الأخيرة، استخدم 1 ميكرولتر من مكتبة Hi-C كقالب لإجراء تفاعل PCR باستخدام 10 دورات باستخدام نفس الشروط الموضحة في الخطوة 12.1. تقسيم المنتج PCR إلى اثنين من أنابيب الطرد المركزي: هضم واحد مع Cla I وترك الآخر غير مهضوم كعنصر تحكم. تشغيل المنتجات في هلام agarose 1.5-2٪ (انظر النتائج التمثيلية).
  6. انتقل إلى تسلسل 50 نقطة أساس أو 75 نقطة أساس على منصة تسلسل مناسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

فيما يلي نتائج بروتوكول Hi-C ناجح (راجع ملخص سير عمل بروتوكول Hi-C في الشكل 1A). هناك العديد من نقاط مراقبة الجودة خلال تجربة Hi-C في النواة. تم جمع عينة aliquots قبل (UD) وبعد (D) خطوة تقييد الكروماتين وكذلك بعد الربط (L). تم عكس الوصلات المتقاطعة، وتم تنقية الحمض النووي وتشغيله على هلام الآغاروز. وقد لوحظ مسحة من 200-1000 نقطة أساس عند تقييد مع مبو أنا كان ناجحا(الشكل 1B). الحجم المتوقع للجزيء يعتمد على إنزيم تقييد الاختيار. إذا كان الربط ناجحا، شوهد شريط الوز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد سمحت طريقة Hi-C في النواة المعروضة هنا بالاستكشاف التفصيلي لطبولوجيا الجينوم Drosophila بدقة عالية ، مما يوفر رؤية للتفاعلات الجينومية على نطاقات جينومية مختلفة ، من حلقات الكروماتين بين العناصر التنظيمية مثل المروجين والمحسنات إلى TADs وتحديد المقصورة الكبيرة25. كما تم تطبيق نفس التكنولوجيا بكفاءة على أنسجة الثدييات مع بعض التعديلات33. على سبيل المثال، عند معالجة الأنسجة بدلا من تعليق خلية واحدة، يتم غربلة الأنسجة من خلال مرشح 70 ميكرومتر، ويتم تنفيذ خطوة التحلل مع تجا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل برنامج دعم التكنولوجيا والبحوث التابع للبعثة رقم المنحة IN207319 ورقم منحة المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACyT-FORDECyT) 303068. أ.إ.ل. هو طالب ماجستير بدعم من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (كوناسي) رقم CVU 968128.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
16٪ (vol / vol) محلول بارافورمالدهيدAgar ScientificR1026
Biotin-14-dATPInvitrogenCA1524-016
إنزيم ClaINEBR0197S
COVARIS UltrasonicatorCovarisLE220-M220
Cut SmartNEBB72002S
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1xLife Technologies41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1Invitrogen65002
مصل الأبقار الجنيني (FBS) معقم مفلترSigmaF9665
Klenow Dna PolI جزء كبيرNEBM0210L
Klenow exo (-)NEBM0210S
Bindation BufferNEBB020S
إنزيم MboINEBR0147M
NP40-IgepalSIGMACA-420خافض للتوتر السطحي غير أيوني للإضافة إلى محول PE للعازل
1.0Illumina5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'PE
محول 2.0Illumina5'-ACACTCTTTCCCTACACGGCT
CTTCCGATCT-3'PE
PCR التمهيدي 1.0Illumina5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'PE
PCR التمهيدي 2.0Illumina5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCGGCATCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCT-3'الفينول
: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل 25:24: 1SIGMAP2069
التمهيدي 1 (التفاعل المعروف ، الشكل 2 أ)Sigma5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer
2 (التفاعلات المعروفة ، الشكل 2 أ)Sigma5'-CCTCCCTGCCCAAAACGTTTTT-3'قرص
كوكتيل مثبط للبريتيازRoche4693132001
Proteinase KRoche3115879001
QubitThermoFisherQ33327
RNAseRoche10109142001
SPRI BeadsBeckmanB23318
T4 DNA ligaseInvitrogen15224-025
T4 DNA polymeraseNEBM0203S
T4 بولي نوكليوتيد كيناز (PNK)   ؛NEBM0201L
TaqPhusionNEBM0530SDNA polymerase
Triton X-100خافض للتوتر السطحي غير أيوني لتبريد SDS

المراجع

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
  4. Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
  5. Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
  6. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
  7. Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
  8. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  9. Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
  10. Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
  11. Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
  12. Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
  13. Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
  14. Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
  15. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
  16. Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82(2014).
  17. Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189(2018).
  18. Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
  19. Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
  20. Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403(2013).
  21. Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
  22. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  23. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  24. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175(2015).
  25. Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894(2020).
  26. Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).
  27. Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259(2015).
  28. Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093(2016).
  29. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310(2015).
  30. Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
  31. Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198(2015).
  32. Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189(2018).
  33. Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
  34. Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
  35. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137(2008).
  36. Ong, C. -T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
  37. Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
  38. Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
  39. Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
  40. Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
  41. Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
  42. Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
  43. Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تنظيم الكروماتينالنطاقات المرتبطة طوبولوجياًحدود النطاقات المرتبطة طوبولوجياًالبروتينات البنيويةهضم الكروماتينالترسيب بالبيوتينالتعديل الجيني بتقنية CRISPRالتفاعلات الجينومية
في النواة مرحبا C في خلايا دروسوفيلا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.