رسم خرائط تفاعلات البروتين والبروتين المختلة في المرض

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لتمكين التقاط وتحديد تفاعلات البروتين والبروتين الخاصة بالمرض من الخلايا والأنسجة الأصلية باستخدام المجسات الكيميائية وقياس الطيف الكتلي. يتم تحليل مجموعات بيانات التفاعل الناتجة من خلال نظام أساسي مخصص قائم على الويب للكشف عن اختلالات الشبكة الديناميكية وتغييرات المسار المرتبطة بالمرض.

الملخص

يتم إعادة تشكيل شبكات تفاعل البروتين والبروتين (PPI) ديناميكيا في المرض ، ومع ذلك تركز معظم مناهج بيولوجيا الأنظمة على التغيرات في وفرة البروتين ، مما يتجاهل الخلل الوظيفي على مستوى التفاعل الحرج. هنا ، نقدم طريقة قوية وكيميائية - تفاعل البروتين والبروتين المختل وظيفيا (dfPPI) - والتي تتيح رسم خرائط عالية الإنتاجية ومنهجي وسياق المرض لاختلالات شبكة PPI في الخلايا والأنسجة البشرية الأولية. تدمج هذه الطريقة مجسات البيولوجيا الكيميائية التي تلتقط بشكل انتقائي مجموعات التفاعل القائمة على epichaperome مع قياس الطيف الكتلي الترادفي السائل الخالي من الملصقات (LC-MS / MS) والتحليل الحسابي القائم على الشبكة ، للكشف عن إعادة توصيل شبكات البروتين غير الواضحة من البيانات النسخية أو البروتينية وحدها. يمكن تطبيق منصة dfPPI عبر حالات المرض والأنواع والأنسجة لتحديد العقد القابلة للتنفيذ من الخلل الوظيفي وتمكين رؤى عالية الدقة على مستوى الأنظمة حول تطور المرض. في هذا البروتوكول ، نوضح إجراءات خطوة بخطوة لتحضير العينة ، ومعالجة المسبار الكيميائي ، وإثراء التقارب ، وتحليل LC-MS / MS الخالي من الملصقات ، وسير عمل المعلوماتية الحيوية المستخدمة لإنشاء وتفسير مجموعات بيانات dfPPI. تهدف هذه المقالة إلى تعزيز قابلية التكاثر وإمكانية الوصول إلى هذا النهج ، ودعم اعتماده من قبل مجتمعات بيولوجيا النظم الأوسع والبحث الانتقالي.

المقدمة

تعتمد وظيفة الخلايا ، وبالتالي الكائنات الحية ، على التنسيق الدقيق لشبكات تفاعل البروتين والبروتين (PPI)^1،2. هذه الشبكات مسؤولة عن تنظيم وتنفيذ جميع العمليات البيولوجية تقريبا. في حين أن شبكات PPI ديناميكية بطبيعتها وتستجيب للإجهاد ، إلا أنها في المرض يمكن أن تصبح معاد توصيلها بشكل غير طبيعي ، مما يؤدي إلى وظائف غير قابلة للتكيف. الأهم من ذلك ، أن إعادة الأسلاك هذه لا تنطوي بالضرورة على تغييرات في التعبير الجيني أو البروتيني. بدلا من ذلك ، ينشأ من التفاعلات الفيزيائية المتغيرة بين البروتينات التي يتم التعبير عنها عادة^3،4،5. تفشل الأساليب التقليدية في بيولوجيا الأنظمة ، مثل النسخ أو البروتينات ، في التقاط هذه التغييرات الحرجة على مستوى التفاعل.

تقدمت تقنيات رسم خرائط PPI بشكل كبير ، حيث قدمت رؤى حول تنظيم وتنظيم الشبكات الخلوية^{6،7،8،9،10،11}. تقدم الأساليب شائعة الاستخدام ، بما في ذلك تنقية التقارب - قياس الطيف الكتلي (AP-MS) ، والربط المتقاطع (XL) -MS ، ووضع العلامات القريبة ، والتجزئة المشتركة ، مزايا محددة ، مثل الخصوصية العالية ، أو الدقة المكانية ، أو القدرة على اكتشاف المجمعات العابرة^{6،8،9،10،11}. ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب هذه الطرق بروتينات الطعم أو التلاعب الجيني أو المعلوماتية الحيوية المعقدة ، وقد تكافح من أجل التقاط إعادة الأسلاك واسعة النطاق والمدفوعة بالأمراض لشبكات البروتين في الأنظمة البيولوجية الأصلية^{6،7،8،9،10}،¹¹. يفتقر معظمها أيضا إلى قابلية التوسع ، مما يجعلها غير عملية لتحليل مجموعات العينات الكبيرة أو رسم خرائط منهجي لتغيرات التفاعل عبر الظروف أو أنواع الخلايا أو النقاط الزمنية^{6،7،8،9،10،11} (الجدول 1).

لمعالجة هذه الفجوة ، قمنا بتطوير منصة تفاعل البروتين والبروتين المختل وظيفيا (dfPPI) ، وهي طريقة كيميائية للبروتين تحدد بشكل مباشر اختلالات شبكة PPI المسؤولة عن الأنماط الظاهرية للمرض¹². إنه يستفيد من البصيرة البيولوجية الرئيسية: في حالات المرض ، تشكل مجموعة فرعية من المرافقين الجزيئيين سقالات فوق جزيئية تسمى epichaperomes^13،14،15. لا تعمل هذه الهياكل في طي البروتين ولكنها تعمل بدلا من ذلك كمحاور تفاعل للسقالات تعيد تنظيم اتصال البروتين³. بشكل حاسم ، البروتينات المعزولة في epichaperomes ليست عشوائية. هم أولئك الذين يشاركون بنشاط في الحفاظ على النمط الظاهري للمرض^{16،17،18،19،20}. من خلال التقاط هذه البروتينات المرتبطة ب epichaperome وتفاعلاتها ، يحدد dfPPI التغييرات الدقيقة في الشبكة التي تقود حالات مرضية معينة. تنتشر إعادة توصيل الشبكة التي تحركها Epichaperome عبر الأمراض - الغالبية في مجموعات مرض الزهايمر و ~ 70٪ في عينات السرطان^16,20 - مما يدعم قابلية تطبيق dfPPI على الدراسات الكبيرة التي تركز على الأمراض.

تشمل منصة dfPPI سير العمل بأكمله بدءا من إعداد العينة ، والتقاط تقارب epichaperome ، وتحديد تفاعل بواسطة MS ، إلى تحليلات المعلوماتية الحيوية النهائية مثل إثراء المسار ونمذجة شبكة البروتين الوظيفية (الشكل 1). تستخدم هذه الطريقة مجسات كيميائية خاصة ب epichaperome مثبتة على مصفوفات التقارب (PU أو مجسات أخرى) ^13،16،17 لعزل التفاعل الوظيفي عن الخلايا أو الأنسجة. تم بالفعل التحقق من صحة هذه المجسات بدقة في منشورات متعددة لخصوصية epichaperomes والملاءمة ل dfPPI^{16،17،18،20،21،22}. تتعرض المجمعات التي تم التقاطها لمرض التصلب العصبي المتعدد ، باستخدام كل من سير عمل الهضم على الخرزة والهلام ، متبوعا ب LC-MS / MS الخالي من الملصقات. يمكن بعد ذلك تحليل البيانات الناتجة من خلال خط أنابيب مخصص للمعلوماتية الحيوية يحدد الخلل الوظيفي على مستوى التفاعل ويربطه بالعمليات البيولوجية والأنماط الظاهرية. نظرا لأن epichaperomes سقالة التفاعلات الخاصة بالسياق^17،18،20 ، يكشف dfPPI عن كيفية إعادة تشكيل شبكات البروتين في مرض معين أو نوع خلية أو مرحلة معينة ، مما يجعلها أداة قوية لبيولوجيا الأنظمة للتنميط الظاهري الدقيق.

هذه الطريقة قابلة للتطوير بدرجة كبيرة وقد تم تطبيقها على مئات العينات السريرية والتجريبية ، بما في ذلك الأنسجة البشرية بعد الوفاة والخلايا المستزرعة ، عبر أمراض متنوعة مثل السرطان والتنكس العصبي^{16،17،18،19،20،22،23}. من خلال الكشف عن تغييرات PPI التي تحدد الحالة المرضية ، يتيح dfPPI كلا من البصيرة الميكانيكية واكتشاف الأهداف العلاجية القابلة للتنفيذ^{16،17،18،19،20،22،23}.

في هذا البروتوكول ، نصف بالتفصيل المكونات التجريبية لمنصة dfPPI ، من التقاط تقارب التفاعلات المرتبطة ب epichaperome إلى إعداد العينة ل LC-MS / MS إلى تحديد التفاعل عبر مرض التصلب المتعدد. لم يتم تغطية خط أنابيب التحليل الحسابي - أي ما يتم فعله بقائمة البروتينات التي حددها مرض التصلب العصبي المتعدد لتحديد التفاعلات التفاضلية والعواقب الوظيفية - هنا بسبب قيود المساحة. ومع ذلك ، يمكن الوصول إليه مجانا وتوثيقه على نطاق واسع عبر تطبيق dfPPI Shiny في https://epichaperomics.mskcc.org (تم تحديثه إلى https://dfppi.mskcc.org) ومن خلال موقع Chiosis Lab على https://www.chiosislab.com/resources. بالإضافة إلى هذه البوابات ، يتم تضمين خط أنابيب المعلوماتية الحيوية الكامل والنصوص المصاحبة لها في العديد من المنشورات التي تطبق dfPPI على السرطان^16،17،19 ومرض الزهايمر^18،20.

البروتوكول

يتبع البروتوكول إرشادات لجنة أخلاقيات البحث البشري في مؤسستنا ولجنة رعاية واستخدامه. يتم سرد المعدات والكواشف المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. تحضير العينة لالتقاط التقارب

1. استخراج البروتين من الأنسجة
   ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول لعينات أنسجة المخ بعد الوفاة.
   1. قم بإعداد مخزن مؤقت لاستخراج البروتين يحتوي على 20 ملي مولار تريس (درجة الحموضة 7.5) ، و 20 ملي مولار KCl ، و 5 ملي مولار MgCl₂ ، و 0.01٪ NP-40 (مخزن محلل محلي). أضف مثبطات البروتياز والفوسفاتيز مباشرة قبل الاستخدام. احتفظ بالمخزن المؤقت على الجليد.
   2. ضع الأنسجة المجمدة (الحجم المستهدف حوالي 50 مم مكعب) في أنبوب مجانس الأنسجة الدقيقة ، والذي يتكون من أنبوب طرد مركزي دقيق متخصص سعة 1.5 مل مزود بمدقة. أضف 500-700 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل الأصلي ، وضبط الحجم بناء على انضغاط الأنسجة وسهولة التجانس. قم بتجانس العينة على الجليد عن طريق تحريك المدقة برفق لأعلى ولأسفل وعلى الجدران الكاشطة لأنبوب الخالط حتى يتم تشكيل معلق متجانس.
      ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات على الثلج للحفاظ على مجموعات البروتين في تكوينها الأصلي ولتجنب تحلل البروتين.
   3. احتضان التحلل عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة عن طريق وضع القارورة على وحدة الدوران. امزج العينات برفق أثناء الحضانة باستخدام الدوران.
   4. قم بالطرد المركزي للعينات عند 13,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة لإزالة الحطام.
   5. اجمع المواد الطافية وانقلها إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة شفافة سعة 1.5 مل. تجنب إزعاج الحبيبات أثناء النقل.
   6. حدد تركيز البروتين الكلي في المادة الطافية باستخدام مجموعة أدوات فحص حمض البيسينشونيك (BCA) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: يمكن تخزين محللات البروتين في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. ارجع إلى منشور سابق²⁴ لمعرفة تأثير دورات التجميد والذوبان المتكررة ودرجة حرارة التخزين على سلامة مجموعات البروتين.
2. تطبيع العينة
   ملاحظة: HSP90α و HSP90β هما مكونان أساسيان للظاهر وهما شركاء الربط المباشر للمسبار الكيميائي المستخدم لالتقاط تفاعل^13،21،23. يضمن تطبيع العينات بناء على HSP90α (أو HSP90β) مطابقة كمية epichaperome القابلة للاستهداف بواسطة المسبار عبر العينات ، وهو أمر ضروري للمقارنة الدقيقة للتفاعلات الملتقطة. يمكن تطبيع العينات بناء على مستويات HSP90 التي تحددها اللطخة الغربية ، ولكن يمكن أيضا استخدام طرق أخرى. إذا كانت مستويات HSP90 قابلة للمقارنة عبر العينات، فتخطي هذا القسم وانتقل إلى الخطوة 1.3. استخدام نشاف HSP90α / β هنا هو لتطبيع المدخلات فقط ولا ينبغي تفسيره على أنه مقياس وفرة epichaperome.
   1. قم بإعداد 2× مخزن مؤقت لعينة Laemmli يتكون من 4٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، 20٪ جلسرين ، 10٪ 2-ميركابتوإيثانول ، 0.02٪ بروموفينول أزرق ، و 0.125 M Tris-HCl ، درجة الحموضة ~ 6.8.
      تنبيه: 2-mercaptoethanol سام ومتطاير ويجب التعامل معه في غطاء الدخان.
   2. اجمع بين 5 ميكروغرام من مستخلص بروتين الدماغ الكلي (من الخطوة 1.1) 1: 1 (v / v) مع 2× عينة Laemmli في أنبوب طرد مركزي دقيق شفاف سعة 1.5 مل.
   3. قم بتسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق في وحدة تسخين لتشويه البروتينات قبل تحميلها على الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE).
   4. قم بتحميل العينات على جل بروتين تريس جلايسين 8٪ مسبقة الصب. بدلا من ذلك ، استخدم المواد الهلامية المصبوبة يدويا.
   5. قم بتحميل 5 ميكرولتر من معيار البروتين الملطخ مسبقا على كل هلام ، على سبيل المثال ، في البئر الأول ، لتحديد الوزن الجزيئي للبروتين.
   6. قم بتشغيل المواد الهلامية في مخزن مؤقت يعمل بمعدل 1× TGS (Tris-Glycine-SDS) عند RT. وقت التشغيل النموذجي هو 1.5-2 ساعة عند 100 فولت.
   7. قم بإعداد مخزن مؤقت للنقل يحتوي على 25 ملي مولار تريس و 192 ملي جلايسين و 20٪ ميثانول.
      تنبيه: الميثانول قابل للاشتعال ويجب التعامل معه وفقا لإرشادات السلامة.
   8. انقل البروتينات إلى غشاء نيتروسليلوز في مخزن مؤقت للنقل عند 4 درجات مئوية لمدة 60 دقيقة بجهد ثابت (100 فولت).
   9. قم بإعداد محلول غسيل غشائي (1× TBS-0.1٪ Tween-20) ومحلول مانع (5٪ حليب في 1× TBS-0.1٪ Tween-20). يستخدم هذا البروتوكول الحليب الجاف المجفف الخالي من الدسم من مصدر تجاري.
   10. ضع الغشاء في محلول مانع لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع تحريك لطيف على منصة هزازة. استخدم 10 مل من محلول الحجب لكل هلام صغير.
   11. قم بإزالة محلول الحجب واحتضان الغشاء بجسم مضاد مضاد ل HSP90α (تخفيف 1: 6,000 في محلول حجب 10 مل) طوال الليل عند 4 درجات مئوية على منصة هزازة.
   12. قم بإزالة محلول الجسم المضاد واغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها ب 10 مل من محلول الغسيل.
   13. أضف الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب المضاد للأرانب المقترن ب HRP (تخفيف 1: 5,000 في 10 مل 1× TBS-0.1٪ Tween-20) واحتضن لمدة ساعة واحدة في RT على منصة هزازة.
   14. قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي واغسل الغشاء أربع مرات بمحلول الغسيل (نفس الحجم والتوقيت على النحو الوارد أعلاه).
   15. اكتشف إشارة الإضاءة الكيميائية الخاصة ب HSP90α باستخدام مجموعة التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدم نظام التصوير الكيميائي أو فيلم التصوير الشعاعي الذاتي.
   16. تحديد مستويات HSP90α في العينات بناء على شدة الإشارة وحساب عامل التطبيع للمنسدلة النهائية.
       ملاحظة: تعكس شدة إشارة HSP90 مقدار epichaperome القابل للاستهداف بواسطة المسبار في كل عينة. من خلال مقارنة شدة الإشارة بين العينات والتطبيع إلى عينة مرجعية يتم تشغيلها على كل هلام ، يمكن تعديل أحجام الإدخال لالتقاط تفاعل وفقا لذلك. يمكن إجراء القياس الكمي باستخدام برنامج قياس الكثافة. قم دائما بتضمين عينة مرجعية على كل هلام للسماح بالتطبيع عبر البقع.
3. تحضير حبة PU
   ملاحظة: يمكن تصنيع حبات البولي يوريثان وخرز التحكم داخليا كما تم الإبلاغ عنه^{سابقا 21،25} أو طلبها من مختبر Chiosis عند تنفيذ اتفاقية نقل المواد (MTA). يجب تخزينها عند -20 درجة مئوية في الأيزوبروبانول.
   1. خذ كمية من حبات البولي يوريثين (PU) أو تحكم في الخرز مباشرة من مخزون الأيزوبروبانول. قم بتضمين ما يقرب من 30٪ فائض لحساب فقدان الخرزة أثناء الغسيل والمناولة.
   2. قم بإزالة مذيب التخزين: اترك الخرز يستقر ، ثم استنشق الأيزوبروبانول. أضف محلول تحلل محلي (1 مل لأنبوب 1.5 مل ؛ 5 مل لأنبوب مخروطي 15 مل) وأعد تعليقه بالكامل عن طريق سحب العينات اللطيف أو الانعكاس.
   3. اغسل واوازن ثلاث مرات: لكل غسلة ، دوامة للتعليق ، جهاز طرد مركزي (أنبوب 1.5 مل: 10,000 × جم ، 1 دقيقة ؛ 15 مل مخروطي: 3,000 × جم ، 5 دقائق) ، ثم شفط المادة الطافية بخط تفريغ مزود بطرف ماصة ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات.
   4. أضف مخزن مؤقت للتحلل الأصلي إلى الخرزات المغسولة بنسبة حجم 1: 1 (الخرز: المخزن المؤقت) لتوليد ملاط حبة عمل موحد.
   5. Aliquot 40 ميكرولتر من ملاط PU (أو حبة التحكم) (على سبيل المثال ، 1: 1 فولت / فولت حبات: عازلة) لكل عينة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل. استخدم طرف ماصة مع قطع النهاية للسماح بتوزيع الخرزات بسهولة.
      ملاحظة: حبات البولي يوريثان حساسة للضوء. استخدم أنابيب داكنة أو ملفوفة بورق الألمنيوم سعة 1.5 مل أثناء الخطوات المنسدلة. نظرا لطلاء سطحها الكاره للماء مع الموثق الجزيء الصغير epichaperome ، تميل حبات البولي يوريثان إلى التكتل والالتصاق بالأسطح البلاستيكية. ماصة برفق واخلطها جيدا لضمان إعادة تعليق موحدة. من الأهمية بمكان توزيع كميات متساوية من ملاط الخرز في كل عينة لتجنب التباين في التقاط البروتين ، مما قد يؤدي إلى نتائج غير متسقة أو غير قابلة للتكرار.
   6. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام محلول التحلل الأصلي عن طريق إضافة 1 مل من المخزن المؤقت إلى كل أنبوب ، والدوامة ، والطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة دقيقة واحدة ، والتخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط. تأكد من إعادة تعليق الخرز بالكامل بين كل غسلة.
      ملاحظة: عند الشفط ، تجنب لمس الخرز. اضغط على طرف الماصة برفق على جدار الأنبوب أثناء إزالة السائل.
   7. بعد الغسيل النهائي ، قم بإزالة معظم السائل من الأنابيب ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الخرزة.
      ملاحظة: يمكن تخزين الخرزات المغسولة عند 4 درجات مئوية لبضعة أيام. عادة ، يتم استخدام الخرز في غضون 1-2 أيام بعد التحضير.
4. المنسدلة Interactome
   ملاحظة: الخطوة الأولى من المنسدلة هي خطوة المقاصة المسبقة باستخدام حبات التحكم ، والتي يتم تراقنها بجزيء صغير خامل لا يربط epichaperomes¹⁶. تزيل هذه الخطوة البروتينات والمجاميع والحطام غير القابل للذوبان غير المتفاعل على وجه التحديد من المحلل ، وبالتالي تحسين خصوصية المنسدل اللاحق من حبة PU. يقلل المسح المسبق من ارتباط الخلفية ويعزز الكشف عن بروتينات معينة مرتبطة ب epichaperome.
   يتم تحليل تفاعل التصلب العصبي المتعدد الذي يستعيده هذا البروتوكول بواسطة مرض التصلب العصبي المتعدد ، وهو حساس للغاية للملوثات التجريبية. لضمان تحديد دقيق للبروتين والحفاظ على جودة البيانات ، استخدم دائما المخازن المؤقتة والكواشف المعدة حديثا ، وتقليل التعرض للغبار والكيراتين ، وارتداء قفازات نظيفة وخالية من المسحوق عند التعامل مع العينات أو المواد الاستهلاكية أو المعدات. استخدم الأواني الزجاجية / المواد الاستهلاكية المخصصة ل MS لجميع خطوات الهضم المنسدلة والهلامية ، واحتفظ بأي عناصر مستخدمة في النشاف الغربي منفصلة فعليا. في حالة إعادة استخدام الأواني الزجاجية ، قم بتطهير التلوث عن طريق الشطف بالتتابع بالميثانول بنسبة 100٪ ، والماء عالي النقاء ، وحمض الخليك بنسبة 80٪ ، والماء عالي النقاء ، ثم جففه في الهواء. لا تستخدم المنظفات. حتى بقايا التتبع يمكن أن تفساد أعمدة LC ومصادر الأيونات.
   1. أضف مستخلصات البروتين الطبيعي (وفقا للخطوة 1.2 ، المحسوبة بناء على شدة لطخة HSP90) إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الفردية سعة 1.5 مل التي تحتوي على 40 ميكرولتر من ملاط حبيبات التحكم (أي 20 ميكرولتر من حبات + 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت) ، واضبط الحجم النهائي على 250 ميكرولتر عن طريق إضافة الحجم المناسب من المخزن المؤقت للتحلل الأصلي.
      ملاحظة: لتحديد أحجام المدخلات الخاصة بالعينة ، استخدم الصيغة A1 = (60 / C1) × X1 ، حيث A1 هو حجم البروتين الكلي الطبيعي المراد إضافته (μL) ، C1 هو تركيز البروتين المقاس (μg / μL) ، و X1 هو عامل التطبيع المشتق من نشاف HSP90 (كما هو موضح في الخطوة 1.2). يتم حساب حجم المخزن المؤقت الإضافي المراد إضافته على أنه 250 ميكرولتر ناقص A1. إذا لم تكن هناك حاجة إلى التطبيع ، فاستخدم 250 ميكروغرام بروتين إجمالي في 250 ميكرولتر.
   2. احتضان العينات عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة مع الدوران على محور دوار (10-15 دورة في الدقيقة).
   3. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 10,000 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية لحبيبات حبات التحكم جنبا إلى جنب مع البروتين المجمع أو غير القابل للذوبان.
   4. اجمع المادة الطافية بعناية من حبات التحكم باستخدام ماصة سعة 1 مل وانقلها إلى أنابيب سعة 1.5 مل تحتوي على 40 ميكرولتر من ملاط حبيبات البولي يوريثان المغسولة.
   5. احتضان العينات عند 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات مع الدوران على محور دوار (10-15 دورة في الدقيقة).
   6. قم بالطرد المركزي لكل أنبوب عند 10,000 × جم لمدة دقيقة واحدة ، واستنشق المادة الطافية ، واغسل الخرزات أربع مرات باستخدام 1 مل من محلول التحلل الأصلي. لكل غسلة: دوامة ، جهاز طرد مركزي ، وشفط ، باستخدام المعلمات الموضحة في الخطوة 1.3.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن معالجة العينات ل LC-MS / MS باستخدام أحد مهام سير العمل: (1) SDS-PAGE متبوعا بالهضم داخل الهلام ، أو (2) هضم البروتينات الملتقطة على الخرزة.
      لسير عمل الهضم داخل الهلام ، استمر في البروتوكول كما هو مكتوب. للهضم على الخرزة ، اغسل الخرزات مرتين إضافيتين باستخدام برنامج تلفزيوني بارد وانتقل على الفور إلى القسم 3. لا تجمد الخرز إذا كنت تشرع في عملية الهضم على الخرزة. يجب معالجة العينات طازجة في نفس اليوم. يمكن أن يؤدي تجميد مجمعات البروتين المرتبطة بالخرزة إلى إضعاف كفاءة الهضم عن طريق تعزيز تراكم أو فقدان قابلية ذوبان البروتين ، مما يؤدي إلى انخفاض استعادة الببتيد وزيادة التباين. بناء على التوصيات الأساسية لمرض التصلب العصبي المتعدد ، يجب معالجة العينات طازجة في نفس اليوم لضمان هضم متسق على الخرز.
5. تحضير العينة للهضم الهلامي
   1. أضف 25 ميكرولتر من 2× Laemmli عينة مؤقتة إلى عينات الخرزة المحضرة في الخطوة 1.4.6 ، والتي يتم احتوائها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات في هذه المرحلة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة. قم دائما بتحميل حجم العينة بالكامل على هلام SDS-PAGE للهضم داخل الهلام لزيادة تغطية البروتين إلى أقصى حد وضمان التمثيل الكامل للتفاعل. لا ينصح بالتحميل الجزئي. إذا كان حجم العينة محدودا وكان التحميل الجزئي أمرا لا مفر منه ، فيجب تخزين المواد المتبقية في أقاليم لتقليل دورات التجميد والذوبان والحفاظ على سلامة تفاعلية.
   2. قم بتسخين كل عينة عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (مع إضافة 2× Laemmli عينة المخزن المؤقت ، على النحو الوارد أعلاه) لتشويه مجمعات البروتين وإخراجها من الخرز قبل تحميلها على SDS-PAGE. تعمل SDS وعوامل الاختزال في المخزن المؤقت على تعطيل مثبطات PPIs وإطلاق البروتينات من المصفوفة.
   3. قم بالطرد المركزي لكل أنبوب عند 10,000 × جم لمدة 1 دقيقة في RT.
   4. قم بتحميل كل مادة طافية على 4-20٪ من المواد الهلامية SDS-PAGE متدرجة مسبقا.
   5. قم بتشغيل المواد الهلامية في 1× TGS تشغيل المخزن المؤقت عند RT وأوقف الجري في منتصف الطريق (~ 3.5-4 سم في الجل عند 100 فولت ، عادة 30-60 دقيقة وقت تشغيل).
   6. قم بإزالة الجل من وحدة الرحلان الكهربائي واستمر في تلطيخ Coomassie الأزرق اللامع وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: يمكن نقل الجل الملطخ ، المغمور في 5-7 مل من الماء فائق النقاء في وعاء بلاستيكي ، إلى منشأة التصلب العصبي المتعدد لتحديد البروتين. إذا لم تتم معالجتها على الفور ، قم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في ماء فائق النقاء لمدة تصل إلى 1-2 أسابيع. تم استخدام تدفقين بديلين للبروتينات اعتمادا على المنشأة الأساسية التي أدت العمل والأهداف التجريبية: يصف القسم 2 الهضم داخل الهلام متبوعا بتحليل الاستحواذ المستقل عن البيانات (DIA) -MS باستخدام مطياف الكتلة المداري رباعي الأقطاب. يوضح القسم 3 بالتفصيل بروتوكول الهضم على الخرزة الأمثل لمطياف الحركة الأيونية المحاصرة مع التجزئة التسلسلية المتراكمة المتوازية (diaPASEF) ²⁶. يمكن الرجوع إلى الخطوات عند الاقتضاء.

2. تحديد البروتين عن طريق LC-MS / MS مع هضم البروتين الهلامي

1. تقليل في الهلام وألكلة البروتينات السيستينيل
   1. قم بإزالة المنطقة الملطخة من كل حارة جل ملطخة ب Coomassie وقم بتقطيعها إلى ما يقرب من خمس شرائح جل متساوية الحجم. قم بإزالة كل شريحة عن طريق احتضانها ثلاث مرات في 500 ميكرولتر من 50٪ (حجم/حجم) من الميثانول لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية مع التحريض عند 700 دورة في الدقيقة على شاكر الأنبوب الدقيق الذي يتم التحكم في درجة حرارته.
      ملاحظة: يجب ألا يزيد حجم كل شريحة جل عن ~ 1 سم × 0.5 سم × 1 سم لضمان الانتشار الفعال للكواشف في الخطوات اللاحقة بالإضافة إلى هضم التربسين الفعال داخل الهلام طوال الليل. قم باستئصال منطقة الهلام المقابلة للبروتينات الملطخة بشدة - مثل HSP90 و HSC70 ، والتي تمثل مواد رابطة مباشرة للمسبار الكيميائي والمكونات الأساسية للظواهر^15،16،23 - بشكل منفصل عن بقية الجل. وقد تتداخل وفرة هذه الكثافة العالية مع الكشف عن المتفاعلات ذات الوفرة المنخفضة وقياسها كميا أثناء تحليل LC-MS/MS.
   2. احتضن كل شريحة جل في 500 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 5 ملي (ABC) المحضرة في 30٪ أسيتونيتريل (ACN) عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 700 دورة في الدقيقة على شاكر الأنبوب الدقيق الذي يتم التحكم في درجة حرارته لمدة 15 دقيقة لإزالة البقع المتبقية. كرر الحضانة حتى تنضج شريحة الجل تماما.
      ملاحظة: يمكن أن تتداخل أي بقعة بروتين مرئية متبقية مع ارتباط الببتيد بمصفوفة C18 أثناء خطوة تنظيف الببتيد ، مما يقلل من التعافي وحساسية التصلب العصبي المتعدد.
   3. قم بإزالة محلول ABC / ACN والتخلص منه باستخدام ماصة ذات طرف رفيع ، مع الحرص على عدم فقدان قطع الجل (أي عدم شفط قطع الجل مع السائل). ثم أضف 500 ميكرولتر من ACN بنسبة 100٪ إلى كل أنبوب ، مما يضمن غمر قطع الجل بالكامل. احتضن في RT على شاكر مداري بسرعة 700 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق ، أو حتى تصبح قطع الجل شفافة ، وتتقلص في الحجم ، وتأخذ مظهر الورق الأبيض.
      تنبيه: ACN قابل للاشتعال ويجب التعامل معه في غطاء الدخان.
   4. قم بإزالة ACN وتخلص منه من كل أنبوب باستخدام ماصة ذات طرف رفيع ، مع الحرص على عدم شفط قطع الجل. قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة عند 1,000 جم × لمدة 10 ثوان لتجميع السائل المتبقي ، وشفط القطرات المتبقية بعناية باستخدام ماصة ذات طرف رفيع. ضع الأنابيب المفتوحة في جهاز طرد مركزي مفرغ من الهواء في RT لمدة 10-15 دقيقة ، أو حتى تجف شرائح الجل وصلبة.
      ملاحظة: لا تفرط في الجفاف. تحقق بشكل دوري لتجنب تكسير قطع الجل أو انكماش مفرط. بمجرد التجفيف ، قم بتخزين قطع الجل عند 4 درجات مئوية في أنبوب محكم الغلق أو أنبوب مطرد مركزي منخفض الارتباط أو أنبوب طرد مركزي دقيق حتى الهضم ؛ البروتينات المرتبطة بالهلام والنقية مستقرة لمدة تصل إلى عدة أيام عند الاحتفاظ بها عند 4 درجات مئوية.
   5. التخفيض: أضف ~ 100 ميكرولتر من 10 ملي ديثيوثريتول (DTT) (محضر طازجا من مخزون 500 ملي مولار في بيكربونات الأمونيوم 50 ملليمتر) إلى كل أنبوب عينة ، مما يضمن غمر قطع الجل بالكامل. احتضان عند 56 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع التحريك عند 700 دورة في الدقيقة على شاكر الأنبوب الدقيق الذي يتم التحكم في درجة حرارته.
      تحذير: DTT هو مهيج للجلد والجهاز التنفسي. تعامل داخل غطاء الدخان الكيميائي وارتد القفازات.
      ملاحظة: تأكد من إغلاق الأنابيب بإحكام أثناء الحضانة لتجنب التبخر والحفاظ على تركيز DTT.
   6. الألكلة: قم بإزالة محلول DTT من كل أنبوب باستخدام ماصة ذات طرف رفيع ، مع الحرص على عدم إزعاج قطع الجل. أضف على الفور ~ 100 ميكرولتر من 55 ملي مولار يودو أسيتاميد (IAA) في 50 ملي مولار ABC لتغطية شرائح الجل بالكامل. احتضان في RT مع التحريض بسرعة 700 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
      تنبيه: IAA سام وحساس للضوء. قم بإجراء جميع المناولة في غطاء الدخان أثناء ارتداء القفازات.
      ملاحظة: تأكد من الإزالة الكاملة ل DTT قبل إضافة IAA لتجنب إخماد تفاعل الألكلة. لف الأنابيب بورق الألمنيوم أو استخدم حاويات مانعة للضوء أثناء الحضانة لتقليل تدهور IAA.
   7. قم بالطرد المركزي للأنابيب لفترة وجيزة عند 1,000 × جم لمدة 5 ثوان عند RT لجمع السائل المتبقي في الأسفل. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام طرف ماصة ناعم التجويف (على سبيل المثال ، طرف P10) لتجنب إزعاج قطع الجل. قم بإمالة الأنبوب قليلا واستنشقه من الحافة لتقليل خطر شفط شظايا الجل.
   8. التوازن: قم بتغطية قطع الجل ب 500 ميكرولتر من 50 ملي مولار ABC في 30٪ ACN. احتضان في RT لمدة 10 دقائق ، مع التحريك عند 700 دورة في الدقيقة على شاكر مداري ساخن. تساعد هذه الخطوة على إزالة كاشف الألكلة الزائد وتوازن الجل قبل الجفاف.
   9. إزالة المحلول: قم بالتدوير لفترة وجيزة عند 1,000 × جم لمدة 5 ثوان وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ذات طرف رفيع ، كما هو موضح أعلاه.
   10. جفف مرة أخرى: كرر الخطوتين 2.1.3 و 2.1.4 لإعادة تجفيف قطع الجل باستخدام ACN بنسبة 100٪ متبوعا بالطرد المركزي الفراغي حتى يجف. تضمن هذه الخطوة الاسترداد الأمثل للببتيد أثناء الهضم الأنزمي.
2. تحلل البروتين في الجل وتنظيف الببتيد
   1. هضم عينات الجل المجففة عن طريق إضافة التربسين من الدرجة المتعددة-العصبية المتعددة بتركيز نهائي قدره 5 نانوغرام / ميكرولتر في 50 ملي مولار ABC لإعادة ترطيب قطع الجل بالكامل (عادة 50-100 ميكرولتر الحجم الإجمالي ، أو ما يكفي لتغطية شرائح الهلام). احتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية في أنابيب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل ، مما يضمن إغلاق الأنابيب بإحكام لمنع التبخر. حرك برفق إن أمكن (على سبيل المثال ، 300 دورة في الدقيقة على شاكر الأنبوب الدقيق الذي يتم التحكم في درجة حرارته).
   2. قم بتحمض العينة بعد الهضم طوال الليل عن طريق إضافة 10٪ حمض الفورميك (FA) بالتنقيط لتحقيق تركيز نهائي قدره 1٪ (حجم/حجم) (على سبيل المثال، أضف 1 ميكرولتر من 10٪ حمض الفوليكروليك إلى 100 ميكرولتر من الهضم). تخلط برفق ، ثم صوتنة الأنابيب لمدة 10 دقائق في صوتية حمام مائي RT لتعزيز استخراج الببتيد.
   3. قم بإزالة المادة الطافية المحتوية على الببتيد بعناية باستخدام ماصة ذات طرف رفيع (على سبيل المثال ، طرف ضيق التجويف P10) ، مع الحرص على عدم إزعاج مصفوفة الجل أو شفط شظايا الجل. انقل المادة الطافية التي تم جمعها إلى أنبوب منخفض الارتباط بسعة 500 ميكرولتر وضعه على الثلج.
   4. أضف محلول 5٪ FA / 50٪ ACN (v / v) لكل أنبوب (عادة ~ 50-100 ميكرولتر ، أو ما يكفي لتغطية قطع الهلام بالكامل) ، وقم بالتحريك برفق عند RT (على سبيل المثال ، على شاكر عند 70 دورة في الدقيقة لمدة 10-15 دقيقة) لاستخراج الببتيدات المتبقية. اجمع المادة الطافية بعناية وادمجه مع محلول الببتيد الأصلي من الخطوة 2.2.3.
   5. ركز مستخلص الببتيد المركب باستخدام الطرد المركزي بالفراغ عند RT (على سبيل المثال ، 1,000 × جم لمدة ~ 30 دقيقة) حتى تبقى قطرة صغيرة فقط. لا تدع العينة تجف تماما ، لأن ذلك قد يتسبب في فقدان الببتيد بسبب الالتصاق بجدران الأنبوب. استخدم المستخلص المجفف جزئيا إما على الفور لتحلية أو تخزينه عند -20 درجة مئوية في أنبوب محكم الغلق منخفض الترابط.
   6. قم بتحلية الببتيدات باستخدام أطراف ماصة صغيرة الحجم معبأة ب C18 معبأة يدويا (أي StageSides) محضرة باستخدام قرصي استخراج C18 مكدسين يتم إدخالهما في طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر، كما هو موضح سابقا²⁷، مع التعديلات التالية:
   7. قم بتنشيط أقراص C18 بإضافة 40 ميكرولتر من الميثانول. قم بطرد مطرد طرف الماصة الذي يحتوي على الأقراص (يتم إدخاله في طرف ماصة فارغ سعة 200 ميكرولتر ووضعه داخل أنبوب سعة 500 ميكرولتر) باستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة عند 1,500 × جم لمدة 3 دقائق.
      ملاحظة: على جميع الخطوات، لا تدع أقراص C18 تجف. سوف يتداخل التجفيف مع ربط الببتيد والشطف. قد يلزم تقصير طرف الماصة الخارجي (الجلبة) سعة 200 ميكرولتر الذي يحمل طرف الماصة المعبأة C18 الصغيرة المعبأة يدويا عن طريق القطع ~ 1 سم من النهاية لضمان ملاءمة المجموعة ذات الطرفين في الأنبوب بشكل صحيح في جهاز الطرد المركزي.
   8. قم بموازنة الأقراص بإضافة 0.1٪ FA والطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه.
   9. ضع محلول الببتيد ، المعاد تكوينه في 20 ميكرولتر من 0.1٪ FA ، مباشرة على الجزء العلوي من الأقراص المكدسة.
   10. جهاز طرد مركزي عند 1,500 × جم لمدة 5 دقائق لتسهيل ربط الببتيد بأقراص C18.
   11. اغسل الببتيدات المرتبطة بتمرير 40 ميكرولتر من 0.1٪ FA عبر العمود.
   12. الببتيدات الملتوية مع 40 ميكرولتر من 70٪ ACN تحتوي على 0.1٪ FA. قم بتخزين الببتيدات المملوءة في أنابيب منخفضة الارتباط عند -80 درجة مئوية حتى تحليل LC-MS / MS. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة.
3. Nano-LC مقترنا بتحليل MS باستخدام DIA
   1. ركز شطف الببتيد المحلى باستخدام الطرد المركزي الفراغي (على سبيل المثال ، 20-30 دقيقة عند RT ، 1,000 × جم) ، مع ترك قطرة صغيرة. أعد تكوين الببتيدات في 10 ميكرولتر من 0.1٪ FA في ماء من الدرجة LC-MS عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل برفق ولفترة وجيزة. قم بالتدوير لفترة وجيزة لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب قبل المتابعة.
   2. قم بتحليل 4 ميكرولتر من عينة الببتيد المعاد تكوينها بواسطة nano-LC-MS / MS. افصل الببتيدات على عمود طور عكسي معبأ ذاتيا (75 ميكرومتر معرف × 2 سم ، راتنج C18 ، حجم جسيمات 3 ميكرومتر) يتم الحفاظ عليه عند 50 درجة مئوية. قم بإعداد العمود باستخدام قنبلة ضغط²⁸ عن طريق تعبئة ملاط من راتنج C18 (في الميثانول ، 1: 3 فولت / فولت) في شعيرات شعرية من السيليكا المنصهرة مع طرف رش مدمج 10 ميكرومتر (360 ميكرومتر OD × 75 ميكرومتر معرف × طرف 10 ميكرومتر). قم بتوصيل العمود عبر تأين الرش النانوي إلى مطياف الكتلة الهجين عالي الدقة (رباعي الأقطاب من النوع Orbitrap) الذي يدعم سير عمل DIA.
      ملاحظة: يوصى بطول عمود 20 سم لأنه يوفر فصلا مثاليا لمخاليط الببتيد المتولدة من شرائح هلام SDS-PAGE.
   3. حافظ على العمود التحليلي عند 50 درجة مئوية باستخدام فرن عمود أو كتلة تسخين لضمان الاحتفاظ بالببتيد وفصله بشكل متسق. تأكد من التحكم المستقر في درجة الحرارة طوال فترة التشغيل ، حيث يمكن أن تؤثر التقلبات على قابلية التكرار.
   4. الببتيدات الملتوية باستخدام تدرج خطي من 3-40٪ ACN في 0.1٪ FA على مدى 110 دقيقة ، بمعدل تدفق 250 نانولتر / دقيقة. يوفر هذا التدرج فصلا فعالا للببتيد قبل اكتشاف مرض التصلب المتعدد. إجمالي وقت التحليل ، بما في ذلك توازن العمود ، هو 120 دقيقة.
   5. احصل على البيانات في وضع DIA باستخدام MS عالي الدقة ، كما هو موضح^{سابقا 29}.
      1. قم بتعيين عمليات مسح مسح MS1 الكاملة ليتم الحصول عليها في وضع الملف الشخصي بدقة 120,000 (عند m/z 200) ، على نطاق مسح ضوئي يتراوح من 300-1650 م / z. اتبع كل فحص MS1 مع تجزئة MS2 ل 30 نافذة سلائف متسلسلة (364-1370 Th) باستخدام مخطط نافذة عزل منزلقة.
      2. قم بإجراء التجزئة باستخدام طاقات الاصطدام الطبيعية المتدرجة من 25.5 و 27.0 و 30.0. الحد الأقصى الافتراضي لحالة شحن السلائف هو 4. اضبط الكتلة الأولى الثابتة في عمليات مسح MS / MS على 200 Da ، واحصل على أطياف MS2 بدقة 30,000.
      3. استخدم إعداد وقت الحقن التلقائي ل MS2 وأقصى وقت حقن يبلغ 60 مللي ثانية ل MS1. لكل من عمليات المسح MS1 و MS2 ، قم بتعيين هدف الأيون (AGC) إلى 3e6.
4. القياس الكمي النسبي للتفاعلات التي تم التقاطها بالتقارب
   ملاحظة: لتحديد البروتينات المحددة في تحليلات DIA-MS للتفاعلات epichaperome التي تم التقاطها من التقارب ، استخدم نظاما أساسيا برمجيا يدعم سير عمل DIA ويوفر تقديرا كميا موثوقا به بناء على شدة الببتيد أو العدد الطيفي. استخدم هذا البروتوكول MaxQuant (على سبيل المثال ، الإصدار 2.5.1.0) وسير عمل MaxDIA^20،29 لتحديد الببتيد / البروتين والقياس الكمي القائم على الكثافة الخالي من الملصقات. استخدمت عمليات البحث استراتيجية شرك التسلسل العكسي مع 1٪ FDR عند مستويات PSM / الببتيد والبروتين. تمت تصفية إدخالات "عكسية" و "ملوثات محتملة" قبل المعلوماتية الحيوية. لم يتم استخدام أي ارتفاعات. تم التحقق من جاهزية الأداة باستخدام 250 نانوغرام من HeLa digest (ومزيج متقطع 10 fmol 6 بروتينات) يفي بمعايير المعرف الداخلي واستقرار RT.
   1. تحليل بيانات DIA-MS الأولية بمعلمات متسقة عبر جميع العينات. قم بتضمين ما يصل إلى اثنين من الانقسامات المفقودة وتعيين التعديلات على النحو التالي: ثابت, كارباميدوميثيل السيستين; متغيرة ، أكسدة الميثيونين ، وأسيتيل البروتين N-terminus.
   2. استخدم مكتبة طيفية متوقعة بالسيليكون بناء على قاعدة بيانات البروتين البشري UniProt (على سبيل المثال ، ~ 20,000 إدخال) ، مما يضمن تضمين تسلسلات الشرك والملوثات لتقدير معدل الاكتشاف الخاطئ الدقيق (FDR). حدد الهضم التهربتيكي ما لم يتم استخدام إنزيم بديل. تتوفر مكتبة طيفية بشرية تم التحقق من صحتها (استنادا إلى إصدار UniProt 06/18/2020 ، 20,956 إدخالا) من مستودع معهد ماكس بلانك للكيمياء الحيوية³⁰.
      ملاحظة: كبديل لسير العمل هذا مع المكتبات المتوقعة ، توضح الخطوة 3.4 المعالجة الخالية من المكتبة ، والتي أنتجت تعريفا وتقديرا كميا مماثلا لمجموعات البيانات هذه.
   3. قم بتحديد وفرة البروتين باستخدام قيم الشدة (وليس شدة القياس الكمي الخالية من الملصقات [LFQ]) ، لأنها أكثر ملاءمة لتحليلات شبكة PPI النهائية. تأكد من إلغاء تحديد LFQ لتجنب البيانات الاصطناعية للتطبيع، والتي يمكن أن تشوه بيانات إثراء التقارب. بدلا من ذلك ، استخدم قيم الكثافة الأولية المشتقة من التطابقات الطيفية للببتيد ، والتي تعكس قوة التفاعل بدلا من التعبير العالمي عن البروتين. تطبيق معايير التصفية المناسبة (على سبيل المثال ، ببتيد فريد واحد على الأقل لكل مجموعة بروتينية) لتحسين موثوقية تحديد البروتين وقياسه كميا. تصدير جدول كثافة البروتين الناتج للتحليلات الإحصائية والشبكية اللاحقة.
      ملاحظة: على عكس سير العمل البروتيني القياسي ، حيث تساعد قيم LFQ في التطبيع لتحميل البروتين عبر المحللات الكاملة ، يتم إثراء البروتينات هنا من خلال التقاط تقارب epichaperomes. تقدم خطوة التخصيب هذه التباين البيولوجي الذي قد يحجبه تطبيع LFQ. لذلك ، يفضل قيم الكثافة الأولية ، لأنها تعكس بشكل أفضل تفاعلات البروتين والظهير التفاضلية عبر الظروف وتحافظ على الإشارة اللازمة لتحليل مستوى الشبكة النهائي (على سبيل المثال ، dfPPI). في الدراسات السابقة التي استخدمت عمليات البحث المستندة إلى التميمة^16،18 ، تم أيضا استخدام قيم العد الطيفي MS / MS بدلا من الشدة. في مهام سير عمل التقاط التقارب مثل هذا ، تعكس الأعداد الطيفية تردد التفاعل وهي مناسبة تماما لتحديد البروتينات المتفاعلة تفاضليا عبر الظروف. على عكس قيم LFQ ، لا تفترض أعداد MS / MS تطبيعا عالميا عبر البروتين ، مما يحافظ على التباين ذي المغزى بيولوجيا من خطوة إثراء epichaperome.

3. تحديد البروتين عن طريق LC-MS / MS مع هضم البروتين على الخرزة

1. الهضم على الخرزة
   ملاحظة: لضمان الاسترداد الأمثل للبروتين وتقليل فقدان العينة أثناء هضم البروتين على الخرزة لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد ، من الضروري استخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة البروتين. تم تصميم هذه الأنابيب لتقليل امتصاص البروتين إلى جدران الأنبوب ، وبالتالي تعزيز استعادة العينة. يجب تحضير جميع الكواشف المستخدمة في هذا القسم حديثا باستخدام الماء والمواد الكيميائية من الدرجة LC-MS. في حالة إرسال عينات إلى نواة البروتينات ، تحقق من السياسات المحلية ، حيث قد تتطلب بعض المرافق تعقيم جميع المخازن المؤقتة قبل الاستخدام.
   1. قم بإزالة أي متبقية من PBS قد تبقى في الأنبوب من الخطوة 1.4.6. أعد تعليق الخرزات في 80 ميكرولتر من 2 مليون يوريا ، محضرة طازجة في 50 ملي مولار ABC ، درجة الحموضة 8.5. تأكد من الخلط الكامل عن طريق سحب العينة أو الدوامة القصيرة.
      ملاحظة: اضبط مستوى الصوت بشكل متناسب بناء على كمية الخرزة ونوعها. تم تحسين هذا البروتوكول ل 40 ميكرولتر من ملاط حبيبات PU.
   2. أضف DTT لتحقيق تركيز نهائي قدره 1 ملي مولار.
      ملاحظة: قم بإعداد محلول DTT طازج 10 ملي مولار من محلول مخزون DTT سعة 1 متر في ماء من الدرجة LC-MS مباشرة قبل الاستخدام ، حيث أن DTT عرضة للأكسدة في المحلول. أضف الحجم المطلوب مباشرة إلى العينة واخلطه برفق عن طريق سحب العينات.
   3. قم بتغطية الأنبوب واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الاهتزاز عند 1,100 دورة في الدقيقة على شاكر مداري ساخن. أغلق الأغطية بإحكام لتقليل التبخر.
   4. أضف IAA للوصول إلى تركيز نهائي قدره 3.67 ملي مولار. احتضن في الظلام عند RT لمدة 45 دقيقة مع الاهتزاز عند 1,100 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: قم بإعداد مخزون IAA طازج 10 ملي مولار في ماء من الدرجة LC-MS مباشرة قبل الاستخدام. أضف الحجم المطلوب إلى العينة واخلطه برفق عن طريق سحب العينات.
   5. أضف DTT إضافيا لإخماد IAA غير المتفاعل ، مما يحقق تركيزا نهائيا قدره 3.67 ملي مولار. تخلط برفق عن طريق سحب العاصة.
      ملاحظة: يمنع التبريد غير المتفاعل IAA الإفراط في الألكلة، مما قد يضر بنشاط البروتياز وكفاءة الهضم. قم بإعداد DTT طازجا وحساب الحجم بناء على حجم العينة الحالي لتحقيق التركيز المستهدف.
   6. أضف 750 نانوغرام من 0.5 مجم / مل من بروتياز Lys-C من الدرجة MS إلى العينة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع الاهتزاز عند 1,150 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: قم بإعداد Lys-C عن طريق الذوبان في ماء من الدرجة LC-MS. قم بتخزين أليكوتس الإنزيم عند -80 درجة مئوية وتجنب عمليات التجميد والذوبان المتعددة.
   7. أضف 750 نانوغرام من 0.5 مجم / مل من التربسين المحضر حديثا. احتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 1,150 دورة في الدقيقة. احتضان لمدة لا تزيد عن 16-18 ساعة لمنع فرط الهضم وتدهور الببتيد.
   8. في اليوم التالي، قم بالطرد المركزي للعينة عند 1,000-5,000 جم × لمدة 1-5 دقائق في RT وانقل المادة الطافية عن طريق سحب العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل. تجاهل الخرز.
   9. اضبط الرقم الهيدروجيني للهضم إلى أقل من 3 عن طريق إضافة 50٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) بالتنقيط. تحقق من الأس الهيدروجيني باستخدام شرائط مؤشر الأس الهيدروجيني.
      ملاحظة: يجب أن يكون نطاق الأس الهيدروجيني النموذجي ~ 2.5-3.0 ، ويجب تحمض العينات قبل تحلية.
      تنبيه: TFA مادة أكالة ومتقلبة. أضف غطاء الدخان وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE).
2. تحلية الببتيد
   ملاحظة: لإزالة التحلية من الببتيد وتنظيفه، استخدم أطراف ماصة صغيرة الحجم معبأة ب C18 (أي StageSides)³¹. قم بإعداد C18 StageTips عن طريق تعبئة ثلاث طبقات من مادة C18 (على سبيل المثال، أقراص استخراج الطور الصلب C18) في طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر. يمكن أيضا استخدام أعمدة الدوران C18 الجاهزة والمتوفرة تجاريا. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة للتكييف وتحميل العينات وشطف الببتيد. قد يختلف الأداء (على سبيل المثال ، كفاءة الاحتفاظ ، عائد الاسترداد) بين الأجهزة محلية الصنع مقابل الأجهزة التجارية. يجب تعبئة أطراف الماصة الصغيرة الحجم المعبأة ب C18 بإحكام لتجنب التدفق الالتفافي.
   1. قم بتكييف أطراف الماصة الصغيرة الحجم المعبأة ب C18 بالتتابع بما يلي: (1) 100 ميكرولتر من الميثانول. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم وتجاهل التدفق ؛ (2) 100 ميكرولتر من 70٪ ACN / 0.1٪ TFA. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم وتجاهل التدفق ؛ (3) 100 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم وتخلص من التدفق. كرر هذه الخطوة مرتين.
      ملاحظة: يضمن التكييف ترطيبا كاملا لراتنج C18 الكاره للماء. بالنسبة لأعمدة الدوران C18 الجاهزة والمتوفرة تجاريا ، يمكن أيضا استخدام مشعبات الفراغ. يجب على المستخدمين الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة للحصول على توصيات معالجة محددة.
   2. قم بتحميل جهاز هضم الببتيد المحمض على أطراف الماصة المكيفة الصغيرة الحجم المعبأة ب C18 عن طريق سحب العينة ببطء مباشرة في الطرف. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم للسماح للهضم بالمرور عبر الراتنج ، والتخلص من التدفق. إذا تجاوز حجم العينة السعة، فقم بالتحميل في جولات متعددة.
      ملاحظة: ماصة الملخص مباشرة على سرير الراتنج المعبأ ، وتجنب فقاعات الهواء. في حالة استخدام أطراف منخفضة الاحتفاظ، المس الجدار الداخلي لأطراف الماصة الصغيرة الحجم المعبأة ب C18 لتحرير السائل ببطء وبشكل متساو.
   3. ماصة 100 ميكرولتر من 0.1٪ FA مباشرة في طرف الماصة الصغيرة الحجم المعبأة ب C18، مما يضمن أن المحلول يشبع المادة C18 بالكامل. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم وتخلص من التدفق. كرر هذه الخطوة مرتين لإزالة الأملاح والمواد المتداخلة.
      ملاحظة: تأكد من تدفق السائل بالكامل عبر مادة C18 قبل كل دورة. تجنب حبس فقاعات الهواء عن طريق توزيع محلول الغسيل ببطء أسفل جدار طرف الماصة.
   4. قم بإزالة الببتيدات المرتبطة عن طريق سحب 50 ميكرولتر من 70٪ ACN/0.1٪ FA في طرف الماصة الصغيرة الحجم المعبأة ب C18. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم واجمع الأنبوب في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف منخفض الربط. كرر هذه الخطوة مرتين لضمان الشطف الكامل.
      ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى جولات متعددة من الطرد المركزي لاستعادة الأنبوب بالكامل. إذا ظل السائل المتبقي محاصرا في قاعدة الطرف، فاضغط برفق على طرف الماصة المعبأة C18 صغيرة الحجم أو قم بإجراء دورات إضافية قصيرة لتجميع الحجم المتبقي. اجمع بين اللوات وتحقق من الحجم النهائي قبل المتابعة.
   5. قم بتجميد وتجفيف الببتيدات المملوءة باستخدام مكثف فراغ حتى يجف. تأكد من وضع الغطاء بشكل غير محكم للسماح بالتنفيس ، ولكن تجنب التناثر.
   6. أعد تكوين الببتيدات المجففة عن طريق إضافة 12 ميكرولتر من 0.1٪ FA في ماء من الدرجة LC-MS مباشرة إلى قاع الأنبوب. دوامة بلطف وصوتنة الأنابيب لإذابة الببتيدات بالكامل.
      ملاحظة: تأكد من إعادة تكوين الحبيبات أو الفيلم المجفف بالكامل. يخاطر الذوبان القائم على الماصة بفقدان الببتيد بسبب الالتصاق بأسطح الأطراف.
   7. صوتنة الببتيدات المعاد تشكيلها لمدة 5 دقائق في صوتات حمام مملوءة بالماء البارد لضمان الذوبان الكامل ومنع ارتفاع درجة الحرارة.
   8. قم بالطرد المركزي للببتيدات عند 20,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. انقل المادة الطافية الببتيد إلى قارورة أخذ العينات التلقائية المناسبة للتحميل على نظام LC-MS. استخدم قوارير البولي بروبيلين منخفضة الحجم وعالية الجودة واختبارها بواسطة كروماتوغرافيا الغاز (GC) مع أغطية الحاجز المصنوعة من السيليكون / البولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) لتقليل فقد العينة. قم بتسمية قوارير التسمية بوضوح مع معرف العينة وترتيب الحقن.
   9. تقدير تركيز الببتيد باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 280 نانومتر. لاحظ أن هذا تقريبي ويمكن أن يتأثر بمحتوى المخلفات العطرية أو الملوثات. بدلا من ذلك ، استخدم فحوصات الببتيد اللونية لقياس كمية أكثر دقة.
3. معلمات LC و MS
   ملاحظة: تم تحسين معلمات LC و MS التالية لنظام nano-LC إلى جانب مطياف الكتلة المستخدم في البروتوكول الحالي. بالنسبة لأنظمة nano-LC الأخرى ومطياف الكتلة ، يجب تعديل المعلمات وفقا لذلك.
   1. قم بإعداد المراحل المتنقلة أسبوعيا لضمان توافق LC-MS وتقليل التلوث: (1) المرحلة المتنقلة أ: أضف 1 مل من درجة LC-MS إلى 1 لتر من الماء من الدرجة LC-MS ، و (2) المرحلة المتنقلة ب: أضف 1 مل من درجة LC-MS FA إلى 1 لتر من ACN من الدرجة LC-MS.
      ملاحظة: استخدم فقط المذيبات والأحماض من فئة LC-MS. قم بإعداد كلتا المرحلتين في عبوات زجاجية نظيفة وغاز إذا طلب ذلك نظام LC. تخلص من المراحل غير المستخدمة على أساس أسبوعي لتجنب نمو الميكروبات أو تدهورها.
   2. قم بتركيب عمود شعري من السيليكا المنصهرة بطول 25 سم وقطره الداخلي 75 ميكرومتر معبأ بجزيئات الطور العكسي C18 بطول 25 سم وقطره 75 ميكرومتر.
      ملاحظة: تعامل مع الأعمدة بعناية لتجنب إدخال فقاعات الهواء أو إتلاف مواد التعبئة. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للتثبيت وتوازن العمود.
   3. قم بتكييف العمود عن طريق زيادة معدل التدفق تدريجيا من 50 نانولتر / دقيقة إلى 300 نانولتر / دقيقة باستخدام المرحلة المتنقلة ب بنسبة 3٪.
      ملاحظة: تضمن هذه الخطوة ترطيب المرحلة الثابتة وتوازنها بشكل صحيح قبل حقن العينة. مراقبة ضغط العمود أثناء زيادة معدل التدفق. قد تشير ارتفاعات الضغط المفاجئة إلى فقاعات الهواء أو انسداد العمود. يمكن اعتبار التوازن كاملا عندما يستقر ضغط خط الأساس.
   4. حافظ على درجة حرارة العمود عند 50 درجة مئوية لضمان الأداء الكروماتوغرافي الأمثل.
   5. حقن 100 نانوغرام من الملخص التربتيكي لخلية HeLa كمعيار لمراقبة الجودة (QC) لتقييم أداء النظام.
      ملاحظة: يعمل حقن مراقبة الجودة هذا كمعيار لتقييم تناسق وقت احتفاظ LC ، وحساسية MS ، وتغطية البروتين عبر عمليات التشغيل. قارن عدد تحديد البروتين ، وقابلية تكرار وقت الاستبقاء ، وشدة الإشارة بمجموعة بيانات مراقبة الجودة المرجعية لتأكيد جاهزية النظام قبل تحليل العينات التجريبية. استخدم معايير هضم HeLa التجارية المعدة بتركيزات معروفة من أجل التكاثر عبر التجارب.
   6. استخدم شطف متدرج من 2٪ إلى 35٪ من المرحلة المتنقلة B على مدار 90 دقيقة بمعدل تدفق 300 nL / دقيقة. يوفر التدرج اللوني لمدة 90 دقيقة فصلا عالي الدقة للببتيد مناسبا للبروتينات المعقدة. بعد التدرج ، استمر في 95٪ من المرحلة المتنقلة B لمدة 7 دقائق لغسل العمود.
      ملاحظة: قم بتضمين خطوة إعادة التوازن (على سبيل المثال، العودة إلى 2٪ B لمدة 10-15 دقيقة) قبل الحقن التالي لضمان قابلية تكرار العمود عبر عمليات التشغيل. تجنب التغييرات المفاجئة في التدرج ، والتي يمكن أن تؤثر على استقرار وقت الاستبقاء وشكل الذروة.
   7. قم بإجراء تحليل MS باستخدام مطياف الكتلة المزود بمصدر تأين بالرش الكهربائي متوافق مع التدفق النانوي (على سبيل المثال ، نمط CaptiveSpray).
      ملاحظة: يوفر مصدر أيون CaptiveSpray رذاذ كهربائي مستقر بمعدلات تدفق نانوية منخفضة، مما يعزز كفاءة التأين والحساسية. بالنسبة للمختبرات التي تستخدم مطياف الكتلة البديلة ، اضبط معلمات الاستحواذ والتأين وفقا لذلك. تأكد من الضبط والمعايرة المناسبين قبل التحليل للحفاظ على الدقة والدقة. ضع باعث الرش بشكل صحيح وراقب ثبات الرش أثناء التشغيل لمنع انقطاع الإشارة.
   8. استخدم طريقة diaPASEF المستقلة عن البيانات³². بالنسبة للمستخدمين الذين ليسوا على دراية ب diaPASEF ، راجع الوثائق الفنية للشركة المصنعة أو البروتوكولات الحديثة التي تصف مهام سير عمل قياس الطيف التنقل الأيوني المحاصر (TIMS) -DIA³³ لتحسين أنواع العينات المختلفة أو أطوال التدرج.
      ملاحظة: يجمع diaPASEF بين TIMS و DIA لزيادة سرعة التسلسل والحساسية عن طريق محاذاة أيونات السلائف والتجزئة في بعد الحركة³⁴. تأكد من معايرة جهاز TIMS بشكل صحيح ومزامنته مع رباعي الأقطاب لتجنب اختلال محاذاة الحركة الأيونية والنوافذ الشاملة.
   9. استخدم إعدادات الأداة التالية: (1) نطاق الكتلة: 100 إلى 1700 م / z ؛ (2) نطاق الحركة الأيونية: 0.60-1.60 فولت · ثانية / سم² ؛ (3) طاقة الاصطدام: 20-59 فولت ، مكثف ؛ (4) وقت المنحدر: 100 مللي ثانية ؛ (5) وقت التراكم: 100 مللي ثانية ؛ (6) نطاق الكتلة ل diaPASEF: 400-1201 Da ؛ (7) عرض النافذة الشاملة: 26 Da مع تداخل 1 Da ؛ (8) عدد خطوات الكتلة لكل دورة: 32 ؛ (9) وقت الدورة: ~ 1.8 ثانية
      ملاحظة: تم تحسين هذه الإعدادات لتحقيق التوازن بين عمق التغطية وسرعة المسح. قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات طفيفة (على سبيل المثال ، عرض النافذة أو عدد الخطوات) اعتمادا على تعقيد العينة وطول التدرج وأداء نظام LC-MS. يشير تحديد أكثر من 7,500 بروتين لهضم HeLa إلى الأداء الأمثل للنظام. وقد يختلف عدد بطاقات الهوية حسب الصك وينبغي تقييمه وفقا لذلك.
   10. قم بتحميل 300-400 نانوغرام من عينة الببتيد لكل حقنة لمنع التحميل الزائد على العمود التحليلي. يمكن أن يؤدي الحمل الزائد إلى توسيع الذروة وقمع الأيونات وتقليل قابلية التكاثر. تأكد من تركيز الببتيد قبل الحقن باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو مقايسة الببتيد اللوني لتجنب التباين عبر الأشواط.
   11. قم بتشغيل الحقن الفارغة بين مجموعات العينات لتجنب الترحيل. استخدم المرحلة المتحركة A بنسبة 100٪ (ماء يحتوي على 0.1٪ FA) كحقنة فارغة. يؤدي هذا إلى طرد الببتيدات المتبقية من العمود ويقلل من التلوث بين التشغيل. راقب أيونات خط الأساس والخلفية لتأكيد التنظيف المناسب.
4. تحليل بيانات DIA
   1. استخدم برنامجا مناسبا يدعم تحليل البيانات باستخدام سير عمل directDIA³⁵ والمعالجة الخالية من المكتبة لبيانات بروتينات DIA. قم بإجراء تحديد البروتين وقياسه بناء على قاعدة بيانات UniProt FASTA³⁶ ، مع معلمات البحث القياسية وإعدادات القياس الكمي الافتراضية.
      ملاحظة: جميع المعلمات ، بما في ذلك خصوصية الإنزيم ، وإعدادات التعديل ، وعتبات FDR ، ومخرجات ما بعد التحليل ، مفصلة في الملف التكميلي 1. يمكن أيضا استخدام منصات تحليل DIA البديلة مثل DIA-NN³⁷ إذا كانت تدعم مهام سير العمل والمخرجات المماثلة.
   2. قم بتشغيل directDIA الخالي من المكتبة مع قطع قيمة q المقابلة ل 1٪ FDR على مستويات السلائف والببتيد ومجموعة البروتين ؛ استبعاد تعريفات الشرك قبل التحليل النهائي.
      ملاحظة: لم تتم إضافة معايير iRT. تم قياس الأداء من خلال عمليات ملخص HeLa مقابل معايير تحديد الهوية المحددة مسبقا ومعايير استقرار وقت الاستبقاء.

النتائج

بعد التنفيذ الناجح للبروتوكول ، يجب أن يحصل المستعملون على مجموعات بيانات تفاعلية عالية الجودة مناسبة لتحليل dfPPI النهائي. يتم تحديد البروتين من بيانات DIA عند 1٪ FDR (مستويات PSM والبروتين) ، ويستخدم القياس الكمي شدة خام أو أعداد طيفية ل MS / MS (وليس LFQ). تشمل توقيعات مراقبة الجودة المتوقعة: التجميع الضيق للنسخ المماثلة التقنية بواسطة PCA ، وسيط السلائف / السير الذاتية البروتينية حوالي 10-12٪ ، والتجميع الهرمي المدفوع بالأصل البيولوجي بدلا من النسخ المتماثل ، والإثراء القوي على مستوى المسار على g: Profiler / Reactome.

إنشاء مسبار PU والتحقق من صحة النشاط قبل الاستخدام

يتم تحضير حبات البولي يوريثان عن طريق اقتران جزيء صغير مرتبط ب epichaperome مع الاغاروز المنشط ب NHS ، كما هو موضح سابقا²⁵. تنتج عبوة الراتنج القياسية سعة 25 مل ~ 25 مل من حبيبات البولي يوريثان المخزنة كملاط 1: 1 في الأيزوبروبانول. ضعيها في أنابيب منخفضة الارتباط وخزنها عند -20 درجة مئوية ، محمية من الضوء (على سبيل المثال ، لفها بورق الألمنيوم). في ظل هذه الظروف ، تظل الدفعة مستقرة لمدة ≥12 شهرا. قبل الاستخدام ، قم بإزالة الأيزوبروبانول وتوازن الخرز في المخزن المؤقت للربط الأصلي (الخطوة 1.3). كل دفعة مؤهلة في التوليف وبشكل دوري بعد ذلك باستخدام فحصين (الشكل 2): (ط) المنسدلات المتطابقة ذات الأداء النوعي البيولوجي من محلل عالي epichaperome (على سبيل المثال ، MDA-MB-468) ومحللة نباتية منخفضة (على سبيل المثال ، ASPC1) في ظل ظروف متطابقة (40 ميكرولتر من ملاط حبة مع 250 ميكروغرام من البروتين الكلي ؛ 3 ساعات عند 4 درجات مئوية ؛ الغسيل الأصلي) ، المبذوب / الطبيعة ، واللطخة المناعية ل HSP90 ، HSC70 ، و HOP. القبول: إثراء قوي في عينة epichaperome-high مع الحد الأدنى من الإشارة في العينة المنخفضة. نسب شدة النطاق يمكن مقارنتها بالمجموعة المرجعية (±20-30٪). (ثانيا) يلتقط متوازي لملف تعريف البضائع العالمي من محللة عالية epichaperome مع حبات PU مقابل حبات التحكم الخاملة المتطابقة ، وتحميل أحجام مسح متساوية على SDS-PAGE ، وصمة عار Coomaassie. القبول: تظهر حبات PU شحنة غنية وعالية الوزن الجزيئي مع الحد الأدنى من الخلفية في حارة حبة التحكم. دفعة 25 مل تدعم ~ 600 التقاط عند 40 ميكرولتر لكل عينة. تقاعد كثيرا إذا كانت الخصوصية أو ملف تعريف الشحن خارج القبول بعد إعادة الغسيل / إعادة التوازن.

النتائج التمثيلية لبروتوكولات الهلام والخرزة

في مقارنة تجريبية وجها لوجه على خلايا MDA-MB-468 عالية epichaperome ، أنتجت تدفقات العمل داخل الهلام وعلى الخرزة تفاعلات متوافقة للغاية: تمت مشاركة 4,616 من 6,333 بروتينا (73٪) على مستوى مجموعة البروتين ، مع اكتشاف 1,275 (20٪) فقط عن طريق الهلام و 442 (7٪) فقط عن طريق الخرزة. كان الاتفاق على مستوى المسار أعلى: من بين 860 مصطلحا من مصطلحات Reactome ، كان 727 (85٪) شائعا ، مع 81 (9٪) فريدا من نوعه في الهلام و 52 (6٪) فريدا من نوعه على الخرزة. كان متوسط شدة البروتين ~ 3× أعلى بالنسبة للهلام من الخرزة ، بما يتفق مع تركيز شطف الهلام ، لكن هذا لم يؤثر ماديا على توافق المسار.

مثال على نطاق المجموعة وتوقيعات مراقبة الجودة

على سبيل المثال ، قمنا بتحليل اثنتي عشرة عينة بيولوجية (الشكل 3). تم مسح أربع عينات ومعالجتها عن طريق الهضم في الهلام. خضعت ثماني عينات لتنقية التقارب لمجمعات epichaperome متبوعة بالهضم على الخرزة و nano-LC-MS / MS في نسخة مكررة تقنية. لوحظت توقيعات مراقبة الجودة المتوقعة: التجميع الضيق للنسخ المماثلة التقنية بواسطة PCA ، ومتوسط السلائف / السير الذاتية البروتينية ~ 10-12٪ ، والتجميع الهرمي المدفوع بالأصل البيولوجي بدلا من التكرار ، والتخصيب القوي على مستوى المسار على g: Profiler / Reactome. توضح هذه النتائج قابلية التكرار عبر مكونات سير العمل ، والكشف الواسع عن البروتينات المشاركة في epichaperome ، وقابلية التفسير الوظيفي الواضحة للمتفاعلات التفاضلية على مستوى المسار. تطابقت إثراء المسار المستمدة من كلا مهام سير العمل مع مخرجات dfPPI المنشورة لهذا الخط ، والتي تم التحقق من صحتها من خلال العديد من المقايسات المتعامدة البيوكيميائية والوظيفية¹⁷.

جودة المواد المدخلة والهضم

يظهر جل SDS-PAGE ملون ب Coomassie لأربعة من العينات التي تمت معالجتها عن طريق الهضم الهلامي (الشكل 3 أ). يوضح الجل التقاط البروتين القابل للتكرار والتوزيع المتسق للنطاقات عبر الممرات ، مما يؤكد الإثراء الناجح لمجمعات البروتين من المحللات الأصلية قبل قياس الطيف الكتلي. توضح ملفات تعريف تفاعلية مشوهة أن خطوة التقاط التقارب تنتج مدخلات بروتينية كافية ومتسقة لتحليل MS النهائي.

تظهر التفاعلات الملتقطة تغطية بروتينية واسعة عبر الأوزان الجزيئية ، مما يعكس الإثراء الناجح لتجميعات البروتين من المحللات الأصلية. بشكل حاسم ، لا يقتصر هذا الاسترداد على البروتينات الوفيرة ولكنه يشمل تفاعلات منخفضة الوفرة ، مما يوفر التعقيد والعمق المطلوبين للتحليل على مستوى الأنظمة.

الضوابط والخصوصية على نطاق واسع

في سير العمل هذا، نستخدم حبات التحكم فقط للمقاصة المسبقة (انظر الخطوتين 1.3 و 1.4)؛ نحن لا نقوم بإجراء عمليات التقاط مقارنة روتينية "مسبار خامل" على كل عينة حيوية. بالنسبة للمجموعات السريرية الكبيرة ، تستهلك الالتقاط الخاملة مواد ثمينة ولكنها تضيف القليل من القيمة التفسيرية ل dfPPI لأن الإحصاءات النهائية تعمل على مستوى الشبكة / المسار ، وليس على مستوى أي بروتين واحد. لا تظهر الملوثات العشوائية أو اللاصقة بالراتنج بطريقة منسقة عبر أعضاء نفس المسار ، وبالتالي لا تنجو من اختبارات الإثراء على مستوى المسار أو مرشحات الاتساق على مستوى المجموعة. من الناحية العملية ، يتم ضمان الخصوصية من خلال (أنا) المقاصة المسبقة ، (ثانيا) قابلية التكرار الضيقة (PCA / CV) ، و (ثالثا) استقرار المسار عبر العتبات وإعادة أخذ العينات. تاريخيا ، قمنا بتقييم تجارب كتلة الالتقاط الخامل والمنافس القابل للذوبان (PU-H71) ووجدنا أنها لم تغير نتائج مسار dfPPI^16،17،21 ، بينما تستهلك مواد سريرية لا يمكن الاستغناء عنها. ومن ثم ، فإننا نحتفظ بها للتحقق التجريبي فقط. بالنسبة للمجموعات التي تفضل الفحوصات الصريحة على مستوى التشغيل، نلاحظ أن كلا الخيارين متوافقان مع البروتوكول ولكنهما غير مطلوبين لتحليلات dfPPI على نطاق المجموعة.

نسخ الرقم

يستند استدلال المسار في dfPPI إلى المجموعة ولا يتطلب رقم نسخ متماثل ثابت. من خلال عمليات الاستحواذ القوية ، يمكن لعينة واحدة لكل حالة أن تنتج مكالمات مسار استكشافي. للتحليلات التأكيدية ، نوصي ب ≥3 تكرارات بيولوجية لكل حالة للخلايا المزروعة (مع حقن LC-MS / MS مكررة عندما يكون ذلك ممكنا) ، و Ns المناسبة للمجموعة للأنسجة البشرية (عادة ≥5-10 لكل مجموعة للاكتشاف ، أكبر إذا تم تقسيمها إلى طبقات حسب المتغيرات المشتركة). نقوم بتقييم الاستقرار عن طريق تكرار التجميع (PCA) ، وسيرة ذاتية السلائف المتوسطة (الهدف ~ 10-15٪) ، والتمهيد / إعادة أخذ عينات نتائج التخصيب.

قابلية التكرار التقنية عبر عمليات التشغيل

تم تقييم قابلية التكاثر التقنية باستخدام تحليل المكون الرئيسي (PCA) (الشكل 3 ب) لبيانات شدة الببتيد من العينات المهضومة على الخرزة (ثمانية أدمغة فئران ، تعمل بشكل مكرر). تتجمع التكرارات بإحكام لكل عينة بيولوجية ، بينما تم فصل العينات المختلفة بشكل نظيف على طول المكونين الرئيسيين الأولين. أوضح المكونان الرئيسيان الأولان 28.6٪ و 22.0٪ من التباين الكلي ، على التوالي ، ووزعوا العينات وفقا للاختلافات البيولوجية بدلا من الضوضاء التقنية. يعكس هذا الهيكل تناسقا تحليليا عاليا ويؤكد أن الطريقة تحافظ على الاختلافات ذات الصلة بيولوجيا ، وهو أمر بالغ الأهمية لتمكين dfPPI من اكتشاف إعادة توصيل الشبكة الخاصة بالحالة.

اتساق الكشف عبر العينات

توضح توزيعات معامل التباين (CV) لشدة أيونات السلائف أن الغالبية العظمى من الميزات تقل عن 20٪ CV ، مع متوسط قيم تتراوح من 9.7٪ إلى 11.9٪ عبر الظروف (الشكل 3 ج). تؤكد هذه النتائج الكشف المتسق عن مرض التصلب العصبي المتعدد واستعادة الببتيد عبر النسخ المتماثلة.

النطاق الديناميكي وتغطية البروتين

أظهر التجميع الهرمي لقيم وفرة البروتين المحولة بالسجل (الشكل 3D) فصلا قويا للعينات والحفاظ على التباين بين العينات ، بينما يعكس أيضا النطاق الديناميكي الواسع الذي تم التقاطه في عمليات تشغيل MS. امتدت كثافة البروتين من التفاعلات منخفضة الوفرة إلى مجموعات البروتين عالية الإثراء ، كما يتضح من التدرج الأزرق إلى الأصفر. تؤكد البيانات أن البروتوكول يتيح اكتشاف مجموعات البروتين المتنوعة والتفاعلات ، والتقاط كل من المكونات الأساسية والطرفية.

الترجمة الوظيفية عبر dfPPI

لدعم التفسير والاستنساخ ، نقدم مصدرين متكاملين لتحليلات مجموعة بيانات dfPPI: (1) تطبيق ويب تفاعلي لامع (https://epichaperomics.mskcc.org/ تم تحديثه إلى https://dfppi.mskcc.org) و (2) مهام سير عمل مفتوحة وقابلة للبرمجة النصية وملفات جلسة Cytoscape التي تم إصدارها مع دراسات dfPPI السابقة (GitHub / Zenodo) ^{38،39،40،41}. يستوعب التطبيق جداول الكثافة الأولية أو MS / MS الطيفي ، ويقوم بمراقبة الجودة (تكرار التجميع ، وفحوصات القيمة المفقودة) ، ومعالجة الضوضاء / الدفعات الاختيارية (الانحدار المتغير المشترك) ، وتحديد البروتينات المشاركة بشكل تفاضلي ، وتقديم قراءات المسار / الشبكة عبر المؤامرات التفاعلية والتقارير القابلة للتنزيل - دون الحاجة إلى الترميز.

يتعامل dfPPI مع الشدة المقاسة أو الأعداد الطيفية كوكلاء ل "مشاركة epichaperome". يختار المستخدمون نموذج اتصال تفاضلي (DC) يتراوح من اختبار t بسيط ثنائي الذيل (افتراضي) إلى نماذج خطية مدركة للمتغيرات المشتركة. يمكن أيضا تخطي خطوة التيار المستمر. بعد DC ، يقوم المستخدمون بتعيين عتبات تغيير الطي و p-value (تعكس الإعدادات الافتراضية عمل dfPPI السابق ؛ على سبيل المثال ، FC > 1.0 ، الاسمية p ≤ 0.25) لتمرير المرشحين إلى التخصيب. يتوفر محركان للتخصيب: GSEA المستند إلى الرتبة (على الإحصائيات الموقعة) والتمثيل المفرط (الهندسي الفائق) عبر g: Profiler مع تصحيح الاختبارات المتعددة. بالنسبة للسياق الذي يركز على المرافق ، يوفر خط الأنابيب أيضا تحليل تخصيب Interactome (iEA) لاختبار ما إذا كانت التفاعلات المباشرة لبروتينات سقالة المرافق ممثلة بشكل مفرط بين البروتينات المشاركة التفاضلية. تعرض الشبكة العقد / الحواف ذات الوزن حسب حجم التأثير و / أو الدعم الإحصائي ، مما يتيح تصور إعادة الأسلاك المنسقة بدلا من تأثيرات البروتين الفردي. بالنسبة للمستخدمين الذين يفضلون مهام سير العمل النصية ، فإن كود R الأساسي وملفات جلسة Cytoscape المستخدمة لإنشاء خرائط وأشكال الشبكة متاحة للجمهور (على سبيل المثال ، GitHub / Zenodo) ^{38،39،40،41} مع المنشورات المرتبطة^{17،18،19،20} ويمكن تشغيلها محليا أو تكييفها لمجموعات البيانات الجديدة.

يوصى بقطع متساهل (تغيير الطي > 1.0 ؛ p الاسمي ≤ 0.25) للاحتفاظ بإشارات حالة التفاعل التي يدخلها إثراء التقارب. ثم نقوم بتحويل التحكم الإحصائي إلى مستوى المسار: يتم اختبار البروتينات المرشحة للإثراء عبر الأنطولوجيات المنسقة (على سبيل المثال ، GO ، Reactome) باستخدام g: Profiler ، وتحدد قيم المسار المعدل للاختبار المتعدد الأهمية والترتيب. يعكس هذا التصميم هدف dfPPI - للكشف عن إعادة توصيل الشبكة المنسقة ، وليس التعبير التفاضلي أحادي البروتين - ويتجنب التطبيع على مستوى البروتين الذي يمكن أن يحجب إشارات التخصيب في مجموعات البيانات المنسدلة. كما هو موضح في دراسات dfPPI السابقة^17،20 ، فإن عتبات مستوى البروتين الأكثر تساهلا تنتج مكالمات مسار مستقرة وذات صلة بالأمراض ، بينما يمكن استخدام نماذج أخرى (على سبيل المثال ، النماذج الخطية مع انكماش بايز التجريبي) عندما يستدعي التباين أو المتغيرات المشتركة الدفعية ذلك ، دون تغيير الاستدلال الأساسي المتمحور حول المسار.

يؤدي التقاط التقارب حتما إلى إثراء البروتينات "اللزجة" (على سبيل المثال ، الكيراتين ، وبروتينات الهيكل الخلوي ، والبروتينات الريبوسومية) ، وقد تلتقط حبات البولي يوريثان أيضا المتفاعلات المرافقة العامة. في dfPPI ، هذه لا تقود علم الأحياء لعدة أسباب. أولا ، يزيل المقاصة المسبقة والغسالات الصارمة معظم المواد الرابطة غير المحددة. ثانيا ، تظهر المجلدات العامة ، بما في ذلك العديد من التفاعلات المرافقة ، تغييرات في الطي بالقرب من 1.0 عبر الظروف و / أو الكشف غير المتسق وبالتالي تفشل شاشات قيمة FC / p. ثالثا ، يعتمد إثراء المسار على المجموعة ومدركا للخلفية: يتم حساب الأهمية مقابل البروتين المكتشف الخاص بالتجربة ، ويتطلب العديد من أعضاء نفس المسار للتغيير المشترك. تنتشر الملوثات العشوائية أو عالية الوفرة عبر العديد من المصطلحات وبالتالي لا تشكل تخصيب متماسك ومهم من روزفلت. لا يمكن لأي ملوث بروتين واحد أو غير ذلك أن "يقوم" بمكالمة مسار. رابعا ، يفسر dfPPI التماسك على مستوى الشبكة ، وليس البروتينات الفردية. يجب أن تنجو استدعاءات المسار من تصحيح الاختبارات المتعددة (على سبيل المثال ، g: قيم p المعدلة لملف التعريف) ، والحد الأدنى من أحجام مجموعة الجينات ، واتساق التكرار. جنبا إلى جنب مع المسح المسبق المتطابقة للحبة الخاملة وتصفية الملوثات الشائعة ، يجعل هذا الإطار dfPPI قويا في الخلفية: حتى في حالة وجود مئات البروتينات غير الإعلامية ، فإنها لا تغير تصنيفات المسار لأن التخصيب يعتمد على عدد البروتينات المتوافقة داخل المسار ، وليس الطول الإجمالي لقائمة البروتين. علاوة على ذلك ، فإن كل دراسة dfPPI المنشورة حتى الآن قد أكدت التنبؤات على مستوى المسار والشبكة من خلال التحقق التجريبي المكثف (على سبيل المثال ، الكيمياء الحيوية المستهدفة ، وقراءات الإشارات ، والاضطرابات الجينية أو الدوائية) ^{16،17،18،19،20} ، مما يدل على أن مخرجات dfPPI ليست مجرد قوائم بروتينات صاخبة ولكنها خرائط قابلة للتكرار لخلل شبكة PPI المرتبط بالأمراض.

لتقييم المشهد الوظيفي الذي تم التقاطه بواسطة مجموعة بيانات dfPPI من الشكل 3D ، أجرينا تحليل التخصيب باستخدام g: Profiler⁴² (الشكل 3E). تظهر النتائج تغطية قوية للتعليقات التوضيحية عبر جميع الأنطولوجيا الوظيفية الرئيسية ، بما في ذلك العملية البيولوجية لعلم الوجود الجيني (GO-BP) ، والوظيفة الجزيئية (GO-MF) ، والمكون الخلوي (GO-CC) ، بالإضافة إلى موارد المسار المنسقة مثل Reactome و KEGG و WikiPathways. يوضح هذا التحليل التمثيلي قوة رئيسية لنهج dfPPI: قدرته على الكشف عن ارتباطات المسار ذات المغزى البيولوجي عبر أنواع التعليقات التوضيحية المتنوعة ، حتى من أحجام العينات الصغيرة نسبيا. من المحتمل أن تعكس تغطية Reactome الواسعة التي لوحظت هنا حقيقة أن dfPPI يعتمد على إعادة توصيل التغييرات على مستوى التفاعل لشبكات البروتين التي يتم تعيينها مباشرة على العمليات متعددة المكونات وشلالات الإشارات ، والتي يتم تمثيلها جيدا في هيكل Reactome. نظرا لأن dfPPI يستفيد من التغييرات في الاتصال بدلا من التعبير ، فهو مناسب بشكل خاص لاكتشاف التحولات الوظيفية على مستوى الأنظمة التي قد تفوتها النسخ أو البروتينات الوفيرة فقط. تتوافق هذه النتيجة مع أعمال أخرى حيث أنتج Reactome باستمرار التخصيب الأكثر تماسكا وذات الصلة بالأمراض من مجموعات البروتين المشتقة من dfPPI^{14،15،16،17،18،20،21}.

يتم تنظيم Reactome حول عمليات ومجمعات متعددة البروتينات (شلالات نقل الإشارة ، وحدات دورة الخلية ، تجمعات التمثيل الغذائي). نظرا لأن dfPPI يثري التفاعلات المشاركة في epichaperome - أي مجموعات من البروتينات التي يتم تجنيدها وظيفيا في سقالات المرض - يحتوي إنتاجها بشكل طبيعي على وحدات مسار متماسكة بدلا من الضربات المعزولة. ينتج عن هذا الالتقاط المنسق تغطية Reactome واسعة وعالية الأهمية عبر المسارات الفرعية والتسلسلات الهرمية ذات الصلة. في المقابل ، تبلغ omics التي تتمحور حول الوفرة (علم النسخ ؛ البروتينات العالمية) عن تغييرات التعبير ، وليس حالات التفاعل. يوفر AP-MS أحادي الطعم أو وضع العلامات على القرب أحياء محلية حول طعم هندسي واحد في كل مرة ؛ وغالبا ما يوفر الربط المتقاطع / التجزئة المشتركة اتصالا متناثرا. لا ينتج أي من هذه ، بمفرده ، بشكل روتيني المجموعات المختارة في السياق على مستوى النظام التي يرجعها dfPPI من التقاط واحد داخلي المنشأ في الخلايا أو الأنسجة. والنتيجة هي إثراء المسار الواسع (تضيء فروع Reactome المتعددة) ومتماسكا ميكانيكيا (تتحول البروتينات معا لأن تفاعلاتها - وليس مجرد كمياتها - يتم إعادة توصيلها بواسطة epichaperomes). ومع ذلك ، نلاحظ أن dfPPI مكمل وليس بديلا: كل طريقة تفاعلية لها نقاط قوة وقيود مميزة ، ويجب أن يكون الاختيار الأمثل (أو المجموعة) مدفوعا بالسؤال البيولوجي وقيود العينة والدقة المطلوبة.

تؤكد هذه النتائج معا أن البروتوكول ينتج عنه مجموعات بيانات قابلة للتكرار وغنية بالمعلومات بيولوجيا يمكن استخدامها للكشف عن إعادة تشكيل تفاعل التفاعل التفاضلي عبر حالات المرض أو الاضطرابات التجريبية. يعد إخراج dfPPI مناسبا تماما للتكامل مع أطر إثراء المسار ويتيح تعيين أحداث إعادة الأسلاك الوظيفية التي لا يمكن اكتشافها بالطرق القياسية القائمة على الوفرة.

الشكل 1: نظرة عامة على منصة dfPPI. (أ) تتيح منصة dfPPI (تفاعل البروتين والبروتين المختل وظيفيا) تحديد الاختلالات الوظيفية في شبكة PPI الخاصة بالمرض من خلال سير عمل كيميائي بروتيني بروتيوم. يتضمن القسم 1 تحضير العينة والتقاط التفاعل باستخدام مجسات كيميائية تستهدف epichaperome مثبتة على مصفوفات التقارب (على سبيل المثال ، حبات PU). يحدد القسمان 2 و 3 مهام سير عمل هضم متوافقتين - على حبة أو في الجل متبوعا ب LC-MS / MS خال من الملصقات لتحديد تفاعل. يتم إجراء التحليلات الحسابية ، بما في ذلك النمذجة الإحصائية وإثراء المسار ، باستخدام خط أنابيب المعلوماتية الحيوية dfPPI ، والذي لا يغطيه هذا البروتوكول ولكنه متاح مجانا في https://epichaperomics.mskcc.org/. (ب) مبدأ dfPPI. في السياقات ذات الصلة بالأمراض ، تشكل epichaperomes الداخلية سقالات فوق جزيئية تعيد تنظيم شبكات PPI. تلتقط المجسات الكيميائية الموجهة من Epichaperome (على سبيل المثال ، حبات PU أو ما يعادلها) هذه السقالات مع متفاعلاتها المرتبطة مباشرة من الخلايا السليمة أو من المحللات الأصلية ، مما ينتج عنه منسدل متعدد الطعوم في تجربة واحدة. يمكن معالجة عناصر التحكم المتطابقة (على سبيل المثال ، التحكم في الخرز الخامل و / أو المنافسة مع المسبار المجاني) بالتوازي. يتم مسح المواد الملتقطة وهضمها على الخرزة أو في الهلام ، وتحليلها بواسطة LC-MS / MS ، ويتم قياس البروتينات (الكثافة أو العدد الطيفي MS / MS). يتم استخدام التفاعل الناتج لحساب التفاعلات التفاضلية عبر الظروف وإجراء إثراء المسار / الشبكة ، مما يكشف عن خلل PPI الخاص بالسياق على مستوى الأنظمة. لا يتطلب سير العمل أي وضع علامات جينية أو إفراط في التعبير ، وهو متوافق مع كل من الخلايا والأنسجة ، ويتوسع في الدراسات الجماعية. على العكس من ذلك ، يركز تصلب التصلب العصبي المتعدد التقليدي على طعم واحد محدد في كل مرة ، مما ينتج حيا محليا لكل بناء ويتطلب عادة العديد من التركيبات / التشغيل لأخذ عينات من الشبكة. في المقابل ، يستخدم dfPPI epichaperomes الداخلية كطعم ، حيث يلتقط العديد من PPIs المختلة في وقت واحد من النظام الأصلي ، مما يسرع من اكتشاف إعادة توصيل الشبكة الخاصة بالمرض ويوفر قراءات على مستوى المسار من التقاط واحد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التحقق من صحة دفعة PU حبة وخصوصية الالتقاط. (أ) الخصوصية البيولوجية واتساق الدفعة إلى الدفعة. تم تحلل خلايا MDA-MB-468 (عالية epichaperome) و ASPC1 (منخفضة epichaperome) في المخزن المؤقت الأصلي (20 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 7.4 ؛ 20 ملي كلوريوس الخوميس ؛ 5 ملي مولار MgCl₂ ؛ 0.01٪ NP-40 ؛ مثبطات البروتياز / الفوسفاتاز). لكل التقاط ، تم تحضين 40 ميكرولتر من ملاط حبة البولي يوريثان مع 250 ميكروغرام من البروتين الكلي (1 ميكروغرام / ميكرولتر) لمدة 3 ساعات عند 4 درجات مئوية مع الدوران. تم غسل الخرز في المخزن المؤقت الأصلي. تم تغيير طبيعة / إشحاف المجمعات في ~ 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS. تم حل 5-10 ميكرولتر من كل شطف بواسطة SDS-PAGE وتم تعبيثه مناعيا ل HSP90 و HSC70 و HOP. يتم عرض محللات الإدخال كمرجع. قطعتان من حبة PU (الدفعة 1 ، طازجة ؛ الدفعة 2 ، قديمة) تنتج إثراء قويا في MDA-MB-468 والحد الأدنى من الإشارة في ASPC1 ، مما يدل على الخصوصية المحفوظة واتساق الدفعة. (ب) البضائع العالمية مقابل خرز المراقبة. تمت معالجة محللات MDA-MB-468 كما في (أ) إما باستخدام حبات PU أو حبات التحكم المتطابقة. تم تحميل ~ 20 ميكرولتر من كل شطف ، مفصولة بواسطة SDS-PAGE ، وملطخة ب Coomassie. تستعيد حبات البولي يوريثان خاصية شحن معقدة وعالية ميجاوات للتجميعات المرتبطة ب epichaperome ، بينما تظهر حبات التحكم الحد الأدنى من الخلفية. يشار إلى علامات الوزن الجزيئي (kDa). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: النتائج التمثيلية من التقاط تقارب dfPPI ، وتحديد تفاعل التفاعل ، وتحليلات المعلوماتية الحيوية. (أ) جل SDS-PAGE الملطخ ب Coomassie من البروتينات المشوهة من تقارب حبة PU يلتقط التفاعلات المرتبطة ب epichaperome من أربع عينات دماغية بشرية تمثيلية (PT1-PT4). تم تغيير طبيعة مجموعات البروتين المرتبطة بالخرزة عن طريق الغليان في المخزن المؤقت لعينة SDS ، وتم حلها بواسطة SDS-PAGE ، وتلطيخها لتقييم استعادة التتفاعل عبر الأوزان الجزيئية. تم تحميل كل عينة في ممر منفصل ، مع وجود ممر فارغ بين العينات لتقليل التلوث المتبادل. تعكس إشارة خافتة تلاحظ أحيانا في هذه الممرات الفارغة تسردا طفيفا للعينة أثناء الرحلان الكهربائي. تمثل هذه المواد الهلامية العينات المقدمة إلى منشأة التصلب العصبي المتعدد ، حيث تم تقسيم كل ممر إلى خمس شرائح للهضم داخل الهلام وتحديد البروتين بواسطة MS. (ب) يكشف تحليل المكون الرئيسي (PCA) لشدة البروتين المحددة من تفاعلات epichaperome المهضومة على الخرزة من ثماني عينات تمثيلية من دماغ الفئران (يتم تشغيلها في نسخة) عن تجميع ضيق للتكرارات التقنية والفصل البيولوجي الواضح على طول PC1 و PC2. وهذا يؤكد قابلية التكاثر التقنية العالية والتباين البيولوجي الكافي لتحليل dfPPI القوي. يوضح هيكل البيانات أن الاختلافات على مستوى التفاعل - وليس القطع الأثرية التقنية - تقود فصل العينات ، مما يوفر أساسا قويا لنمذجة تفاعل التفاضل النهائي دون الحاجة إلى تطبيع اصطناعي. (ج) تظهر توزيعات معامل التباين (CV) لشدة أيونات السلائف عبر مجموعات العينات الثماني تباينا منخفضا باستمرار ، حيث يتراوح متوسط السيرة الذاتية من 9.7٪ إلى 11.9٪ (يشار إليه بخطوط متقطعة عمودية). تسلط هذه السير الذاتية المنخفضة الضوء على قابلية التكاثر والمتانة لخط أنابيب الكشف عن التصلب المتعدد وقياسه كميا. يدعم الاتساق استخدام قيم الكثافة الخام أو MS / MS كمدخلات موثوقة لتحليل dfPPI ، حيث يكون التباين في قوة التفاعل - وليس التعبير العالمي للبروتين - هو الإشارة البيولوجية ذات الأهمية. (د) خريطة حرارية للتجميع الهرمي لقيم كثافة البروتين المحولة في السجل₂ عبر جميع العينات (مع التكرارات الفنية الموضحة). تتجمع العينات حسب الأصل البيولوجي بدلا من تكرارها ، مما يؤكد الالتقاط القوي للتفاعلات المرتبطة ب epichaperome والحفاظ على التباين ذي الصلة بيولوجيا. يدعم النطاق الديناميكي الواسع والكشف المتسق عبر البروتينات جودة مجموعة البيانات لتحليل dfPPI. يمثل شريط المقياس قيم كثافة البروتين المحولة في السجل₂ ، والتي تتراوح من 2 (أزرق ، وفرة منخفضة) إلى 14 (أصفر ، وفرة عالية). (ه) مخطط مانهاتن لتحليل إثراء المسار الذي تم إجراؤه على البروتينات المتفاعلة تفاضليا التي حددها dfPPI. تم إجراء التخصيب باستخدام g: Profiler ، ويتم رسم المصطلحات المهمة بواسطة −log₁₀ (p-value) ، ملونة بمصدر التعليق التوضيحي: GO Molecular Function (GO: MF) ، GO BIOLOGICAL PROCESS (GO: BP) ، GO CELLULAR COMPONENT (GO: CC) ، KEGG ، Reactome ، WikiPathways ، وأنطولوجيا النمط الظاهري البشري (HP). يمثل هذا الإخراج الفائدة الأساسية ل dfPPI: الكشف عن المسارات الوظيفية ذات المغزى البيولوجي المضطربة من خلال إعادة تشكيل تفاعل مدفوع ب epichaperome. تؤكد التغطية الواسعة للتعليقات التوضيحية على الرؤية على مستوى الأنظمة التي يمكن تحقيقها من خلال هذا النهج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أسلوب	ما يلتقطه	نقاط القوة الرئيسية	القيود الرئيسية	الاستخدام النموذجي	قابلية التوسع (المجموعات المجموعية)
AP-MS (تنقية التقارب - MS)	التفاعلات المباشرة / شبه المباشرة لطعم واحد	خصوصية عالية كمي; جيد للتكوين المعقد	يتطلب طعما / علامة / أجسام مضادة. طعم واحد في كل مرة ؛ قد يفتقد عابر / ضعيف	تحديد شركاء البروتين محل الاهتمام	منخفض ومعتدل (مطلوب العديد من الطعوم)
وضع علامات القرب (على سبيل المثال، متغيرات BioID/APEX)	البروتينات في المنطقة المجاورة للطعم بمرور الوقت	يلتقط الجيران العابرين / الضعفاء. يعمل في الخلايا الحية	الهندسة الوراثية؛ وضع العلامات خارج الهدف ؛ معلمة ثقيلة	خرائط الأحياء المحلية ديناميكا	منخفض - معتدل (هندسة لكل طعم)
XL-MS (MS الربط المتبادل)	القرب المكاني / الاتصالات داخل / بين البروتينات	القيود الهيكلية; يلتقط جهات الاتصال العابرة	تحليل معقد; انخفاض اتساع البروتين عينة خاصة	الطوبولوجيا الهيكلية / السياقية	منخفض (متخصص)
التجزئة المشتركة / MS (CF-MS)	التنظيف المشترك للتجمعات المحلية	لا وضع علامات التجمعات الأصلية	كثيفة العمالة. الاستدلال المعقد حساسية محدودة	مشهد المجمع العالمي	المعتدل
CETSA / الشراكة عبر المحيط الهادئ	ملفات تعريف الاستقرار المشترك / التجميع المشترك	خالية من الملصقات الظروف الأصلية	غير مباشر لمثبطات مضخة المستهلك ؛ قيود الذوبان	المشاركة المستهدفة؛ التحولات الحرارية	المعتدل
dfPPI (epichaperomics)	إعادة توصيل التفاعل على مستوى الشبكة التي تم التقاطها بواسطة epichaperomes الداخلية كطعوم متعددة الإرسال	الذاتيه; لا وضع علامات يستجوب القبض على الآلاف من PPIs المختلة. قراءات المسار / الشبكة. متوافق مع الأنسجة صديقة للمجموعة	ينطبق فقط على سياق المرض; مجسات متخصصة (PU - الخرز ، YK5-B) ؛ غير مخصص لاكتشاف المجمع العام	إعادة تشكيل تفاعل سياق المرض ، وتحديد أولويات المسار ، وتوليد الفرضيات	مرتفع (مئات العينات ممكنة)

الجدول 1: مقارنة بين مناهج رسم خرائط PPI و dfPPI. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: إعدادات معلمة Spectronaut الكاملة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

يتيح البروتوكول الموضح هنا رسم خرائط لمثبطات PPIs المختلة في العينات البيولوجية الأصلية باستخدام منصة dfPPI. على عكس الطرق التقليدية التي تستنتج الخلل الوظيفي من الوفرة أو تغيرات التعبير ، تلتقط هذه المنصة إعادة توصيل الشبكة على المستوى الهيكلي عن طريق عزل التفاعلات الخاصة بالمرض من خلال تنقية التقارب باستخدام مجسات استهداف epichaperome ، متبوعة بمرض التصلب العصبي المتعدد الكمي القائم على الشدة الخالية من الملصقات. على الرغم من أن التطبيق الحالي يركز على أنسجة المخ بعد الوفاة ، إلا أن الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على أنواع العينات الأخرى ونماذج الأمراض ، بما في ذلك الخلايا والأنسجة المستزرعة من نماذج السرطان والتنكس العصبي والخلل المناعي^{16،17،18،19،20،22،23}.

يعتمد dfPPI على المجسات التي تختار حركيا epichaperomes وتحبس التجميعات بمتفاعلاتها المرتبطة. تشارك حبات البولي يوريثان (المشتقة من الأنماط الكيميائية المرتبطة ب epichaperome مثل PU-H71 / PU-AD) نواصفات نواة HSP90 بشكل غير تساهمي ولكن مع وقت إقامة طويل ، وهي سمة مميزة للانتقائية الحركية لتشكل epichaperome على مجمعات المرافق التقليدية²³. YK5-B عبارة عن مسبار تساهمي بيوتينيل موجه إلى HSC70 داخل epichaperomes ، مما يتيح التقاط الخلية قبل التحلل والحفاظ على PPIs الذاتية¹⁷. تنبع الانتقائية من PTMs المرتبطة بالأمراض التي تعيد تشكيل مطابقات HSP90 / HSC70 وكيمياء الجيب وتثبيت تجميعات epichaperome^{14،23،43،44} ؛ تؤدي هذه التغييرات_{إلى ارتباط عالي} التقارب وبطيء K للمجسات غير التساهمية من نوع PU⁴⁵ (وتمكين الالتقاط التساهمي مع YK5-B الموجه HSC70) ، وبالتالي الاحتفاظ الحركي بمجمعات epichaperome وعزل تفاعلاتها المباشرة وغير المباشرة ل LC-MS / MS. من الناحية العملية ، تعتبر حبات البولي يوريثان مثالية لسير عمل التحلل / التجانس ، بينما يدعم YK5-B التقاط الخلايا الحية. يحتفظ كلاهما بالتجميعات المعتمدة على السياق التي يمكن تحديدها بواسطة LC-MS/MS واستخدامها لتحليل dfPPI من المصب.

بالنسبة إلى dfPPI ، يلزم وجود خبرة متخصصة في الكيمياء لتجميع مجسات الالتقاط. ومع ذلك ، فإن هذا المطلب ليس فريدا من نوعه ل dfPPI: تعتمد طرق PPI المستخدمة على نطاق واسع (AP-MS ، ووضع العلامات القريبة ، و XL-MS) أيضا على المهارات المتخصصة - على سبيل المثال ، الاستنساخ / الطعوم ذات العلامات الهندسية ، وتوليد خط الخلايا المستقر ، وتحسين وضع العلامات / التشابك ، وخطوط الأنابيب المعلوماتية الحيوية المعقدة. في المقابل ، يتجنب dfPPI التلاعب الجيني والإفراط في التعبير عن الطعم ، ويعمل مباشرة على الخلايا أو الأنسجة الأصلية (بما في ذلك العينات الحيوية السريرية النادرة) ، ويستخدم تدفقات عمل التقاط التقارب القياسية و LC-MS الروتينية بالفعل في نوى البروتينات. لتقليل حواجز التبني ، تتوفر حبات البولي يوريثان التي تم التحقق من صحتها وخرز التحكم المتطابق عبر MTA من مختبر Chiosis ، ويتم تحديد خطوات المناولة / ضمان الجودة بالكامل في الخطوتين 1.3 و 1.4. أخيرا ، يتم دعم التحليل من خلال تطبيق dfPPI المستند إلى الويب الذي ينفذ الإحصائيات المطلوبة وقراءات المسار / الشبكة ، مما يقلل من عبء المعلوماتية الحيوية (أي للمستخدمين الذين ليس لديهم خلفية ترميز ومهارات المعلوماتية الحيوية الأساسية فقط).

يجيب كل من AP-MS و XL-MS ووضع العلامات القريبة والتجزئة المشتركة و CETSA / TPP على أسئلة مختلفة (المجلدات المباشرة ، أو القرب المكاني ، أو وضع العلامات على الجوار ، أو التجميع المشترك ، أو الاستقرار الحراري المشترك). dfPPI هي الطريقة المفضلة عندما يكون الهدف هو تعيين إعادة الأسلاك الداخلية المعتمدة على السياق في المرض - خاصة في الأنسجة الأصلية أو المجموعات السريرية الكبيرة حيث لا يكون وضع العلامات الجينية ممكنا ، وعندما تكون القراءات على مستوى المسار / الشبكة مطلوبة من التقاط واحد. يستخدم dfPPI epichaperomes كطعوم متعددة لالتقاط تغييرات التفاعل المنسقة عبر العديد من البروتينات في قاعدة واحدة منسدلة ، مما يتيح تحديد LC-MS / MS القابل للتطوير والتحليل المتمحور حول المسار من المواد الأولية. من الناحية العملية ، يمكن ل dfPPI زرع التحقق النهائي الذي يركز على الطعم (على سبيل المثال ، AP-MS على عقد معينة) ، بينما يمكن للطرق التقليدية تحسين الطوبولوجيا (الاتصالات المباشرة ، القيود المكانية) للمجمعات التي أبرزها dfPPI. انظر الجدول 1 للحصول على مقارنة جنبا إلى جنب.

تؤثر العديد من الخطوات الحاسمة على نجاح سير العمل. أولا ، مستخلصات البروتين عالية الجودة ضرورية. يتطلب ذلك معالجة دقيقة للأنسجة أو الخلايا - من الناحية المثالية تجميدها وتخزينها عند -80 درجة مئوية - لتقليل تحلل البروتين والحفاظ على المجمعات الأصلية. إن إدراج كل من مثبطات البروتياز والفوسفاتيز غير قابل للتفاوض: تعتمد سلامة epichaperome ، التي تعمل بمثابة "طعم" وظيفي في هذا الاختبار ، على تعديلات محددة بعد الترجمة للمكونات الأساسية مثل HSP90^23،43. على سبيل المثال ، يعد فسفرة Ser226 و Ser255 ضروريا لتثبيت تشكل epichaperome والحفاظ على وظيفة السقالات²³. يؤدي إغفال مثبطات الفوسفاتيز إلى الانهيار الهيكلي وفقدان الخصوصية البيولوجية.

محدد رئيسي آخر هو جودة ومعالجة مصفوفة تقارب حبات PU. يجب تخزين الخرز في 100٪ من الأيزوبروبانول عند -20 درجة مئوية واستخدامها في نافذة نشاط محددة ، من الناحية المثالية في غضون 1-2 سنوات. يجب التحقق من صحة النشاط قبل التجارب الحرجة ، حيث قد تظهر الخرزات القديمة قدرة ربط منخفضة أو تفاعلات غير محددة متزايدة. يجب أيضا تحسين وقت الحضانة ومدخلات البروتين: قد يؤدي الحضانة المفرطة إلى رفع الخلفية ، في حين أن عدم كفاية مدخلات البروتين قد يضر بعمق الكشف. نوصي بعمليات حضانة لمدة 3 ساعات وعمليات سحب تجريبية لمعايرة المدخلات المناسبة لكل نوع من أنواع العينات.

تتوافق استراتيجيتان للهضم مع هذا البروتوكول: على الخرزة والهلام. بينما ينتج عن كلا مهام سير العمل نتائج قابلة للتكرار ، يقدم كل منهما مقايضات. قد يؤدي الهضم داخل الجل إلى إدخال ملوثات مثل الكيراتين ويتطلب خطوات معالجة إضافية. يعمل الهضم على الخرزة على تبسيط سير العمل ويفضل بشكل عام عندما يكون معدل نقل العينة أو مقدار الإدخال محدودا. ومع ذلك ، يجب معايرة كميات البروتياز بناء على إجمالي مدخلات البروتين: على الرغم من أن الطريقة مصممة ل 750 نانوغرام من التربسين ، فقد يحدث هضم غير مكتمل إذا كانت مستويات البروتين مرتفعة ، مما يؤدي إلى الانقسامات المفقودة وتقليل استعادة الببتيد. ينصح بتقييم كفاءة الهضم وضبط مدخلات الإنزيم وفقا لذلك. يجب إجراء جميع خطوات الهضم في أنابيب منخفضة الارتباط باستخدام كواشف حديثة الصنع وخالية من التلوث لضمان الاتساق وتقليل الخلفية.

يعتمد تحميل البروتين لكل حقن LC-MS على سير عمل الالتقاط وإنتاجية الببتيد وسعة العمود. بالنسبة للهضم على الخرزة التي يتم تحليلها على أعمدة nano-LC C18 القياسية (~ 50-75 ميكرومتر معرف ، ~ 15-25 سم) ، نقوم عادة بتحميل 300-500 نانوغرام لكل حقنة. لم نلاحظ مكاسب في الأداء فوق ~ 400-500 نانوغرام ، في حين أن الأحمال العالية تخاطر بقمع الأيونات وتوسيع الذروة. بالنسبة لسير العمل داخل الهلام (على سبيل المثال ، خمس شرائح لكل حارة) ، نقوم عموما بحقن ~ 25٪ من المواد المحلاة لكل شريحة لكل تكرار ونحتفظ ب ~ 50٪ كنسخة احتياطية لإعادة الحقن إذا لزم الأمر. في جميع الحالات ، قم بقياس تركيز الببتيد قبل الحقن ، وتحقق من الاستجابة الخطية باستخدام ملخص مراقبة الجودة ، وضبط الحمل بحيث يتم الحفاظ على شكل الذروة الكروماتوغرافي وعمق التعريف دون التحميل الزائد.

يستخدم القياس الكمي الخالي من الملصقات عبر DIA على نطاق واسع في البروتينات نظرا لقابليته للتكاثر والعمق⁴⁶. ومع ذلك ، في سياق تجارب التقاط التقارب مثل هذا - حيث يكون الهدف هو تحديد البروتينات التي تتفاعل مع سقالات epichaperome بدلا من قياس استراتيجيات تطبيع وفرة البروتين العالمية مثل MaxLFQ ليست مناسبة. تفترض هذه الأساليب مدخلات موحدة وتشابه على مستوى البروتين ، والتي تنتهكها خطوة التخصيب الجوهرية لهذا البروتوكول. بدلا من ذلك ، توفر قيم الشدة أو العد الطيفي ل MS / MS تقديرا كميا كافيا وذا مغزى بيولوجيا للتحليل الوظيفي النهائي. تعكس هذه المقاييس قوة التفاعل النسبية أو تكرار البروتينات مع epichaperomes عبر الظروف. كما هو موضح في الدراسات السابقة^{16،17،18،20} ، فإن هذه القيم مناسبة تماما لتحليلات تفاعل على مستوى الأنظمة مثل dfPPI ، والتي تحدد المسارات البيولوجية المتغيرة دون الاعتماد على التطبيع على مستوى البروتين. من خلال الحفاظ على التباين البيولوجي الحقيقي الذي أدخله المرض أو العلاج ، يتيح القياس الكمي القائم على الشدة أو التصلب العصبي المتعدد / التصلب العصبي المتعدد رسم خرائط دقيقة وقوية لاختلالات شبكة PPI.

على الرغم من أن التقاط التقارب يقلل من مساحة البحث مقابل المحلل بالكامل ، إلا أن المنسدلات dfPPI لا تزال تحتوي على مئات إلى آلاف البروتينات التي تمتد على نطاق ديناميكي واسع ، بالإضافة إلى خلفية مخصبة بشكل مشترك. بالنسبة للمقارنات على نطاق الأترابية ، يؤدي اختيار السلائف العشوائية ل DDA إلى قيم مفقودة من التشغيل إلى التشغيل وأخذ عينات متغيرة من التفاعلات منخفضة الوفرة¹⁸. يقوم DIA بشكل منهجي بتجزئة جميع الأيونات في نوافذ محددة مسبقا ، مما يوفر عمقا أكبر ، وقيما مفقودة أقل ، وخصائص استنساخ أعلى للتشغيل والتي تكون حاسمة عندما يكون الاستدلال النهائي على مستوى المسار / الشبكة بدلا من بروتين واحد. هذا هو السبب في أننا نتوحد على DIA ل dfPPI.

كما هو الحال مع جميع طرق التقاط التقارب ، يعد ارتباط البروتين غير المحدد اعتبارا متأصلا. قد يتم الاحتفاظ بالبروتينات بسبب الالتصاق بالراتنج أو الوفرة العالية أو التراكم. في حين أن مثل هذه التفاعلات غير المحددة يمكن أن تظهر في المسح المنسدل ، فإن وجودها لا يقوض الهدف التحليلي النهائي لهذا البروتوكول¹⁷. لم يتم تصميم سير عمل dfPPI لتحديد التفاعلات الثنائية ولكن بالأحرى لاستخراج أنماط إعادة توصيل PPI على مستوى الأنظمة. يتم إجراء تحليلات الإثراء الوظيفي على التفاعلات التفاضلية والاستفادة من الإحصاءات المستندة إلى الشبكة للكشف عن التعديلات المنسقة على مستوى المسار. كما هو موضح في العمل^{السابق 17} ، يقلل هذا النهج على مستوى الأنظمة من تأثير البروتينات غير المحددة المعزولة ويسمح بالخروج من استنتاجات بيولوجية قوية من البيانات على مستوى الأتواج.

بالمقارنة مع مناهج رسم خرائط تفاعلية التقليدية - مثل الترسيب المناعي المشترك ، أو وضع العلامات على القرب ، أو الربط المتقاطع - توفر منصة dfPPI ميزة واضحة: فهي تلتقط إعادة تشكيل التفاعل الوظيفي في ظل الظروف ذات الصلة بالمرض دون الحاجة إلى هندسة الطعم أو الإفراط في التعبير. نظرا لأن الطريقة تعزل مجمعات البروتين المتكونة حول epichaperomes فوق الجزيئية ، فإنها تكتشف مجموعات البروتين الناشئة غير الموجودة في الأنظمة الصحية ، مما يتيح اكتشاف محركات جديدة للأمراض. هذا النهج قابل للتطوير وقابل للتكيف عبر الأنسجة والأنواع وحالات المرض ، وقد قدم بالفعل رؤى فريدة حول إعادة تشكيل البروتينات في السرطان والتنكس العصبي. على هذا النحو ، توفر هذه الطريقة أداة قوية للكشف عن الشبكات الوظيفية التي تعطلت في الأمراض البشرية.

بالإضافة إلى النماذج هنا ، فإن dfPPI في وضع جيد ل (أنا) الأفواج السريرية الكبيرة لتقسيم المرضى إلى طبقات حسب الخلل الوظيفي في الشبكة واكتشاف المؤشرات الحيوية الدوائية التي تبلغ عن المشاركة المستهدفة وتصحيح المسار. (ثانيا) أخذ العينات الطولية (على سبيل المثال ، قبل / بعد العلاج ، وتحديد مراحل المرض) لتتبع مسارات إعادة الأسلاك والتنبؤ بالمستجيبين ؛ (3) التكامل مع الفوسفوبروتيوميات وغيرها من الأوميكس المدركة ل PTM لربط تغييرات حالة التفاعل بإشارات المنبع؛ (رابعا) اللقطات التي تم حلها مكانيا من المناطق التشريح الدقيق (واجهات الورم الطبيعية ، والمناطق الفرعية في الدماغ) لرسم خريطة لعلم الأحياء المرضي للشبكة المحلية ؛ (5) حواشات الاضطراب (الوراثية أو المركبة) حيث ترشح قراءات dfPPI العقد القابلة للتنفيذ وآليات العمل؛ و (6) نمذجة الرسم البياني / الذكاء الاصطناعي التي تتعلم ميزات الشبكة الخاصة بالمرض من خرائط dfPPI للتشخيص والتصميم العلاجي. من الناحية المنهجية ، سيتيح التصغير والأتمتة (على سبيل المثال ، تنسيقات 96 بئرا) ومراقبة الجودة الموحدة خطوط أنابيب عالية الإنتاجية للدراسات الانتقالية والتجارب السريرية. أخيرا ، يمكن لمخرجات dfPPI أن تزرع متابعات مستهدفة - AP-MS أو XL-MS أو وضع العلامات القريبة - لحل طوبولوجيا الوحدات ذات الأولوية ، مما يؤكد تكامل الطريقة داخل مجموعة أدوات التفاعل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
2-ميركابتوإيثانول	سيغما-ألدرتش	M6250	سام، قابل للاشتعال
الأسيتونيتريل (ACN) أوبتيما	فيشر ساينتفيك	A955-1	درجة LC/MS (قابلة للاشتعال)
وسائط كروماتوغرافيا الألفة المنشطة من Affi-Gel 10	بيو-راد	1536099	يستخدم لصنع خرز PU-خرزات وتحكم (قابلة للاشتعال)
بيكربونات الأمونيوم (ABC)	سيغما-ألدرتش	09830-500G
عمود أورورا ألتيميت 25x75 C18 UHPLC	أيونأوبتيكس	AUR3-25075C18-CSI
فيلم الأشعة الذاتية	شركة إوين-باركر إكس-راي كورب	EBA45	بديل لاكتشاف إشارة الإضاءة الكيميائية بعد النقطة الغربية
بيوماشر مدمج الأنسجة الدقيقة	دي دبليو كيه لايف ساينسز كيمبل	7496250010	يستخدم لتوحيد أنسجة الدماغ المجمدة لاستخلاص البروتين
بروموفينول الأزرق	كاشف فيشر الحيوي	BP115-25
جهاز طرد مركزي لأنابيب 1.5 مل	إبندورف	5424
طرد مركزي لأنابيب 1.5 ملمتر	إبندورف	5417R	مع التحكم في درجة الحرارة
جهاز طرد مركزي لأنابيب 15-50 مل	إبندورف	5810R	تستخدم للأنابيب المخروطية
نظام التصوير البصري المرتبط ChemiDoc	بيو-راد	17001402	يستخدم لقياس كثافة الجل/البقع
فرن العمود	سونيشن جي إم بي إتش، ألمانيا	ES071/ES072	يحافظ على عمود النانو LC عند 50 ودرجة مئوية؛ C تعني الاحتفاظ المستمر
أنابيب مخروطية (15 مل)	فيشر ساينتيفك	352096
خرزات التحكم	مختبر كيوسيس	لا يوجد	تالدوني وآخرون (PMID:  21459002)
صبغة Coomassie G-250 (آمنة حيوية)	بيو-راد	1610786
أنابيب إبندورف الداكنة (1.5 مل)	يو إس إيه ساينتيفك	1415-2507
ديثيوثرايتول (DTT)	روش	10197777001	مثير
إيزي nLC 1000	ثيرمو فيشر العلمي	إيزي nLC 1000	نظام LC المستخدم مع Q Exactive HF
أقراص استخراج الطور الصلب من إمبور	شركة 3M	2215-C18 (أوكتادسيل)	يستخدم لتحضير StageTips لإزالة الملح من الببتيدات؛ مفعل بنسبة 100٪ ميثانول
مجموعة التلميض الكيميائي المعزز (ECL)	ثيرمو فيشر العلمي	32209
أنابيب إيبندورف (1.5 مل)	فيشر ساينتيفك	05-408-129
حمض الفورميك (FA) أوبتيما	فيشر ساينتيفك	A117-10X1AMP	درجة LC/MS
g:Profiler (e111_eg58_p18_f463989d)	مجموعة BIIT-تارتو وأومل؛ ليكول	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost	إثراء الممرات
الجلسرين	كاشف فيشر الحيوي	BP229-1	درجة علم الأحياء الجزيئي
الجلايسين	كاشف فيشر الحيوي	BP381-5	مسحوق البلورة
الجسم المضاد الثانوي المضاد لفيروس الماعز المضاد للفئران مع HRP (RRID: AB_2619742)	ساذرن بيوتك	1030-05	ثانوي للأجسام المضادة H90-10
الأجسام المضادة الثانوية المتقاربة مع HRP المضادة للأرانب (RRID: AB_2632593)	ساذرن بيوتك	4010-05	ثانوي لطراز HSP90&alpha؛ وأجسام مضادة HOP
الجسم المضاد الثانوي المرافق-HRP المضاد للفئران (RRID: AB_2716837)	ساذرن بيوتك	3030-05	ثانوي لجسم HSC70 المضاد
الهزاز المداري المسخن	إبندورف	ثيرموميكسر C (2231001127)
هضم بروتين هيلا ستاندرد-بيرس	ثيرمو فيشر العلمي	88329	يستخدم لتقييم مراقبة الجودة في LC-MS
الجسم المضاد للهوب (RRID: AB_10828378)	الإشارات الخلوية	5670	بالنسبة لمراقبة الجودة في PU-Beads
الأجسام المضادة HSC70 (RRID: AB_10617277)	إنزو	SPA-815	بالنسبة لمراقبة الجودة في PU-Beads
الجسم المضاد HSP90 (H90-10) (RRID: AB_854214)	ستريسمارك	SMC-107	بالنسبة لمراقبة الجودة في PU-Beads
الجسم المضاد ألفا HSP90 (RRID: AB_303423)	أبكام	AB2928	للتطبيع وفقا للقسم 1.2
خط الخلية البشرية: ASPC1 (RRID:CVCL_0152)	ATCC	CRL-1682	خط الخلية الضابط، منخفض الإبكشابيروم/مرتفع المراقب
سلالة الخلايا البشرية: MDA-MB-468 (RRID: CVCL_0419)	ATCC	HTB-132	خط الخلية الضابط، ارتفاع إبيكابيروم/مرتفع المراقب
ImageJ (v1.54p)	وين راسباند	https://imagej.net/ij/	الكثافة الذهنية
يودوأسيتاميد (IAA)	سيغما-ألدرتش	I1149-5G	سام
أنابيب الطرد المركزي الدقيق منخفضة البروتين	سارستيدت	72.706.600
بروتياز Lys-C	بروميغا	VA1170	درجة LC/MS
كلوريد المغنيسيوم	سيغما-ألدرتش	63068	درجة علم الأحياء الجزيئي
ماكس كوانت (الإصدار 2.1.1.0)	معهد ماكس بلانك للكيمياء الحيوية	https://www.maxquant.org/	سير عمل MaxDIA لتحديد الببتيدات/البروتينات والقياس الخالي من العلامات بناء على الشدة
ميثانول	فيشر كيميكال	A454-4	درجة HPLC، قابلة للاشتعال، سامة
قرص كوكتيل مثبط بروتياز صغير (كامل)	روش	4693124001
خلية النقل الكهربائي لنقطة الترانس الصغيرة	بيو-راد	1703930
خزان الرحلان الكهربائي الصغير	ثيرمو فيشر العلمي	A25977	يستخدم في جل نوفكس مسبقا الصب
خلية الرحلان الكهربائي الرأسي Mini-PROTEAN Tetra	بيو-راد	1658004	يستخدم في جل البروتين المسبق المصبوب من Mini-PROTEAN أو الجل المصبوب يدويا
ميني-بروتين  جل البروتين مسبقا TGX (4– 20%)	بيو-راد	4561094
نانودروب	أجيلينت	BioTek Synergy H1	يستخدم لتقدير تركيز الببتيدات قبل حقن LC-MS
نانو إلوت 2	بروكر	https://flextra.hu/images/keszulekek/daltonics/nanoelute-brosura_eng.pdf	يستخدم في سير عمل diaPASEF
مصدر Nanospray Flex	ثيرمو فيشر العلمي	ES071	بالنسبة لربط ESI بالنانو سبريش
هدف جديد PicoTip Emmitter/PicoFrit SELF/P	شركة نيو أوبجكتيف	PF360-75-10-N-5	معبأ بخليط C18 حتى طول 20 سم
غشاء النيتروسيلولوز	سايتيفا أمرشام	10600006
الحليب الجاف خالي الدسم	مختبر علمي	M0841
جل نوفيكس 8٪ Tris-Glycine مسبقا الصب	ثيرمو فيشر العلمي	XP00080BOX
NP-40	روش	11754599001
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)	جيبكو	10010023
قرص كوكتيل مثبط فوسفاتاز فوس ستوب	روش	4906837001
مجموعة اختبار بروتين بيرس BCA	ثيرمو فيشر العلمي	23225
الحاويات البلاستيكية	فيشر ساينتيفك	FB0875711A
روكر المنصة	كورنينج	6705
كلوريد البوتاسيوم	كاشف فيشر الحيوي	BP366-1	البلورات البيضاء
مزود الطاقة الشامل لباور باك	بيو-راد	1645070
معيار بروتين بريسيجن بلس للبروتين الملطخة	بيو-راد	1610375
خرز PU-beads	مختبر كيوسيس	لا يوجد	تالدوني وآخرون (PMID:  21459002)
مطياف الكتلة العالي HF التابع ل Q	ثيرمو فيشر العلمي	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/BR-64052-LC-MS-Q-Exactive-HF-Orbitrap-BR64052-EN.pdf	يستخدم في DIA-MS
ReproSil-Pur 120 C18-AQ، 3 وميكرو؛ m	شركة دكتور مايش GmbH، ألمانيا	R13.aq	وسط سيليكا لفصل الببتيدات؛ خليط من البودرة/الميثانول (1:3، v/v)
وحدة الدوران (دوار من طرف فوق الطرف)	بارنستيد  دولي	400110
خراطيش Sep-Pak C18 (100 ملغ)	شركة ووترز	WAT023590
كبريتات الصوديوم الدوديسيل (SDS)	كاشف فيشر الحيوي	BP166-500	درجة الرحلان الكهربائي
سونيكاتور	برانسون	2510
قارئ الميكروبليت متعدد الأوضاع من سبيكترا ماكس بارادايم	الأجهزة الجزيئية	نموذج سبيكترا ماكس
سبيكترونوت	السيرة الذاتية	https://biognosys.com/software/spectronaut/	سير عمل directDIA
مركز سبيد فاك	ثيرمو فيشر ساينتفيك	العبقري SPD111V
فراغ الشفط	كاردينال هيلث	CDL-65651-320
مطياف الكتلة TimsTOF HT	بروكر	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-ht.html	يستخدم لتحليل diaPASEF
حمض ثلاثي الفلوراستيك (TFA) أوبتيما	سيغما-ألدرتش	T6508-10AMP	درجة LC/MS (تآكل، قابل للاشتعال)
تريس	كاشف فيشر الحيوي	BP152-5	مسحوق بلوري؛ درجة علم الأحياء الجزيئي
تريس، الرقم الهيدروجيني 6.8 (1 متر)	تيكنوفا	T1068
تريس، درجة حموضة 7.5 (1 م)	كاشف فيشر الحيوي	BP1757-500	درجة علم الأحياء الجزيئي
مخزن محلول ملحي بتقنية Tris (20 ضعف TBS)	VWR، علوم الحياة	97064-338
جهاز تشغيل من مخزن جل Tris-Glycine-SDS (TGS 10x)	كاشف فيشر الحيوي	BP13414	الرحلان الكهربائي
تريبسن	بروميغا	V5111	درجة التسلسل
تريبسين جولد	بروميغا	V5280
20 سنة	كاشف فيشر الحيوي	BP337-100
يوريا	سيغما-ألدرتش	U0631-500G
دوار	فيشر ساينتيفك	02-215-414
الماء	فيشر ساينتيفك	W6-1	درجة LC/MS