نهج عملي لرسم الخرائط الوراثية محرض مصير : دليل مرئي لمارك وتعقب خلايا في فيفو

يتم إنشاء خرائط المصير عن طريق وسم وتتبع الخلايا في الجسم الحي (in vivo) لتحديد كيفية مساهمة الخلايا السليفة في تكوين هياكل وأنواع خلوية محددة في الأنسجة النامية والبالغة. ومن التطورات في هذا المفهوم رسم خرائط المصير الجيني القابل للاستحثاث أو GIFM، والذي يربط بين التعبير الجيني وسلوك الخلايا في الجسم الحي لإنشاء خرائط مصير تعتمد على السلالة الجينية. مرحباً، اسمي ديبورا إليسور من مختبر مارك سيرفيسز وقسم البيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية في جامعة براون.

سأقوم اليوم، برفقة زملائي أشلي براون، وليز نورمان، ونين هاغن، وستيف براون، بشرح إجراء لرسم خرائط المصير الجيني القابل للتحفيز. نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة مراحل نمو الدماغ المبكرة. كما يمكننا تطبيق هذه التقنية في دراسات تعطيل الجينات ونماذج الحيوانات للأمراض البشرية.

لنبدأ الآن في أجنة X cre, E-R-M-G-F-P. يُعد MGFP LAE أليل مراسل موجود في جميع الخلايا المتمثلة بأشكال بيضاوية رمادية X cre, er، حيث يمثل X العناصر التنظيمية للجينات. يكون التحكم في تعبير C ER مقيداً مكانياً بنطاق تعبير الجين X الموضح باللون الأزرق، ويتم عزل بروتين CRE ER في السيتوبلازم بواسطة HSP 90.

في حالة عدم وجود Tamoxifen، سيكون المراسل غير نشط. يؤدي إعطاء Tamoxifen إلى رسم خرائط مصير الخلايا في النطاق X لأن CER يتم تحريره من HSP 90 وينتقل إلى النواة ويزيل كاسيت الإيقاف من أليل المراسل. تضمن عملية إعادة التركيب الدائمة والوراثية أن تعبر الخلايا بشكل مستمر عن MG FP LA Z. يؤدي الجمع بين أليل المراسل CER وtamoxifen إلى وضع علامات؛ فعندما يتم وضع علامات أولية على مجموعة من الخلايا في منطقة دماغية بدائية من الجنين بناءً على التعبير الجيني، يتم تتبع هذه الخلايا ذات المصير المرسوم حتى بعد انطفاء التعبير الجيني الأولي المستخدم لتحفيز CER.

بهذه الطريقة، يمكن تحديد التوزيع النهائي والمصير النهائي لسلالة خلوية محددة وراثياً في البالغين. تبدأ هذه العملية بتحضير محلول ساق من tamoxifen بتركيز 20 mg/mL؛ حيث يتم إذابة 200 mg من tamoxifen في 10 mL من زيت الذرة المُدفأ مسبقاً في قارورة استنشاق زجاجية.

بعد ذلك، يتم تحضين المحلول عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين باستخدام جهاز Tator vortex. يجب حماية محلول Tamoxifen المخزون الذي تم تحضيره من الضوء عن طريق لف القارورة بورق القصدير، ويُخزن عند 4 درجات مئوية. يمكن استخدام المحلول المخزون لمدة تصل إلى شهر واحد.

بالنسبة لتجارب تخطيط المصير، قم بتكوين زوج للتزاوج يتكون من أنثى Swiss Webster من النوع البري وذكر يحمل كلاً من أليل CreER النوعي للجين وأليل مراسل. ولأغراض هذا العرض التوضيحي، سنستخدم ذكراً من نوع win to one CreER MG FP. افحص أنثى Swiss Webster كل صباح للتحقق من ظهور السدادة المهبلية.

حدّد صباح اليوم الذي شوهدت فيه السدادة المهبلية على أنه 0.5 يوم بعد الجماع، واحسب تاريخ إعطاء التاموكسيفين (Tamoxifen). بناءً على نقطة البداية هذه في هذه التجربة، سيتم إعطاء التاموكسيفين في اليوم الجنيني 8.5. باستخدام سرنجة سعة 1 مل مع إبرة تغذية حيوانية، اسحب 200 µL من محلول التاموكسيفين المخفف.

قم بتثبيت أنثى فأر Swiss Webster الحامل في الوقت المحدد بإحكام عن طريق الإمساك بقفا الرقبة والظهر لشل حركة الرأس، ثم اقلب الفأر بحيث يكون الجانب البطني متجهًا للأعلى. أمسك الذيل بين أصابعك الحرة للحفاظ على الجسم في خط مستقيم. بعد ذلك، ضع إبرة التغذية في زاوية الفم ووجه الإبرة برفق بشكل موازٍ لسقف الفم حتى تصل طرف إبرة التغذية تقريبًا إلى مستوى العين.

أمل الرأس للخلف برفق للوصول إلى المريء. وجّه الإبرة متجاوزةً لسان المزمار وإلى أسفل المريء باتجاه المعدة. احذر من الدخول إلى الرغامي.

بمجرد وصول إبرة التغذية إلى المعدة، يتم إعطاء التاموكسيفين ثم تُسحب الإبرة. بعد ذلك، تُعاد الأنثى إلى قفصها حتى موعد التشريح. وفي يوم التشريح، يتم استخراج أجنة في اليوم الجنيني E 12.5 من الأنثى الحامل (المحددة زمنياً) وفحصها للكشف عن علامة GFP.

في الجنين الموجب لـ GFP، نلاحظ أن العصبونات المشتقة من wind one تساهم في الدماغ المتوسط، والدماغ الخلفي، والنخاع الشوكي. يقوم مراسل MG FP بتمييز الإسقاطات المحورية، والتي يمكن رؤيتها أيضاً عند نقل الأجنة الموجبة لـ GFP عن طريق التركيب الكامل إلى طبق بتري يحتوي على PPS وتصويرها باستخدام إطار الصور. بعد تصوير الأجنة، استخدم الملقط لقطع قطعة صغيرة من الذيل من كل جنين وضع كل قطعة في أنبوب PCR. سيتم تحديد النمط الجيني للأنسجة باستخدام PCR لكل من الأليلين لتأكيد النتائج التي تمت رؤيتها عبر تحليل التركيب الكامل.

تمكننا الإجراءات التالية من تحليل كيفية استيطان الخلايا المميَّزة المشتقة من المناطق الجنينية في دماغ البالغ قبل البدء في عملية ثقب الجمجمة. يتم التأكد عن طريق قرص إصبع القدم من أن الفأر تحت تأثير التخدير الكامل. بعد التخدير باستخدام nembutal، يتم إجراء شقوق للوصول إلى القلب عبر القفص الصدري.

بعد ذلك، ضع إبرة الفراشة في قمة القلب أو في البطين الأيسر وثبتها باستخدام مشبك C. أنشئ موقعاً لخروج السوائل في الأذين الأيمن باستخدام المقص، ثم قم بالتروية بـ 10 إلى 15 milliliters من المحلول الملحي المثلج حتى يصبح السائل صافياً، يليه 20 إلى 25 milliliters من 4%paraform aldehyde.

عند اكتمال عملية التروية داخل القلب، يتم إزالة الرأس باستخدام المقص عن طريق القطع عبر العمود الفقري فوق الكتفين مباشرةً. مرر المشرط على طول الخط الناصف الظهري للرأس، من المنخار باتجاه القفا، للقطع عبر فروة الرأس وكشف الجمجمة. وباستخدام المشرط، قم بكشط أي أنسجة أو عضلات زائدة من طول جانبي وخلفية القحف.

باستخدام الملقط، قم بثقب الجمجمة عند الخط الناصف، إلى الأمام مباشرة من البصيلات الشمية، وأحدث ثقباً صغيراً لاستيعاب طرفي مقص دقيق. أدخل المقص الدقيق في هذا الثقب لإجراء شقين ثنائيين من الخط الناصف باتجاه طول البصيلات الشمية. سيؤدي هذا القطع إلى كسر الجمجمة عند نقطة التقاء العظم الأنفي والعظم الجبهي، مما يوفر وصولاً جيداً للمقص.

اقطع على طول الغرز السهمية في الجمجمة، مع التأكد من إمالة أطراف المقص بعيداً عن الدماغ لتجنب إتلاف الأنسجة الأساسية. بعد ذلك، أمسك الجمجمة برفق باستخدام الملقط وانزع العظم على طول الشق الإنسي لكشف الدماغ. قد تتفتت الجمجمة إلى قطع صغيرة أو تنفصل في أجزاء أكبر.

استمر في استخدام الملقط لإزالة جميع العظام الجبهية الجدارية، وبين الجدارية، والقذالية. حرر العظام حول الحجاج (para oculi) الموجودة على طول الحواف الجانبية للدماغ عند مستوى المخيخ عن طريق قرص العظام الكروية على كل جانب بلطف. استخدم المقص لقص الجزء الظهري من العظم الذي يحيط بجذع الدماغ بعناية.

أدخل أحد طرفي المقص أسفل الحافة الظهرية للعظم مباشرةً، بدءاً من مكان قطع الحبل الشوكي والقص باتجاه المخيخ، وذلك لتحرير جذع الدماغ والمخيخ. ثم استخدم الملقط لإزالة العظم المتبقي من حول جذع الدماغ.

اسحب العظام برفق، ثم اقلب الرأس بحيث يكون الجانب الظهري للأسفل، واستخدم الملقط لقطع الأعصاب القحفية وتحرير الدماغ من الجمجمة. ضع الدماغ في طبق بتري يحتوي على الثلج. Cold PPS قم بتقييم دماغ البالغ للتحقق من وسم GFP، باستخدام مجهر تشريحي فلوري والتقط صورة باستخدام إطار الصور.

في هذا المثال، يتم تمييز الدماغ المتوسط بواسطة GFP، وبالإضافة إلى استخدامه في تحليل السلالة أثناء التكوين الجنيني وفي المرحلة البالغة، يمكن دمج GIFM مع تطبيقات أخرى شائعة الاستخدام في علم الأحياء التنموي مثل التشريح المجهري وتجارب الاستزراع النسيجي. على سبيل المثال، يمثل الدماغ المتوسط البطني منطقة الخلايا السلفية للعصبونات الدوبامينية النامية التي تعبر عن الجين wind one. وبالتالي، فإن عزل الدماغ المتوسط البطني عن طريق التشريح المجهري يسمح بإنشاء بيئة في المختبر لمزيد من الاستقصاء حول تطوره.

يمثل هذا مجرد مثال واحد على استخدام تقنية GIFM لعزل منطقة سلفية ذات أهمية محددة بناءً على التاريخ الجيني. لبدء هذا الإجراء، انقل الأجنة الموجبة لـ GFP التي تم تحديدها مسبقاً إلى محلول PBS معقم وبارد جداً في طبق زراعة خلايا باستخدام مقص دقيق. قم بإزالة جزء الرأس من الجنين عن طريق القطع عرضياً.

بعد ذلك، قم بإزالة الجزء المنقاري من الرأس عن طريق إجراء قطع إكليلي عبر الرأس. سيؤدي ذلك إلى كشف بنية تشبه الأنبوب، حيث يشكل البطين الرابع عبر الحويصلة المتوسطة قناة بين الأنسجة الظهرية والبطنية. أدخل طرفي المقص بعناية في البطين الرابع وقص على طول الخط الناصف الظهري باتجاه المنقاري لفتح الأنبوب بالكامل، مما يؤدي إلى تحضير عينة على شكل كتاب مفتوح.

سيتم الآن كشف الدماغ المتوسط البطني إنسياً. وبينما سيستقر النصفان الظهريان للدماغ المتوسط جانبياً، قد يكون من الضروري إزالة أي أنسجة غير عصبية متبقية أسفل الدماغ المتوسط البطني. ولكي تستقر العينة المستأصلة بشكل مسطح، يجب أن تشبه الآن الفراشة، حيث يمثل الدماغ المتوسط الظهري الجناحين، بينما يمثل rhombomere 1 الذيل.

لمزيد من عزل الدماغ المتوسط البطني (ventral mesencephalon) لتحليل fax أو تجارب زراعة الخلايا، قم بإزالة الجوانب الجانبية للنسيج. سنعرض الآن بعض النتائج التمثيلية لـ GIFM. في هذه التجربة، يتم تصوير الخلايا التي تعبر عن WINT one والموسومة في المرحلة E 8.5 لتحديد كيفية مساهمة الخلايا المباشرة لـ wint one في البنى العصبية عبر مراحل التطور.

على سبيل المثال، تُظهر أجنة Wnt1-CreER MG FP في المرحلة E 12.5 فلورة GFP بشكل أساسي في الدماغ المتوسط، والجزء الخلفي من الدماغ الخلفي، والنخاع الشوكي؛ حيث تظهر عند التكبير العالي بروزات عصبية دقيقة تقوم بالتصويب. كما يمكن تصور الخلايا المحددة في جدار جسم الدماغ المتوسط والأطراف والمنطقة القحفية الوجهية وتحليلها على المستوى الخلوي عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية. وكما هو موضح في هذا المقطع البصري بسمك 1 µm لجنين في المرحلة E 12.5 تم تحديده عن طريق إعطاء Tamoxifen في المرحلة E 8.5، فإن وسم الأجسام المضادة لـ nuclear beta galacto باللون الأحمر ووسم الأجسام المضادة لـ GFP باللون الأخضر يشيران إلى الخلايا التي تم رسم خرائط مصيرها والموضحة في الجزء البطني من الدماغ المتوسط.

هنا، تظهر الخلايا المدمجة إيجابية مزدوجة بسبب طبيعة مراسل MGFP الشرطي في الدماغ البالغ. قد تؤدي كثافة الأنسجة الناضجة إلى حجب فلورة GFP المنبعثة من بنيات الدماغ الداخلية. ولذلك، يكشف المجهر الفلوري للتحضيرات الكاملة عن فلورة GFP خافتة فقط في الجزء العلوي من CUI في البالغ عند تقييم الفوز.

يُظهر تتبع سلالة واحدة عند المرحلة E 8.5 في مقاطع من البالغين باستخدام مجهر ذو تكبير منخفض أن سلالة WIN one تعطي منشأً لبنى الدماغ المتوسط، بما في ذلك الأكيمة العلوية والسفلية. وفي هذه الصورة ذات التكبير الأعلى المأخوذة من الجزء البطني للدماغ المتوسط بالقرب من العصبونات الدوبامينية، يمكن رؤية خلايا موجبة لـ nuclear beta cal وضفيرة محورية غنية موجبة لـ GFP؛ وفي المقابل، يؤدي التتبع عند المرحلة E 9.5 إلى وسم GFP كثيف يمكن ملاحظته بسهولة في الأكيمة السفلية للدماغ المتوسط عبر الفلورة للمستحضرات الكاملة. وتتركز سلالة WINT one التي تم تتبعها عند المرحلة E 9.5 في المقاطع البالغة ضمن الأكيمة السفلية، كما يتضح من الفحص المجهري ذو التكبير المنخفض.

في هذه الصورة ذات التكبير الأعلى المأخوذة من الدماغ المتوسط البطني للخلايا العصبية الدوبامينية، يمكن رؤية الخلايا الموجبة لـ nuclear beta gel وضفيرة محورية غنية وموجبة لـ GFP. وبذلك، بينما تتقيد العصبونات المشتقة من win one المحددة في E 8.5 مقابل E 9.5 تدريجياً من المساهمة في الدماغ المتوسط الظهري، فإن سلالة WIN one تستمر في المساهمة في الدماغ المتوسط البطني.

لقد عرضنا لكم للتو إجراء رسم خرائط المصير الجيني القابل للاستحثاث لتمييز وتتبع سلالات الخلايا في الجسم الحي. يتيح لنا ذلك تمييز الخلايا بناءً على سلالتها الجينية وتتبعها بمرور الوقت حتى بعد انطفاء التعبير الجيني. ومن خلال إعطاء tamoxifen في عمر ثمانية أشهر ونصف، أظهرنا أن نطاق wit one يساهم في تطوير الدماغ المتوسط، بالإضافة إلى كامل الدماغ المتوسط في البالغين.

وفي المقابل، فإن إعطاء التاموكسيفين عند عمر تسعة ونصف أيام عندما يصبح نطاق wit one محدوداً، يؤدي إلى مساهمة أكثر محدودية في الدماغ المتوسط النامي أثناء التطور الجنيني، وهو ما يستمر حتى مرحلة البلوغ. وعند القيام بهذا الإجراء، من المهم مراعاة أن النظام يحدد الخلايا بشكل موزاييكي، وبالتالي قد لا يتم وسم كل خلية في بنية معينة. ويرجع ذلك على الأرجح إلى خط CRE er أو أليل المراسل الشرطي المستخدم.

من المهم ملاحظة أنه على الرغم من أن وسم الخلايا يكون موزائيكياً، إلا أن نمط وتوزيع الخلايا الموُسمة يكون قابلاً للتكرار بدرجة عالية. لقد وجدنا أن إعطاء التاموكسيفين عن طريق التغذية القسرية الفموية يعد أفضل مقارنةً بالحقن داخل الصفاق، لأنه يقلل من الالتهاب في الحيز الصفاقي بالإضافة إلى تقليل الضرر الميكانيكي الذي قد يلحق بالأجنة. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.