نهج عملي لرسم الخرائط الوراثية محرض مصير : دليل مرئي لمارك وتعقب خلايا في فيفو

يتم إنشاء خرائط المصير عن طريق وضع علامات على الخلايا وتتبعها في الجسم الحي لتحديد كيفية مساهمة الأسلاف في هياكل وأنواع خلايا معينة في الأنسجة النامية والبالغة. والتقدم في هذا المفهوم هو رسم خرائط المصير المحفز الجيني أو GIFM الذي يربط التعبير الجيني والكبريتات وسلوكيات الخلايا في الجسم الحي لإنشاء خرائط مصير بناء على النسب الجيني. مرحبا ، اسمي ديبورا إليسور من مختبر مارك سيرفيسز وقسم البيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية في جامعة براون.

اليوم سأعرض أنا وزملائي آشلي براون وليز نورمان نين هاغن وستيف براون إجراء لرسم خرائط المصير المحفز الوراثي. نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة نمو الدماغ المبكر. يمكننا أيضا تطبيق هذه التقنية على دراسات تعطيل الجينات والنماذج الحيوانية للأمراض البشرية.

لذلك دعونا نبدأ في أجنة X cre ، E-R-M-G-F-P. MGFP LAE هو أليل مراسل موجود في جميع الخلايا ممثلة بأشكال بيضاوية رمادية X cre ، er ، حيث يمثل X العناصر التنظيمية الجينية. يقتصر التحكم في تعبير C ER مكانيا على مجال تعبير الجين X الموضح باللون الأزرق ويتم عزل بروتين CRE ER في السيتوبلازم بواسطة HSP 90.

في حالة عدم وجود تاموكسيفين ، سيكون المراسل متوقفا. يؤدي إعطاء تاموكسيفين إلى خلايا معينة للمصير في المجال X لأن CER يتم إطلاقه من HSP 90 ينتقل إلى النواة ويزيل كاسيت التوقف من أليل المراسل. يضمن إعادة التركيب الدائم والوراثي أن الخلايا تعبر بشكل أساسي عن MG FP LA Z.ينتج عن الجمع بين أليل المراسل CER و tamoxifen وضع علامات عندما يتم تمييز مجموعة الخلايا في البداية في منطقة دماغية بدائية من الجنين بناء على التعبير الجيني ، يتم تتبع هذه الخلايا المعينة للمصير حتى بعد إطفاء التعبير الجيني الأولي المستخدم لدفع CER.

بهذه الطريقة. يمكن تحديد التوزيع النهائي والمصير النهائي لسلالة خلية محددة وراثيا في البالغين. يبدأ هذا الإجراء بتحضير محلول ساق 20 ملليغرام لكل مليلتر من تاموكسيفين ، ويذوب 200 ملليغرام من تاموكسيفين في 10 ملليلتر من زيت الذرة قبل الحرب في قارورة استنشاق زجاجية.

ثم احتضان المحلول عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على دوامة تاتور. يحمي المحلول بشكل متقطع محلول مخزون تاموكسيفين المحضر من الضوء عن طريق لف القارورة بورق الألمنيوم وتخزينها عند أربع درجات مئوية. يمكن استخدام المخزون لمدة تصل إلى شهر واحد.

لتجارب رسم خرائط المصير ، قم بإنشاء زوج تكاثر يتكون من أنثى ويبستر سويسرية من النوع البري وذكر يحمل أليل CreER خاص بالجين وأليل مراسل. لغرض هذا العرض التوضيحي ، سنستخدم الفوز لذكر CreER MG FP واحد. افحص أنثى ويبستر السويسرية كل صباح بحثا عن ظهور سدادة مهبلية.

تحديد صباح يوم السدادة المهبلية كما هو موضح على أنها 0.5 يوم بعد الكوتوس وحساب تاريخ إعطاء تاموكسيفين. بناء على نقطة البداية هذه في هذه التجربة ، سيتم إعطاء تاموكسيفين في اليوم الجنيني 8.5. باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد بإبرة تغذية حيوانية ، ارسم 200 ميكرولتر من محلول ساق تاموكسيفين.

كبح جماح أنثى ويبستر السويسرية الحامل بقوة عن طريق الإمساك بقيلولة الرقبة والظهر لشل حركة الرأس وقلب الماوس بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى. أمسك الذيل بين أصابعك الحرة للحفاظ على الجسم في خط مستقيم. بعد ذلك ، ضع إبرة التغذية في زاوية الفم وقم بتوجيه الإبرة برفق بالتوازي مع سقف الفم حتى يصبح طرف إبرة التغذية في موضع العين تقريبا.

قم بإمالة الرأس برفق للخلف للوصول إلى المريء. قم بتوجيه الإبرة عبر لسان المزمار وأسفل المريء باتجاه المعدة. احرص على عدم دخول القصبة الهوائية.

بمجرد أن تكون إبرة التغذية في المعدة ، قم بإدارة تاموكسيفين وإزالة الإبرة. ثم أعد الأنثى إلى قفص منزلها حتى تاريخ التشريح. في تاريخ التشريح ، يتم تشريح E 12.5 أجنة من الأنثى الحامل في الوقت المناسب مجانا ثم يتم تقييمها لعلامات GFP.

في الجنين الإيجابي GFP ، نلاحظ أن الخلايا العصبية المشتقة من الرياح تساهم في الدماغ المتوسط والدماغ الخلفي المدلل والحبل الشوكي. يقوم مراسل MG FP بتسمية الإسقاطات المحورية ، والتي يمكن رؤيتها أيضا تنقل الأجنة الإيجابية ل GFP عن طريق التركيب المنزلي إلى طبق بتري يحتوي على PPS وتصويرها باستخدام إطار الصورة بعد تصوير الأجنة ، استخدم الملقط لقرص قطعة صغيرة من الذيل من كل جنين ووضع كل قطعة في أنبوب PCR. سيتم تنميط الأنسجة وراثيا باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لكلا الأليلين لتأكيد النتائج التي تظهر من خلال تحليل التركيب الكامل.

تمكننا الإجراءات التالية من تحليل كيفية ملء الخلايا الملحوظة المشتقة من المناطق الجنينية للدماغ البالغ قبل بدء حج القحف. تم التأكيد من خلال قرصة إصبع القدم أن الفأر غير مألوف تماما. يقوم ال ised مع nembutal بإجراء شقوق للوصول إلى القلب من خلال القفص الصدري.

بعد ذلك ، ضع إبرة فراشة في قمة أو البطين الأيسر للقلب وثبتها بمشبك C. قم بإنشاء موقع خروج السوائل في الأذين الأيمن بالمقص ، ثم قم بتسخينه ب 10 إلى 15 مل من محلول ملحي مثلج حتى يصبح السائل صافيا. متبوعا ب 20 إلى 25 مل من 4٪ ألدهيد بارافورم.

عند اكتمال الوفرة داخل القلب ، قم بإزالة الرأس بالمقص عن طريق قطع العمود الفقري فوق الكتفين مباشرة. مرر مشرطا على طول خط الوسط الظهري للرأس ، منقاري دي كوتل لقطع فروة الرأس وفضح الجمجمة S. باستخدام المشرط ، اكشط أي أنسجة أو عضلات زائدة على طول جانب وخلف الجمجمة.

باستخدام الملقط ، قم بثقب الجمجمة عند خط الوسط ، فقط منقاري إلى المصابيح الشمية وقم بإنشاء ثقب صغير لاستيعاب أطراف المقص الناعم. أدخل المقص الناعم في هذه الفتحة ولعمل شقين ثنائيين من خط الوسط بعد طول المصابيح الشمية. سيؤدي هذا القطع إلى كسر الجمجمة عند تقاطع عظم الأنف والعظم الأمامي ويوفر وصولا جيدا للمقص.

قم بقص الغرز السهمية في الجمجمة ، مع التأكد من إبقاء أطراف المقص بزاوية بعيدا عن الدماغ لتجنب إتلاف الأنسجة الأساسية. بعد ذلك ، أمسك الجمجمة برفق بالملقط وقشر العظم على طول الشق الإنسي لكشف الدماغ. قد تتشقق الجمجمة إلى قطع صغيرة أو تنفصل إلى أقسام أكبر.

استمر في استخدام الملقط لإزالة جميع العظام الجدارية الجبهية وبين الجدارية والقذالية. حرر نظير العين الموجود على طول الحواف الجانبية للدماغ على مستوى المخيخ عن طريق الضغط برفق على العظام الكروية على كل جانب. استخدم المقص لقطع الجزء الظهري من العظم الذي يحيط بجذع الدماغ بعناية.

أدخل جانبا واحدا من المقص أسفل الحافة الظهرية للعظم مباشرة ، بدءا من مكان قطع الحبل الشوكي وقطعه باتجاه المخيخ. لتحرير جذع الدماغ والمخيخ. قم بإزالة العظم المتبقي من حول جذع الدماغ باستخدام الملقط.

اسحب العظام برفق ، وأدر الجانب الظهري للرأس لأسفل واستخدم الملقط لقطع الأعصاب القحفية وتحرير الدماغ من الجمجمة. ضع الدماغ في طبق بتري من الثلج. PPS البارد قم بتقييم دماغ البالغين لوضع علامات GFP ، باستخدام نطاق تشريح الفلورسنت والصورة باستخدام إطار الصورة.

في هذا المثال ، يتم تمييز الدماغ المتوسط بواسطة GFP بالإضافة إلى استخدامه لتحليل النسب أثناء التطور الجنيني وفي البالغين يمكن دمج GIFM مع تطبيقات أخرى شائعة الاستخدام في علم الأحياء التنموي مثل التشريح الدقيق وتجارب زرع الأنسجة. على سبيل المثال ، الدماغ المتوسط البطني هو المنطقة السلفية لتطوير الخلايا العصبية الدوبامين التي تعبر عن الجين الرياح. وبالتالي فإن عزل الدماغ المتوسط البطني عن طريق التشريح الدقيق يسمح بإنشاء إعداد في المختبر لمزيد من التحقيق في تطوره.

يمثل هذا مثالا واحدا فقط على استخدام GIFM لعزل منطقة اهتمام سلف يحددها التاريخ الجيني. لبدء هذا الإجراء ، انقل الأجنة الإيجابية ل GFP المحددة مسبقا إلى PBS معقم مثلج في طبق زراعة الخلايا باستخدام مقص ناعم. قم بإزالة جزء الرأس من الجنين عن طريق القطع المدلل بشكل عرضي إلى رومي.

بعد ذلك ، قم بإزالة الجزء المنقاري من الرأس بقطع إكليلي من خلال الرأس. سيؤدي ذلك إلى كشف بنية تشبه الأنبوب حيث يشكل البطين الرابع عبر الحويصلة المتوسطة الرأس قناة بين الأنسجة الظهرية والبطنية. أدخل أطراف المقص بعناية في البطين الرابع وقص على طول خط الوسط الظهري المدلل لفتح الأنبوب المنقاري بالكامل ، مما يؤدي إلى إعداد كتاب مفتوح.

سيتم الآن تعرض الدماغ الدماغي البطني وسطيا. في حين أن النصفين الظهريين من الدماغ المتوسط سيقيمان بشكل جانبي ، فقد يكون من الضروري إزالة أي أنسجة غير عصبية متبقية تحت الدماغ المتوسط البطني. من أجل أن يكذب explan بشكل مسطح ، يجب أن يشبه explan الآن فراشة يمثل فيها الدماغ المتوسط الظهري الأجنحة والجلطة مجرد ذيل واحد.

لعزل الدماغ المتوسط البطني بشكل أكبر لتحليل الفاكس أو تجارب زراعة الخلايا ، قم بإزالة الجوانب الجانبية للأنسجة. الآن سنعرض بعض النتائج التمثيلية ل GIFM. في هذه التجربة ، يتم تصور الخلايا المعبرة عن WINT التي تم وضع علامة عليها ب E 8.5 لتحديد كيف تساهم الخلايا المباشرة في الهياكل العصبية عبر التطور.

على سبيل المثال ، تظهر أجنة C EER MG FP في E 12.5 ، مضان GFP بشكل أساسي في الدماغ الخلفي الخلفي في الدماغ الأوسط والحبل الشوكي عند التكبير العالي ، وينظر إلى الإسقاطات العصبية الدقيقة العصبية. يمكن أيضا تصور الخلايا المميزة لجدار الجسم المتوسط ومنطقة الوجه القحفية وتحليلها على المستوى الخلوي عن طريق الكيمياء المناعية. كما هو موضح في هذا القسم البصري بسمك ميكرومتر واحد من جنين E 12.5 الذي تم تمييزه بإعطاء تاموكسيفين في E 8.5 ، وسم الأجسام المضادة بيتا جالاكتو النووي باللون الأحمر وعلامة الأجسام المضادة GFP باللون الأخضر يشير إلى الخلايا المعينة للمصير الموضحة في الدماغ المتوسط البطني.

هنا قمنا بدمج الخلايا موجبة مزدوجة بسبب طبيعة مراسل MGFP الشرطي في دماغ البالغين. قد تحجب كثافة الأنسجة الناضجة مضان GFP المنبثق من هياكل الدماغ الداخلية. لذلك ، يكشف الفحص المجهري الفلوري الكامل عن مضان GFP باهت فقط في CUI الفائق للبالغين الذين يقيمون الفوز.

تكشف سلالة واحدة تم تمييزها في E 8.5 في أقسام البالغين ذات الفحص المجهري التكبير المنخفض أن سلالة WIN واحدة تؤدي إلى هياكل منتصف الدماغ ، بما في ذلك cui العلوي والأدنى. في صورة التكبير الأعلى هذه المأخوذة من الدماغ الأوسط البطني بالقرب من الخلايا العصبية الدوبامينية ، يمكن رؤية الخلايا الإيجابية بيتا كال النووية والضفيرة المحورية الإيجابية الغنية ب GFP في وضع علامات على النقيض من E 9.5 ينتج عنه وضع علامات GFP كبيرة يتم ملاحظتها بسهولة في القولون السفلي من الدماغ الأوسط عن طريق مضان الجبل بالكامل. يتركز سلالة WINT الواحدة المميزة في E 9.5 على الأقسام البالغة في kaulu السفلي كما يظهر في الفحص المجهري منخفض التكبير.

في هذه الصورة التكبير الأعلى المأخوذة من الدماغ المتوسط البطني في الخلايا العصبية الدوبامينية ، يمكن رؤية الخلايا الإيجابية لهلام بيتا النووية والضفيرة المحورية الإيجابية الغنية ب GFP. وبالتالي ، في حين أن الفوز ، فإن الخلايا العصبية المشتقة التي تم تمييزها على E 8.5 مقابل E 9.5 مقيدة تدريجيا من المساهمة في الدماغ المتوسط الظهري. يستمر سلالة WIN one في المساهمة في الدماغ المتوسط البطني.

لقد أظهرنا لك للتو إجراء رسم خرائط المصير المحفز الجيني لتحديد وتتبع سلالات الخلايا في الجسم الحي. هذا يسمح لنا بتمييز الخلايا بناء على نسبها الجيني وتتبعها بمرور الوقت حتى بعد إطفاء التعبير الجيني. مع إعطاء تاموكسيفين في الثامنة والنصف ، أظهرنا أن مجال الذكاء الواحد يساهم في تطوير الدماغ المتوسط بالإضافة إلى الدماغ المتوسط بأكمله لدى البالغين.

في المقابل ، فإن إعطاء تاموكسيفين في تسعة ونصف عندما يصبح المجال الواحد مقيدا ، يؤدي إلى مساهمة أكثر تقييدا في الدماغ المتوسط النامي أثناء التطور الجنيني ، والذي يستمر في مرحلة البالغة. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم مراعاة أن النظام يحدد الخلايا ، بشكل فسيفسائي ، وبالتالي لا يمكن تسمية كل خلية في بنية معينة. من المحتمل أن يكون هذا بسبب خط CRE er أو أليل المراسل الشرطي الذي يتم استخدامه.

الأهم من ذلك ، على الرغم من أن وضع العلامات على الخلايا عبارة عن فسيفساء ، إلا أن نمط وتوزيع الخلايا المرنة قابل للتكرار بدرجة كبيرة. لقد وجدنا أن إعطاء تاموكسيفين عن طريق التزقيم عن طريق الفم مفيد مقارنة بالتسليم عن طريق الحقن بين الصفاق لأنه يقلل من الالتهاب في الفضاء بين الصفاق وكذلك الضرر الميكانيكي للأجنة. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.