نهج عكس الوراثية لاختبار التكرار وظيفية خلال مرحلة التطور الجنيني

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد ما إذا كان هناك جينان زائدان عن الحاجة وظيفيا لتحديد سلالة خلية محددة. يتم تحقيق ذلك من خلال تحديد النمط الظاهري لفقدان الوظيفة لكل جين فردي باستخدام مورفو جيني خاص يتم حقنه في أجنة أسماك الزرد النامية. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تطوير اختبار لتحديد مواصفات نسب الخلية أو تمايزها.

على سبيل المثال ، استخدام سلالة أسماك المراسل ، كما سنوضح هنا. تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في الجمع بين اثنين من FENOs لاستهداف فقدان الوظيفة لكلا الجينين في وقت واحد. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي تقييم النمط الظاهري الناجم عن ضربة قاضية مزدوجة.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر فقدان أو اكتساب الوظيفة لخلايا سلالة معينة من خلال فحص مراسل النسب أو تحليل التعبير عن علامة محددة للنسب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الجمع بين الضربات القاضية في نموذج الفأر ، هي أنه يمكن استهداف جينين أو حتى ثلاثة جينات في نموذج الأسماك ببساطة عن طريق الجمع بين الأشكال التي تم التحقق من صحتها في تجربة واحدة. يمكن حقن أكثر من 100 جنين وتقييم الأنماط الظاهرية على مدار عدة أيام.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية. في علم الأحياء التنموي مثل تحديد مسارات النسخ التي تتحكم في مصير الخلية ، غالبا ما يتم تمثيل المسارات التنظيمية الرئيسية بعائلات صغيرة من الجينات ذات الصلة الزائدة عن الحاجة وظيفيا. لذلك فإن دورهم غير واضح من دراسات خروج المغلوب للفئران بسبب التعويض من الجينات الشقيقة.

على الرغم من أن هذا النموذج يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة للتطور الجنيني لأسماك الزرد ، إلا أنه يمكن تطبيق النتائج على أنظمة أخرى مثل الفأر ، نظرا لأن نفس البرامج الجينية عادة ما تكون محفوظة جيدا طوال التطور. تحضير لوحات الحقن المجهري قبل حقن الأجنة. صب ما يقرب من 12 مل من 2٪ agros في مياه النظام ، وهي مياه نظيفة تؤخذ مباشرة من نظام حوض الأسماك في الغطاء المقلوب لطبق بتري 100 ملم.

ضع شريحتين مجهريين بزوايا 45 درجة تقريبا في جانبي الغطاء. عندما تصلب agros ، اسحب الشرائح برفق بعيدا عن الغطاء ، مما يخلق أحواض حيث ستستريح الأجنة أثناء الحقن ، ولا يتم الاحتفاظ بأي سيقان في درجة حرارة الغرفة بتركيز واحد مليمولار والماء المقطر المقطر المقطر قبل الحقن. احتضان مخزون المورفوس عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق للتأكد من أنها في المحلول تماما.

دع المرق يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. يجب التحقق من صحة كل مورفو مصمم حديثا تجريبيا للنشاط وتحمل الجنين. في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، ابدأ بتخفيف تسلسلي واحد أو اثنين من مورفو المخزون في الماء المقطر منزوع الأيونات مما ينتج عنه تركيزات عمل تبلغ ملليمولار واحد 0.5 ملليمولار 0.25 ملليمولار و 0.125 ملليمولار.

تحت نطاق التشريح ، استخدم الشفط للتحميل الأمامي لإبرة حقن معايرة تم توصيلها بمناور الصغير ووضعها بشكل صحيح. قم بتحميل الإبرة بحوالي ميكرولتر واحد من محلول مورفو الأقل تركيزا. استخدم ماصة نقل لنقل أجنة خلية واحدة مخصبة إلى أحواض لوحة الحقن المجهر.

استخدم الماصة لإزالة الماء الزائد من الصفيحة حتى تسقط الأجنة في قاع الحوض الصغير. ضع لوحة الحقن تحت المجهر ، وانزل الإبرة من خلال الكوريون إلى صفار البيض. حقن كل جنين قبل إزالة الإبرة وإعادة وضع لوحة الحقن للوصول إلى الجنين التالي.

عند تعلم الحقن ، قد يكون من المفيد استخدام صبغة حيوية لتصور الحقن في الخلية كما هو موضح هنا ، ونقل الأجنة مرة أخرى إلى طبق بتري 100 ملم مع نظام الزراعة المائية عند 28.5 درجة مئوية. طرد أي محلول مورفو متبقي من الإبرة ، واملأه بمورفو ثاني أعلى تركيز لحقن الدفعة التالية من الأجنة في مرحلة مناسبة من التطور. افحص الأجنة بحثا عن الأنماط الظاهرية عند كل تركيز مورفو محقون.

الجرعة العتبة لكل مورفو هي أدنى جرعة يوجد فيها نمط ظاهري موثوق به محدد. قد تكون الجولات المتعددة من المعايرة بالتحليل الحجمي ضرورية لتحديد عتبة غير دقيقة. للبحث عن تفاعل جيني بين جينين متميزين.

قم بإعداد مزيج من مورفو محل اهتمام كل منهما بتركيز العتبة الخاص به. من المهم أن تضع في اعتبارك أن الأجنة قد لا تتسامح مع أكثر من 20 نانوغراما من إجمالي مورفو لكل حقنة. حقن الأجنة بنفس الطريقة كما كان من قبل.

حافظ على ثبات أحجام الحقن بين المجموعات التجريبية والضابطة ، والتي يجب أن تشمل مجموعات محقونة مع كل مورفو بمفرده تحت مجهر التشريح. راقب الأجنة المحقونة مباشرة بعد الحقن وعدة مرات على مدار اليوم، واستخدم ماصة النقل لإزالة أي أجنة ميتة أو تحتضر. نظرا لأن هذه يمكن أن تضر بصلاحية المورفين المتبقية باستخدام ماصة النقل ، تتحرك الأجنة المخدرة أو القتل الرحيم في أي وقت.

أشر إلى شريحة الاكتئاب للمراقبة. للتصوير الفوتوغرافي. استخدم ملقطا حادا لإزالة الكوريون إذا لزم الأمر.

تثبيت الجنين في قطرة من 3٪ أجنة فحص ميثيل السليلوز للحصول على نمط ظاهري مميز ، فريد من نوعه لمزيج الأشكال بدلا من الاختراق الأكبر للنمط الظاهري للمورفينات المفردة. فيما يلي العديد من الأجنة البرية عند حقنها بالمورفوس عند العتبة. بالنسبة إلى غاتا خمسة ، فإن النمط الظاهري النموذجي هو القلب المشقوق أو قلبين ، لأن الأسلاف فشلوا في الاندماج عند خط الوسط.

لاحظ خلايا عضلة القلب الإيجابية GFP المشار إليها بالأسهم. يتضمن النمط الظاهري لستة مورفينات قلوبا مشوهة تفشل في التكرار بشكل صحيح. تطور هذه الأجنة أيضا خلايا عضلة القلب الإيجابية GFP.

ومع ذلك ، فإن الأجنة التي تم حقنها بمزيج من كل من gata five و gata six morphos الموضحة هنا. يعرض الخسارة الكلية لتطور خلايا عضلة القلب مما يشير إلى أنه يجب التعبير عن إما جاتا خمسة أو غاتا ستة حتى تتطور خلايا عضلة القلب. الجينان زائدان عن الحاجة وظيفيا لمواصفات خلايا عضلة القلب.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أولا التحقق من صحة الأشكال الخاصة بك بشكل كامل والتأكد قدر الإمكان من أنها تمثل ضربة قاضية حقيقية لهدف الجين الفردي باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل الجمع بين الأليلات الفارغة الشرطية للفأر لإظهار أن نفس الجينات تعمل. وبالمثل في الثدييات.

بعد مشاهدة الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد ما إذا كان هناك جينان زائدان عن الحاجة وظيفيا أثناء التطور الجنيني.