الدراسات هيكل الوظائف في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس عن طريق بوساطة Recombinase-كاسيت تبادل

الهدف العام من طريقة الهيكل والوظيفة هذه هو تشريح دور مجالات البروتين المختلفة ، أو الطفرات ذات الصلة بالأمراض ، على المستوى الجزيئي ، في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر الساذجة أو المتمايزة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الكشف عن كيف يمكن أن تساهم المخلفات أو المجالات المختلفة للبروتين في وظيفته في سياق خلوي معين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح باستهداف فعال للغاية لتركيبات الإنقاذ لجينوم الخلايا الجذعية الجنينية ، أو الخلايا الجذعية الجنينية ، والتحقيق في دورها في أنواع الخلايا المختلفة.

لتحقيق ذلك ، نجمع بين ثلاث تقنيات عالية الكفاءة. وتشمل هذه عزل الخلايا الجذعية الجنينية المحسنة للفأر ، وتجميع عامل الاستهداف القائم على إعادة التركيب ، واستهداف الخلايا الجذعية الجذعية الجنينية عبر تبادل الكاسيت بوساطة إعادة التركيب ، أو RMC. سيتم توضيح بعض الإجراءات Jinke D'Hont ، فني من مختبري.

يسمح تبادل الكاسيت بوساطة إعادة التركيب ، أو RMCE ، بتبادل شظايا الحمض النووي بين المتجه وموضع الجينوم. يستفيد RMCE من مواقع إعادة التركيب الخاصة بالمغاير التي لا تتفاعل مع بعضها البعض والتي يتم تضمينها في موضع جينوي. في حالة وجود بلازميد متبرع يحتوي على جزء من الحمض النووي محاط بنفس المواقع غير المتجانسة ، سيقوم المؤركب بإدخال جزء الحمض النووي هذا في الموضع الجيني المتوافق مع RMCE بسبب النقل المتزامن المزدوج.

فقط عند إعادة التركيب الصحيح ، سيتم استعادة جين مقاومة النيومايسين المحاصر في موقع إرساء Rosa 26 ، عبر محفز PGK في ناقل الاستهداف الوارد ، مما يجعل مقاومة الأدوية. ينتج عن نظام مصيدة مقاومة Neomycin كفاءة استهداف عالية جدا ، غالبا ما تكون قريبة من 100٪ في اليوم السابق لعزل الكيسة الأريمية ، أضف 0.1٪ جيلاتين ، إلى 12 لوحة مستنبتة جيدا. واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

استنشق محلول الجيلاتين. ثم قم بزرع ربع قارورة من الخلايا الليفية الجنينية للفأر P2 ، أو MEFs ، إلى وسط MEF ، وقسمها على صفيحة 12 بئرا. احتضان الألواح المكونة من 12 بئرا من MEFs في ملليلترين من وسط MEF عند 37 درجة مئوية.

وتنمو الخلايا إلى طبقة أحادية التقاء. ثم أضف 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من بذور الميتومايسين إلى الآبار. واحتضان الثقافات لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية ، لتعطيل الخلايا.

بعد اختيار الفئران غير المتجانسة الزيجوت التي تحتوي على شريط RMCE في موضع Rosa 26 وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد التزاوج لتربية الفئران غير المتجانسة المتوافقة مع RMCE ، مع الفئران غير المتجانسة الزيجوت. في صباح اليوم التالي ، تحقق من وجود سدادات جماع عن طريق رفع الأنثى من قاعدة الحكاية ، وافحص فتحة المهبل بحثا عن كتلة بيضاء. إذا كان من الصعب رؤية القابس ، باستخدام مسبار بزاوية ، انشر شفاه الفرج قليلا ، ثم افصل الإناث المسدودة عن ذكورها.

لجمع الأكياس الأريمية في 3.5 أيام بعد الجماع ، أو DPC. بعد القتل الرحيم للإناث الحوامل ، قم بعمل شق في منتصف البطن ، واستخدم مقصا دقيقا وملقطا لتشريح الرحم وقناة البيض. بعد ذلك ، قم بثني إبرة قياس 26 في زاوية 45 درجة متصلة بحقنة سعة 1 مليلتر مملوءة بوسط M2.

وأدخل الإبرة في نهاية الرحم الأقرب إلى قناة البيض. استخدم ملقطا دقيقا لتثبيت الإبرة في مكانها أثناء دفع المكبس لطرد الأكياس الأريمية من الرحم إلى غطاء طبق طوله 10 سم. سوف ينتفخ الرحم ، إذا نجح التنظيف.

استخدم ماصة الفم لجمع كل الأجنة في قطرة من وسط M2 ، واغسل الأجنة مرتين في قطرة من وسط M2. مباشرة بعد غسل الأجنة ، استخدم PBS لغسل الخلايا المعطلة الميتومايسين-سي مرتين. ثم باستخدام ماصة الفم، ضع كل كيسة أريمية على بئر منفصل من MEFs المعالجة بالميتومايسين-C، في وسط خلية SRES، مع استكمال بمولية متعددة القدرات أو 2I.

احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتحديث وسط خلية SREF كل يومين إلى ثلاثة أيام. افحص كل كيسة أريمية تحت مجهر استريو بتكبير 4 أضعاف ، وتحقق من الفقس والانفصال عن طبقة MEF.

بعد 10 إلى 12 يوما من الاستزراع، تحت مجهر ستيريو، استخدم ماصة P10 ذات أطراف يمكن التخلص منها، لاختيار نتوءات الإيسيوم الفردية. انقل كل نتاج إلى ما يقرب من 10 ميكرولتر من المتوسط إلى صفيحة 96 بئرا على شكل حرف V ، تحتوي على 30 ميكرولترا لكل بئر من PBS. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 50 ميكرولترا من 0.25٪ تريبسين إلى كل بئر.

واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث دقائق. أضف 100 ميكرولتر من وسط الخلية الجذعية الجذعية المحتضنة مسبقا المحتوية على FPS ، وقم بفصل نتوءات الإيكسيوم إلى خلايا مفردة عن طريق سحب العينة من 10 إلى 15 مرة. ثم انقل الخلايا المنفصلة إلى 96 لوحة MEF معالجة جيدا ب mitomycin-C.

في اليوم التالي ، قم بتغيير الوسيط المستند إلى SR. قم بتوسيع خلايا ES بطريقة مماثلة من 24 إلى 6 ألواح من الآبار. بعد تحديد نواقل CDNA التي تم إنقاذها وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد تفاعل LR سعة 10 ميكرولتر باستخدام 100 نانوجرام من ناقل CDNA للإنقاذ ، و 150 نانوغرام من ناقل RMCEDV1 المقطوع مسبقا ، وميكرولترين من مزيج إعادة التركيب ، الذي يحتوي على إنتجراز مشفر بالعاثية ، واستئصال ، وعامل مضيف تكامل بكتيري.

احتضان التفاعل عند 25 درجة مئوية لمدة ساعتين. لتحويل النواقل المعاد تجميعها ، أضف 5 ميكرولتر من كل خليط ، إلى 40 ميكرولتر من بكتيريا الإشريكية القولونية المختصة بالصدمات الحرارية ، في أنبوب غطاء لولبي 2 ملليلتر. واحتضان العينة على الجليد لمدة 20 دقيقة.

ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. أضف ملليلترا واحدا من وسط LB إلى الأنبوب ، واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. لوحة 50 ميكرولتر على ألواح أجار مع أمبيسلين.

وتنمو عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. حدد المستعمرات ذات متجه الاستهداف الصحيح باستخدام طرف P200 لاختيار خمس مستعمرات بشكل عشوائي. انقل الطرف إلى أنبوب اختبار زجاجي يحتوي على ملليلترين إلى خمسة ملليلتر من وسط LB ، وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.

بعد استخراج الحمض النووي من كل مستعمرة ، تحقق من صحة العينات عن طريق هضم 0.5 إلى ميكروغرامين من الحمض النووي ، وافصل العينات على هلام الاغاروز بنسبة 1٪. ابدأ ثقافة متوافقة مع RMCE ، وقم بإخراج الخلايا الجذعية الجنينية ، وقم بتمريرها مرتين على الأقل على MEFs ، في وسط خلية ES المستندة إلى FBS. ثم قم بتقسيم الخلايا الجذعية الجنينية على صفيحة من ستة آبار جيلاتينية.

في اليوم التالي ، استخدم 1.5 مل من وسط الخلايا الجذعية الجذعية المستندة إلى FBS لتحديث خلايا ES التي تتلاقى حوالي 50٪. اجمع ميكروغرام واحد من ناقل استهداف RMCEDV1 المقطوع مسبقا ، والذي يحتوي على CDNA للإنقاذ ، وميكروغرام واحد من بلازميد تعبير FLIPe ، في 250 ميكرولتر من وسط DMEM النقي. أضف سبعة ميكرولترات من كاشف النقل القائم على الليبوفكتين إلى 250 ميكرولتر من وسط DMEM النقي.

واحتضان المحلول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. اجمع بين محاليل الحمض النووي والليبوفكتين. واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

ثم قم بتدوير خليط الحمل على خلايا ES المنعشة ، ثم قم بتدويرها برفق. بعد يوم واحد من النقل ، قم بتقسيم جميع خلايا ES من الأنبوب إلى طبق استزراع 10 سم ، مع طبقة ملتقرة من DR4 MEFS ، و 10 ملليلتر من وسط الخلايا الجذعية الجذعية القائم على FPS. بعد يومين من التحويل ، حدد استنساخ الخلايا ES مع تبادل الكاسيت الصحيح بوساطة FLIP-e ، عن طريق إضافة G418 إلى الوسط.

كما هو موضح هنا ، يجب أن يكون القتل الجماعي للمستعمرات غير المستهدفة مرئيا بعد ثلاثة إلى خمسة أيام. يجب أن تظهر المستعمرات بعد سبعة إلى 10 أيام. اختر هذه المستعمرات ، ثم قم بتوسيعها ، وتحقق من المستنسخة كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو.

لتفريق الخلايا الجذعية الجنينية إلى أجسام جنينية ، أو EBs ، بعد استزراع خلايا ES باستخدام تركيبات الإنقاذ التي تحركها Rosa 26 وفقا لبروتوكول النص ، اسمح ل EBs بالتشكل في الأطباق غير الملتصقة لمدة 30 يوما. قم بتحديث الوسيط كل يومين إلى ثلاثة أيام عن طريق نقل تعليق EB إلى أنبوب سعة 50 مل. ودع EBs يستقر بالجاذبية.

قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف وسطا جديدا ، وانقل معلق EB إلى طبق بكتيري. تحليل الخلايا الجذعية الجذعية والثقيلة عن طريق التألق المناعي و TEM ، وفقا لبروتوكول النص. باستخدام طريقة وظيفة الهيكل ، تم إنشاء خمسة نواقل استهداف RMCEDV1 مقطوعة مسبقا بكفاءة 100٪ وتم استهداف تركيبات الإنقاذ هذه عبر RMCE ، إلى P120 catenin يطرد خلايا ES ، بكفاءة 97٪ يمكن استخدام مورفولوجيا EB الكيسية كقراءة نمطية لفحص تركيبات الإنقاذ المختلفة.

كدليل على المفهوم ، أنقذ الشكل الإسوي P120 catenin 1A الذي يعمل بمحرك R26 النمط الظاهري p120 catenin. لاختبار ما إذا كان التثبيت الغشائي المستقل E-cadherin ل P120 catenin مكن من تكوين EB csytic ، تم دمج فكرة استهداف غشاء k-ras ، CAAX ، في نهاية الكربوكسي من P120 catenin ، وتم إدخالها عبر RMCE ، إلى P120 catenin يقضي على خلايا ES ، قبل أن يتم تصنيع EBs منها. ومع ذلك ، فإن هذا البناء يخدم سلبية مهيمنة لا تسمح بربط وتثبيت E-cadherin.

ونتيجة لذلك ، لا ينقذ النمط الظاهري p120 catenin. الانتقال الظهاري الوسيط ، أو EMT ، هو عملية تنموية أساسية تحدث أيضا أثناء تمايز الخلايا الجذعية الجذعية. عند التعبير عنها في p120 catenin تقضي على خلايا ES ، فشلت محفزات EMT ، ZEB1 ، ZEB2 ، أو الحلزون الذي يمكنه قمع جينات العلامات الظهارية المختلفة بشكل مباشر مثل E-cadherin ، في استعادة تكوين EB الكيسي.

بمجرد إتقانها ، يمكن عزل خلايا ES المتوافقة مع RMCE في غضون شهر واحد. يمكن إنشاء نواقل استهداف متوافقة مع RMCE في غضون أسبوع واحد ، ويمكن تحقيق الإنقاذ المستهدف لخلايا ES في غضون شهر واحد باستخدام هذه التقنية ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام RMCE لإجراء دراسات وظائف الهيكل في الخلايا الجذعية الجنينية الساذجة أو المتمايزة.