الاستنساخ وظيفية باستخدام القيطم نظام التعبير البويضة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار بويضة Xenopus ، وهي نظام غطاء حيواني ، مناسب لتحديد المنتجات الجينية القادرة على إحداث استجابة في الأديم الظاهر المختص. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء التنموي مثل الجينات الضرورية لحظر الاستجابة الاستقرائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استخدامها لبويضة Xenopus ، كنظام تعبير ، لإنتاج وتحديد المحفزات التي تعمل على الأنسجة المستهدفة ، أو حتى الجينات التي تعمل في المنبع من المحفزات.

العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدا للغاية ، حيث تعتمد خطوات التشريح وإعادة التركيب بشكل كبير على المرحلة وتتطلب تقنية مكررة. بعد جمع أنسجة المبيض من الضفادع الأنثوية المخدرة ، قم بتمزيق الأنسجة إلى قطع صغيرة ، تحتوي كل منها على ما يقرب من 10 إلى 20 بويضة. وانقل هذه الشظايا ، أولا إلى محلول OR2 الطازج ، ثم إلى OR2- يحتوي على 2.0 ملليغرام لكل مليلتر كولاجيناز A.استمر عن طريق تحريك الخليط المحتوي على الأنسجة برفق على شاكر لمدة ساعة واحدة.

ثم انقل الأجزاء إلى محلول كولاجيناز طازج ، وحركها لمدة ساعة إضافية. توقع ملاحظة البويضات المفككة في نهاية هذا العلاج. استمر في غسل البويضات 10 مرات في OR2 كامل، ثم مرتين في وسط زراعة البويضات ، والمختصرة باسم OCM.

بعد ذلك ، ضع البويضات في OCM جديدة ، وفحصها بصريا تحت مجهر التشريح. اعزل تلك الموجودة في المرحلة السادسة عن طريق التخلص من البويضات الأصغر غير الناضجة. بعد ذلك ، ضع البويضات في طبق بتري مغطى بالأغروز يحتوي على OCM ، واحتفظ بها عند 18 إلى 20 درجة مئوية حتى الحقن.

للتحضير للحقن المجهري ، ضع الأنابيب الشعرية الزجاجية في مجتذب إبرة ، واسحبها ، ثم اكسر الأطراف من الزجاج لتوليد إبر يبلغ قطرها حوالي 20 ميكرومتر. على المجهر المركب ، قم بقياس أطراف الإبرة باستخدام ميكرومتر العين المعاير. بعد ذلك ، ادفع الطين في طبقة موحدة في قاع طبق بتري مقاس 35 × 10 ملم.

ثم قم بإنشاء أخاديد متوازية في هذه الطبقة ، باستخدام أداة تشبه مسبار المركز التجاري. املأ الطبق المبطن بالطين بحوالي 2 مل من 3٪ Ficoll في محلول ملحي بارث معدل 1x ، أو MBS. ثم انقل البويضات إليها باستخدام ماصة واسعة التجويف.

ضع البويضات في البساتين بحيث يتم تثبيتها في مكانها أثناء الحقن المجهري اللاحق. باستخدام حاقن دقيق ، املأ إبرة بما يقرب من ميكرولتر من مجموعة من mRNA التي تم إنشاؤها مسبقا واضبط التوازن لإنتاج ضغط إيجابي طفيف ، مما يمنع سحب سيتوبلازم البويضة إلى الإبرة أثناء الحقن. ثم قم بحقن كل بويضة ب 20 نانولترا من الحمض النووي الريبي في المنطقة الاستوائية.

بعد ذلك ، اترك البويضات في Ficoll MBS لمدة ساعة واحدة ، ثم انقلها برفق إلى 1x MBS. استمر في احتضان البويضات لمدة ثماني إلى 24 ساعة عند 20 درجة مئوية. لبدء فحص غطاء ، اجمع 3/4x وسط برمائي طبيعي ، يتم اختصاره باسم محلول NAM ، والملقط الناعم ، وحلقة الشعر ، والبويضات المحقونة مسبقا ، وأجنة xenopus في المرحلة 11 إلى 11.5.

بعد ذلك ، قم بتفكيك الغطاء الزجاجي إلى شظايا بحجم ملليمتر واحد في ملليمتر تقريبا ، وقم بتمرير هذه القطع عبر اللهب حتى تلمع حوافها وترسمها. بعد ذلك ، اضغط على الطين في طبقة واحدة في طبق ، كما هو موضح سابقا. واستخدم مسبار المركز التجاري لإنشاء انطباعات فردية على شكل كوب في هذا الطلاء.

استمر في ملء الطبق بما يقرب من ملليلترين من 3/4x NAM. وإليها ، قم بنقل البويضات المحقونة ، ووضع العديد منها بحيث يتم تثبيت كل منها في مسافة بادئة واحدة. لتحضير الأجنة ، انقلها في طبق يحتوي على 3/4x محلول NAM.

حدد مجموعة فرعية من المعدة لاستخدامها كعناصر تحكم مرحلية لعمر الأديم الظاهر ، وانقلها إلى طبق آخر يحتوي على نفس المحلول. وضعي هذا الطبق جانبا. بالنسبة للأجنة التي سيتم استخدامها في غطاء ، قم بإزالة أغشية vitelline الخاصة بها بزوجين من الملقط الناعم.

بعد ذلك ، انقل المعدة إلى طبق مبطن بالطين مع البويضات. للبدء ، قم بقطع أغطية من الأجنة باستخدام زوجين من الوافعات الدقيقة ، مع الحرص على تجنب الأنسجة الاستوائية. لتوليد مواد مؤتلفة باستخدام الطريقة الأولى ، ضع أغطية حيوانية بحيث يلامس السطح الداخلي نصف الكرة الأرضية للبويضة ، الموضوعة بالفعل في المسافة البادئة.

وكرر هذه العملية للعديد من البويضات المحقونة. للتأكد من أن هذه المؤتلفات متماسكة معا ، ضع جزءا من غطاء زجاجي منحني فوق كل منها ، واضغط لأسفل حتى يتم تسطيح وتلامس الغطاء بالطين. لتوليد المؤتلفات باستخدام الطريقة الثانية ، ضع أغطية والبويضات معا في مسافات بادئة فردية فارغة في الطين.

وتأكد من أن الأسطح الداخلية لأغطية تواجه البويضة. بعد ذلك ، قم بتأمين الأنسجة معا باستخدام امتدادات صغيرة من الطين. بمجرد إنشاء العديد من المؤتلفات باستخدام أي من الطريقتين ، ثم الزراعة والأجنة الضابطة المخصصة عند 20 درجة مئوية.

عندما تصل أجنة التحكم إلى المرحلة المرغوبة ، قم بإزالة الغطاء من المؤتلفات وعزل الأديم الظاهر للغطاء الحيواني باستخدام ملقط وحلقة شعر. استمر في إصلاح كل من شظايا الأديم الظاهر والتحكم في الأجنة في MEMFA لمدة ساعة واحدة. ونقلها إلى الإيثانول وتخزين هذا النسيج عند سالب 20 درجة مئوية.

هنا ، تم حقن مجموعات من البويضات بمجموعات من الرنا المرسال تتوافق مع أعداد أقل تدريجيا من المستنسخة أو المستعمرات ، ثم تم استزراعها بأغطية حيوانية. بعد ذلك ، تم تحديد عدد أغطية في كل مجموعة تعبر عن foxe3 ، وهي علامة يتم ملاحظتها عادة في الأديم الظاهر للعدسة المفترضة من مراحل الصفيحة العصبية المبكرة إلى تكوين الحويصلة ، واستخدامها هنا ، لتقييم قدرة تحفيز العدسة. تم تحديد هذه الطريقة في جين ترميز العامل النووي ، ldb1 ، والذي يمكن أن ينتج استجابة محفزة للعدسة في 50 من أصل 179 ، أو 28٪ من القبعات الحيوانية التي تم تقييمها.

كما هو موضح هنا ، صور التهجين في الموقع ، التي تصور إشارة foxe3 ، المشار إليها برؤوس الأسهم ، في قبعات حيوانية مستزرعة ببويضات محقونة ldb1 من المرحلة 11 إلى المرحلة 23 تقريبا. لم يلاحظ أي تعبير foxe3 في أغطية التحكم المقابلة الموضوعة على البويضات غير المحقونة. عندما تم إنشاء أقسام من هذه القبعات الحيوانية ، لوحظ تعبير foxe3 في كل من طبقات الأديم الظاهر الداخلية والخارجية.

التعبير في الطبقة الداخلية هو سمة من سمات استجابة العدسة. أو ، كما هو موضح في كلتا الطبقتين ، يدل على هياكل أخرى مثل اللوحة الشمية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق مثل الكيمياء المناعية ، أو التهجين في الموقع ، أو الكشف المباشر عن جين مراسل الفلورسنت ، من أجل تقييم الاستجابة الاستقرائية في الأديم الظاهر للغطاء الحيواني.