الاستنساخ وظيفية باستخدام

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح نظام بويضة Xenopus والغطاء الحيواني، وهو نظام مناسب لتحديد نواتج الجينات القادرة على تحفيز استجابة في الأديم الظاهر المختص. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم الأحياء التنموي، مثل الجينات الضرورية لاستثارة استجابة تحريضية. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدام بويضة Xenopus كنظام تعبير لإنتاج وتحديد المحرضات التي تؤثر على نسيج مستهدف، أو حتى الجينات التي تعمل في مراحل تسبق المحرضات.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة مفيداً للغاية، حيث إن خطوات التشريح وإعادة التجميع تعتمد بشكل كبير على المرحلة وتتطلب تقنية دقيقة. بعد جمع أنسجة المبيض من إناث الضفادع المخدرة، قم بتمزيق النسيج إلى قطع صغيرة، تحتوي كل منها على 10 إلى 20 بويضة تقريباً. وانقل هذه الشظايا، أولاً إلى محلول OR2 طازج، ثم إلى محلول OR2 يحتوي على 2.0 mg/mL من collagenase A. استمر في ذلك عن طريق رج الخليط الذي يحتوي على الأنسجة برفق على جهاز هزاز لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، انقل الشظايا إلى محلول كولاجينيز (collagenase) جديد، وقم برجها لمدة ساعة إضافية. من المتوقع ملاحظة بويضات مفككة في نهاية هذه المعالجة. انتقل بعد ذلك إلى غسل البويضات 10 مرات في محلول OR2 الكامل، ثم مرتين في وسط زراعة البويضات، المختصر بـ OCM.

بعد ذلك، ضع البويضات في وسط زراعة البويضات (OCM) طازج، وافحصها بصرياً تحت مجهر التشريح. اعزل البويضات التي في المرحلة السادسة عن طريق التخلص من البويضات الأصغر حجماً وغير الناضجة. بعد ذلك، ضع البويضات في طبق بتري مغطى بالأغاروز ويحتوي على OCM، واحفظها في درجة حرارة تتراوح بين 18 إلى 20 درجة مئوية حتى وقت الحقن.

للتجهيز لعملية الحقن المجهري، ضع أنابيب شعيرية زجاجية في جهاز سحب الإبر، ثم اسحبها، واكسر أطراف الزجاج لتكوين إبر بقطر 20 micrometers تقريبًا. وباستخدام مجهر مركب، قم بقياس أطراف الإبر باستخدام ميكرومتر عيني مُعاير. بعد ذلك، اضغط الصلصال لتشكيل طبقة موحدة في قاع طبق بتري مقاس 35 by 10 millimeter.

ثم قم بإنشاء أخدودات متوازية في هذه الطبقة، باستخدام أداة تشبه المسبار الصغير. املأ الطبق المبطن بالطين بحوالي 2 milliliters من 3%Ficoll في 1x modified Barth's saline، أو MBS. وبعد ذلك، انقل البويضات إليه باستخدام ماصة ذات فتحة واسعة.

ضع البويضات في الأخاديد بحيث يتم تثبيتها في مكانها أثناء عملية الحقن المجهري اللاحقة. باستخدام جهاز الحقن المجهري، املأ إبرة بنحو 2 µL من تجمع mRNA تم تحضيره مسبقاً، واضبط التوازن لتوليد ضغط إيجابي طفيف، وهو ما سيمنع سحب سيتوبلازم البويضة إلى داخل الإبرة أثناء الحقن. بعد ذلك، احقن كل بويضة بـ 20 nL من RNA في المنطقة الاستوائية.

بعد ذلك، تُترك البويضات في محلول Ficoll MBS لمدة ساعة واحدة، ثم تُنقل برفق إلى محلول 1x MBS. يتم بعد ذلك تحضين البويضات لمدة تتراوح من 8 إلى 24 ساعة عند درجة حرارة 20 degrees Celsius. لبدء مقايسة القبعة الحيوانية، قم بتجهيز محلول الوسط البرمائي الطبيعي بتركيز 3/4x، والذي يُرمز له اختصاراً بمحلول NAM، وملقط دقيق، وعروة شعر، والبويضات التي تم حقنها مسبقاً، وأجنة xenopus في المرحلة من 11 إلى 11.5.

بعد ذلك، قم بتكسير شرائح الغطاء الزجاجية إلى شظايا يبلغ حجمها حوالي 1 mm في 2 mm، ومرر هذه القطع عبر لهب حتى تصبح حوافها مصقولة ومنصهرة. بعد ذلك، اضغط الصلصال في طبقة واحدة في طبق، كما تم وصفه سابقاً. واستخدم مسباراً صغيراً لعمل انطباعات فردية على شكل أكواب في هذه الطبقة.

استمر في ملء الطبق بنحو 2 mL من محلول 3/4x NAM. ثم انقل إليه البويضات المحقونة، مع وضع كل منها بحيث تكون مثبتة في فجوة واحدة. ولتجهيز الأجنة، انقلها إلى طبق يحتوي على محلول 3/4x NAM.

اختر مجموعة فرعية من الجاسترولات لاستخدامها كضوابط مرحلية لتحديد عمر الأديم الظاهر، وانقلها إلى طبق آخر يحتوي على المحلول نفسه، ثم ضع هذا الطبق جانباً. وبالنسبة للأجنة التي ستُستخدم في مقايسة القبعة الحيوانية، قم بإزالة أغشيتها المحية باستخدام زوجين من الملاقط الدقيقة.

بعد ذلك، انقل الجاسترولا إلى الطبق المبطن بالطين الذي يحتوي على الخلايا البيضية. للبدء، قم بقص الأغطية الحيوانية من الأجنة باستخدام زوجين من الملاقط الدقيقة، مع الحرص على تجنب الأنسجة الاستوائية. ولإنتاج المركبات باستخدام الطريقة الأولى، ضع غطاءً حيوانياً بحيث يلامس سطحه الداخلي النصف الحيواني لخلية بيضية موضوعة مسبقاً في تجويف.

وكرر هذه العملية لعدة بويضات محقونة. ولضمان تماسك هذه المركبات المعاد تركيبها، ضع قطعة منحنية من غطاء شريحة زجاجية فوق كل منها، واضغط لأسفل حتى يتسطح الحيوان ويلامس الغطاء الزجاجي الصلصال. ولتوليد مركبات معاد تركيبها باستخدام الطريقة الثانية، ضع قبعات حيوانية وبويضات معاً في تجاويف فردية فارغة في الصلصال.

وتأكد من أن الأسطح الداخلية لأغطية الحيوانات تواجه البويضة. بعد ذلك، قم بتثبيت النسيجين معاً باستخدام وصلات صغيرة من الطين. وبمجرد إنتاج عدة مركبات معاد تركيبها باستخدام أي من الطريقتين، قم بزراعتها هي والأجنة الضابطة التي تم عزلها عند 20 degrees celsius.

عندما تصل الأجنة الضابطة إلى المرحلة المطلوبة، قم بإزالة أغطية الشرائح من العينات المعاد تركيبها، واعزل أديم السطح للقمة الحيوانية باستخدام الملقط وحلقة شعر. بعد ذلك، قم بتثبيت كل من قطع الأديم السطحي والأجنة الضابطة في MEMFA لمدة ساعة واحدة. ثم انقلها إلى الإيثانول وخزن هذه الأنسجة عند درجة حرارة 20- درجة مئوية.

هنا، تم حقن مجموعات من البويضات بخلطات من mRNA تقابل أعداداً متناقصة تدريجياً من النسائل أو المستعمرات، ثم زُرعت مع قبعات حيوانية. بعد ذلك، تم تحديد عدد القبعات الحيوانية في كل مجموعة التي تعبر عن foxe3، وهو واسم يُلاحظ عادةً في الأديم الظاهر للعدسة المفترضة من مراحل الصفيحة العصبية المبكرة حتى تكوين الحويصلة، واستُخدم هنا لتقييم القدرة على حث تكوين العدسة. حددت هذه الطريقة جيناً يشفر عاملاً نووياً، ldb1، والذي يمكنه إحداث استجابة محفزة للعدسة في 50 من أصل 179، أو 28% من القبعات الحيوانية التي تم تقييمها.

تُظهر هنا صور التهجين الموضعي (in situ hybridization) الخاصة بنا، والتي توضح إشارة foxe3، المشار إليها برؤوس الأسهم، في القبعات الحيوانية المستنبتة مع بويضات محقونة بـ ldb1 من المرحلة 11 تقريبًا إلى المرحلة 23. لم يُلاحظ أي تعبير لـ foxe3 في القبعات الحيوانية الضابطة المقابلة التي وُضعت على بويضات غير محقونة. وعند إعداد مقاطع عرضية من هذه القبعات الحيوانية، لوحظ تعبير foxe3 في كل من طبقات الأديم الظاهر الداخلية والخارجية.

يعتبر التعبير في الطبقة الداخلية سمة مميزة لاستجابة العدسة. أما التعبير في كلتا الطبقتين، فيشير إلى وجود بنيات أخرى مثل الصفيحة الشمية. بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق مثل الكيمياء النسيجية المناعية، أو التهجين الموضعي، أو الكشف المباشر عن جين مراسل فلوري، وذلك لتقييم الاستجابة التحريضية في أديم الرأس لغطاء الحيوان.