جبلة المحوار من عزل العصب الوركي الجرذ

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل سيتوبلازم محوري نقي أو إكتوبلازم من عصب محيطي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح العصب الوركي. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إزالة النسيج الضام من العصب وفصل الحزم العصبية.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تحضين قطع قصيرة من الألياف العصبية في وسط منخفض التوتر. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي التحضين في محلول متساوي التوتر، ثم الطرد المركزي، ثم التصفية. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر درجة عالية من الإثراء للمكونات المحورية عن طريق تحليل western blot.

مرحباً، اسمي إيل ومي روزنباوم. نحن من مختبر البروفيسور مايك إف لابور في قسم الكيمياء الحيوية بمعهد العلوم. سنقوم اليوم بعرض تقنية جديدة من تقنيات Oxy Opat Mesylation.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الضغط اليدوي في تقنية OIS للعصب الطرفي، في أن هذا الإجراء يقلل من تلوث المكونات المحورية بالمصل والغراء العصبي. لقد استخدمنا هذه التقنية الجديدة لمثيلة PLAs من أجل استكشاف الإشارات الراجعة القائمة على D بعد إصابة العصب الوركي.

لنبدأ الآن. ضع أحد جرذان ويستار (Wistar rats) التي تم قتلها رحيمًا، والتي تتراوح أعمارها بين 8 إلى 10 أسابيع، على جانبه فوق بساط التشريح للوصول المباشر إلى الجزء القاصي من العصب الوركي. قم بحلاقة الجلد عند منتصف الفخذ ومسحه جيدًا بـ 70%ethanol.

استخدم المقص لإزالة الجلد من الفخذ. اقطع بعناية عبر الدهون والأنسجة الضامة الموجودة بين العضلة ذات الرأسين الفخذية والعضلات الألوية السطحية. استخدم الملقط لرفع المنطقة المكشوفة من العصب الوركي واستئصاله.

سيكون طول الجزء المستأصل حوالي 1.5 centimeters تقريبًا. انقل العصب إلى 500 µL من محلول 2X PBS المبرد بالثلج والمحتوي على مثبطات البروتياز في أنبوب طرد مركزي دقيق. احتفظ بالأنبوب على الثلج.

كرر إجراء التشريح على الجانب الآخر من الجرذ وعلى جانبي جرذ ثانٍ. قم بخدش قاع طبق بتري باستخدام ماصة باستور واملأه بمقدار 2 mL من محلول 2X PBS المحتوي على مثبطات البروتياز في درجة حرارة الغرفة.

انقل عصبًا واحدًا إلى الطبق تحت مجهر التشريح. استخدم ملقطًا دقيقًا لإزالة الغشاء المحيط بالعصب (epineurium) عن طريق سحبه والتخلص منه، مع ترك الحزم العصبية (fascicles) في الطبق. افصل الحزم العصبية بعناية عن بعضها البعض وعن قاع الطبق.

ستصبح الخلايا الفردية عكرة وتطفو على سطح المحلول. انقل الخلايا المنفصلة فوراً إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 500 microliters من 0.2 X PBS مع مثبطات البروتياز. احفظ الخلايا على الثلج.

قم بفصل وجمع الـ sles من العصب الوركي المتبقي في الأنبوب بدقة. يجب ألا تستغرق عملية إزالة غشاء العصب (epineurium) وفصل الـ sles أكثر من 10 دقائق لكل عصب.

أخرج الأنبوب الذي يحتوي على SLES المنفصل من الثلج. قم بالتحضين لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة لتحرير الميالين والبنى غير المحورية. اغسل sles في كل عملية غسيل.

استخدم الملقط لرفع الـ sles برفق ونقلها إلى أنبوب جديد يحتوي على 1 mL من 2X PB s مع مثبطات البروتياز. رج الأنبوب على جهاز الهزاز (rocker) لمدة خمس دقائق. اغسل الـ SLES بهذه الطريقة ثلاث مرات بعد الغسيل.

انقل SLES إلى أنبوب إبندورف فارغ ونظيف لإزالة السوائل الزائدة، ثم انقله إلى أنبوب يحتوي على 300 microliters من 1x PBS مع مثبطات البروتياز، واتركه للحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة. ولشطف opsm، تتدخل تركيزات الملح العالية في إجراءات البروتوميات اللاحقة. قم بطرد مركزي للعينة عند 10,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C لترسيب الأنسجة وحطام الخلايا، ثم اسحب السائل الطافي باستخدام الماصة إلى أنبوب إبندورف نظيف.

يجب أن يكون الراشح الناتج صافياً. استخدم جهاز المطياف الضوئي لقياس تركيز البروتين.

يجب الحصول على مردود يتراوح بين 200 إلى 250 micrograms من البروتين. تُخزن مستحضرات البلازما في حصص منفصلة عند درجة حرارة -80 °C لمدة تصل إلى ستة أشهر. يجب تجنب دورات الإذابة والتجميد.

يظهر هنا تحليل لطخة ويسترن لمقارنة عينات الـ op plasm المعزولة بطريقة العصر اليدوي مع عينات الـ opsm المعزولة كما هو موضح في هذا البروتوكول. يلاحظ انخفاض مستويات albumin و GFAP التي تمثل ملوثات بروتينات الدم والخلايا الدبقية على التوالي. وفي المقابل، يظهر إثراء في axonal tubulin beta three في هذا التحضير، مما يشير إلى مستوى عالٍ من البروتينات المحورية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو بالكامل، من المفترض أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح العصب الوركي وكيفية فصل Paco بشكل صحيح. هذا كل شيء، شكراً لمشاهدتكم وبالتوفيق في تجاربكم.