Name: جبلة المحوار من عزل العصب الوركي الجرذ (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: تعلم عزل السيتوبلازم المحوري من عصب الفخذ في الجرذ البالغ باستخدام الوسط الافتقاري. تُحقق هذه الطريقة نقاوة عالية للمكونات المحورية لدراسة وظيفة العصبون.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

هذا البروتوكول يسمح العزلة جبلة المحوار مع التقليل من تلوث الأنسجة والأوعية الدموية الدبقية. الأسلوب غلة حوالي 70-100 ميكروغرام جبلة المحوار البروتين الكلي الواحد الفئران الأسبوع 80-10 يستار القديمة. 1. تشريح الأعصاب الوركي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء two الفئران عن طريق استنشاق أول أكسيد الكربون 2 تليها خلع عنق الرحم. تأكيد الموت لعدم وجود تحسس نبض القلب قبل بداية تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المسحة مجال التشريح مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الجلد والعضلات منفصلة وعزل العصب الوركي باستخدام مقص وملقط بعناية دون الأوعية الدموية المدمرة. تشريح الأعصاب كلا الوركي (حوالي 1.5 سم لكل منهما) من كل حيوان ، وجمع كل الأعصاب الأربع في إيبندورف مع 500 ميكرولتر مثبطات PBS + 0.2X ، حافظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القطع إلى العصب الصحون البلاستيكية التي تحتوي على ما لا يقل عن 2 مل من 0.2X مثبطات الأنزيم البروتيني PBS +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غلاف من الأعصاب باستخدام الملقط غرامة بموجب نطاق مجهر. فصل كراسات بعناية فائقة حتى يصبح غائما وبداية لتطفو على السطح من الحل. يجب أن تمارس هذه الخطوة حتى يمكن إجراء ذلك بسرعة وبدقة (وليس مع أكثر من 10 دقيقة في العصب). </li></ol> 2. الحضانة ، وشطف الغسيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل فصل كراسات لأنبوب إيبندورف الطازجة مع 500 ميكرولتر من 0.2X PBS تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني للحضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل ما لا يقل عن 3 مرات مع 1 مل من المخزن نفسه عن طريق نقل كراسات إيبندورف من أنبوب إلى أنبوب إيبندورف وتهتز لمدة 5 دقائق بعد نقلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة الفائض من السوائل وضعت في أنبوب كراسات إيبندورف فارغة جديدة ومن ثم نقل إلى كراسات أنبوب إيبندورف جديدة مع 300 ميكرولتر من 1X PBS التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني للحضانة لمدة 20-30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 10 دقيقة 10000 XG في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ طاف وقياس تركيز البروتين. هذا هو الإعداد الخاص جبلة المحوار. </li></ol> 3. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. جبلة المحوار الغربية لطخة مقارنة المعزولة بسبب أسلوب الضغط اليدوي مع عينات جبلة المحوار معزولة كما هو مبين في هذا البروتوكول. لاحظ انخفاض مستويات الزلال وGFAP ، وهو ما يمثل بروتين الدم والخلايا الدبقية التلوث ، على التوالي. في المقابل ، هو المخصب محواري B3 تويولين في هذا التحضير ، مما يدل على مستوى عال من البروتينات محواري.

<ol><li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li>
<li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li>
<li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li>
<li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد أكدت التحاليل البيوكيميائية والبروتين أن هذا الإجراء يقلل من تلوث الدم والخلايا الدبقية 3 بالمقارنة مع الأساليب المذكورة سابقا لعزل جبلة المحوار بواسطة الضغط الميكانيكي 1. وقد استخدمنا هذا البروتوكول العزلة جبلة المحوار لاستكشاف داينين ​​المستندة إلى إشارات إلى الوراء بعد إصابة العصب الوركي 2 ، وتتوقع أن تكون ذات منفعة في استكشاف عمليات أخرى كثيرة في الأعصاب الطرفية الكبار ، بما في ذلك محور عصبي - الدبقية التفاعلات 4.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران الذكور ويستار (8-10 أسابيع من العمر) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS PBS 0.2X والحلول التي تحتوي على الأنزيم البروتيني 1X مثبطات (Roshe) 2 حبة لكل 50 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Eppendorfs مقابل 1.5 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الصحون البلاستيكية 35 مم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الأدوات بما في ذلك : مقص وملقط غرامة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجهر والجدول ضوء </li></ul> الأضداد وكان الماوس المضادة للاستنساخ GFAP GA - 5 من سيغما (G6171). كان الأرنب مكافحة الزلال من Cedarlane (CLAG5140). والماوس المضادة للتويولين β3 والأرانب مكافحة gERK من سيغما (T2200 وM5670 على التوالي).

جبلة المحوار من عزل العصب الوركي الجرذ

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

بمعزل عن السيتوبلازم محواري النقي (جبلة المحوار) من الأعصاب الطرفية أمر حاسم للدراسات الحيوية في العديد من العمليات البيولوجية. في هذه المقالة ، علينا أن نظهر ووصف بروتوكول للعزلة جبلة المحوار من العصب الوركي الجرذان الكبار على أساس الخطوات التالية : (1) تشريح الأعصاب والكراسات فصل النسيج الضام ، (2) حضانة شرائح قصيرة من الكراسات في العصب المتوسط ​​ناقص التوتر الافراج الميلين وليز غير محواري الهياكل ، و (3) استخراج المواد محوار التخصيب المتبقية. أكدت توصيف البروتين والبيوكيميائية هذا المستحضر على درجة عالية من التخصيب لمكونات المحاور.

نظهر بروتوكول للعزلة جبلة المحوار من العصب الوركي الجرذان الكبار على أساس تشريح الأعصاب وكراسات الحضانة في المتوسط ​​للإفراج ناقص التوتر وليز الميلين غير محواري الهياكل ، تليها استخراج المواد محوار التخصيب المتبقية.

يعد عزل السيتوبلازم المحوري النقي (الأكسوبلازم) من العصب الطرفي أمراً بالغ الأهمية للدراسات الكيميائية الحيوية للعديد من العمليات البيولوجية. في هذا المقال، نقوم بـ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل سيتوبلازم محوري نقي أو إكتوبلازم من عصب محيطي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح العصب الوركي. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إزالة النسيج الضام من العصب وفصل الحزم العصبية.تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تحضين قطع قصيرة من الألياف العصبية في وسط منخفض التوتر. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي التحضين في محلول متساوي التوتر، ثم الطرد المركزي، ثم التصفية. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر درجة عالية من الإثراء للمكونات المحورية عن طريق تحليل western blot.مرحباً، اسمي إيل ومي روزنباوم. نحن من مختبر البروفيسور مايك إف لابور في قسم الكيمياء الحيوية بمعهد العلوم. سنقوم اليوم بعرض تقنية جديدة من تقنيات Oxy Opat Mesylation.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الضغط اليدوي في تقنية OIS للعصب الطرفي، في أن هذا الإجراء يقلل من تلوث المكونات المحورية بالمصل والغراء العصبي. لقد استخدمنا هذه التقنية الجديدة لمثيلة PLAs من أجل استكشاف الإشارات الراجعة القائمة على D بعد إصابة العصب الوركي.لنبدأ الآن. ضع أحد جرذان ويستار (Wistar rats) التي تم قتلها رحيمًا، والتي تتراوح أعمارها بين 8 إلى 10 أسابيع، على جانبه فوق بساط التشريح للوصول المباشر إلى الجزء القاصي من العصب الوركي. قم بحلاقة الجلد عند منتصف الفخذ ومسحه جيدًا بـ 70%ethanol.استخدم المقص لإزالة الجلد من الفخذ. اقطع بعناية عبر الدهون والأنسجة الضامة الموجودة بين العضلة ذات الرأسين الفخذية والعضلات الألوية السطحية. استخدم الملقط لرفع المنطقة المكشوفة من العصب الوركي واستئصاله.سيكون طول الجزء المستأصل حوالي 1.5 centimeters تقريبًا. انقل العصب إلى 500 µL من محلول 2X PBS المبرد بالثلج والمحتوي على مثبطات البروتياز في أنبوب طرد مركزي دقيق. احتفظ بالأنبوب على الثلج.كرر إجراء التشريح على الجانب الآخر من الجرذ وعلى جانبي جرذ ثانٍ. قم بخدش قاع طبق بتري باستخدام ماصة باستور واملأه بمقدار 2 mL من محلول 2X PBS المحتوي على مثبطات البروتياز في درجة حرارة الغرفة.انقل عصبًا واحدًا إلى الطبق تحت مجهر التشريح. استخدم ملقطًا دقيقًا لإزالة الغشاء المحيط بالعصب (epineurium) عن طريق سحبه والتخلص منه، مع ترك الحزم العصبية (fascicles) في الطبق. افصل الحزم العصبية بعناية عن بعضها البعض وعن قاع الطبق.ستصبح الخلايا الفردية عكرة وتطفو على سطح المحلول. انقل الخلايا المنفصلة فوراً إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 500 microliters من 0.2 X PBS مع مثبطات البروتياز. احفظ الخلايا على الثلج.قم بفصل وجمع الـ sles من العصب الوركي المتبقي في الأنبوب بدقة. يجب ألا تستغرق عملية إزالة غشاء العصب (epineurium) وفصل الـ sles أكثر من 10 دقائق لكل عصب.أخرج الأنبوب الذي يحتوي على SLES المنفصل من الثلج. قم بالتحضين لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة لتحرير الميالين والبنى غير المحورية. اغسل sles في كل عملية غسيل.استخدم الملقط لرفع الـ sles برفق ونقلها إلى أنبوب جديد يحتوي على 1 mL من 2X PB s مع مثبطات البروتياز. رج الأنبوب على جهاز الهزاز (rocker) لمدة خمس دقائق. اغسل الـ SLES بهذه الطريقة ثلاث مرات بعد الغسيل.انقل SLES إلى أنبوب إبندورف فارغ ونظيف لإزالة السوائل الزائدة، ثم انقله إلى أنبوب يحتوي على 300 microliters من 1x PBS مع مثبطات البروتياز، واتركه للحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة. ولشطف opsm، تتدخل تركيزات الملح العالية في إجراءات البروتوميات اللاحقة. قم بطرد مركزي للعينة عند 10,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C لترسيب الأنسجة وحطام الخلايا، ثم اسحب السائل الطافي باستخدام الماصة إلى أنبوب إبندورف نظيف.يجب أن يكون الراشح الناتج صافياً. استخدم جهاز المطياف الضوئي لقياس تركيز البروتين.يجب الحصول على مردود يتراوح بين 200 إلى 250 micrograms من البروتين. تُخزن مستحضرات البلازما في حصص منفصلة عند درجة حرارة -80 °C لمدة تصل إلى ستة أشهر. يجب تجنب دورات الإذابة والتجميد.يظهر هنا تحليل لطخة ويسترن لمقارنة عينات الـ op plasm المعزولة بطريقة العصر اليدوي مع عينات الـ opsm المعزولة كما هو موضح في هذا البروتوكول. يلاحظ انخفاض مستويات albumin و GFAP التي تمثل ملوثات بروتينات الدم والخلايا الدبقية على التوالي. وفي المقابل، يظهر إثراء في axonal tubulin beta three في هذا التحضير، مما يشير إلى مستوى عالٍ من البروتينات المحورية.بعد مشاهدة هذا الفيديو بالكامل، من المفترض أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح العصب الوركي وكيفية فصل Paco بشكل صحيح. هذا كل شيء، شكراً لمشاهدتكم وبالتوفيق في تجاربكم.

axoplasm-isolation-from-rat-sciatic-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

نظرا لبساطة عملية جراحية، ونتائج قوية في السلوك، انقباض مزمن في العصب الوركي هو واحد من النماذج الحيوانية البارز لآلام الأعصاب. في غضون 24 ساعة بعد الجراحة، وينشأ فرط الألم ويمكن قياسها كميا باستخدام فراي فون aesthesiometer (اختبار الميكانيكية)، وأخمصي متر تسكين (اختبار الحرارية).

مزمن انقباض في العصب الوركي والألم اختبار فرط الحساسية في الفئران

يوضح هذا الفيديو عزل واستزراع خلايا شوان من جذور العمود الفقري للفأر. ثم يتم زراعة الخلايا المعزولة في وسائط معينة. يتم عزل خلايا شوان عن طريق الهضم التفاضلي والالتصاق. يتم نقلها لاحقا إلى أغطية مغلفة بمصفوفة خارج الخلية للربط والانتشار.

عزل خلايا شوان عن جذور العمود الفقري للفأر

يوضح هذا الفيديو طريقة لعزل خلايا شوان عن الألياف العصبية الوركي للفأر.

الفصل المغناطيسي لخلايا شوان عن الأعصاب الوركي للفأر

يوضح هذا الفيديو تسجيلا أحادي الألياف للتوصيل العصبي للألياف C في الفئران. يتم شق الفئران المخدرة لفضح العصب الوركي ، الذي يوفر إمدادا حسيا وحركيا للأطراف السفلية. ثم يتم الكشف عن ألياف C الفردية. يتم توفير التحفيز الكهربائي باستخدام أقطاب تحفيز مزروعة في القدم ، ويتم تسجيل استجابة من ألياف عصبية واحدة.

في الجسم الحي تسجيل أحادي الألياف للألياف C العصبية الوركي في الفئران

هنا ، نقدم تقنية في الجسم الحي لنقل الجينات إلى خلايا شوان (SCs) في العصب الوركي للقوارض. هذه التقنية البسيطة مفيدة للتحقيق في آليات الإشارات المشاركة في تطوير وصيانة SCs الميالينية.

في نقل فيفو جين لخلايا شوان في العصب القوارض وركي من Electroporation لل

هنا ، نقدم بروتوكولا للبثق الهيدروليكي للحبل الشوكي بالإضافة إلى تحديد وعزل العقد الجذرية الظهرية المحددة (DRGs) في نفس القوارض. بالمقارنة مع طرق عزل الحبل الشوكي القياسية ، فإن هذه الطريقة أسرع بكثير وتقلل من خطر تلف الأنسجة.

البثق الهيدروليكي من الحبل الشوكي وعزل الظهرية جذر العقد في القوارض

تسجيل الألياف الواحدة هو تقنية كهربائية فسيولوجية فعالة تنطبق على الجهاز العصبي المركزي والمحيطي. جنبا إلى جنب مع إعداد DRG سليمة مع العصب الوركي المرفقة ، يتم فحص آلية فشل التوصيل. كلا البروتوكولين تحسين فهم علاقة الجهاز العصبي المحيطي مع الألم.

استخدام في فيفو تسجيل واحد من الألياف والعقدة الجذر الرحالة سليمة مع العصب الوركي المرفقة لدراسة آلية فشل التوصيل

هذه الطريقة تسمح بتسجيل قوة الارتعاش والتقلصات tetanic و إمكانية العمل في ثلاثة أنواع من وحدات المحركات في العضلات المعدية الجرذان. يتم تحفيز العزل الوظيفي لوحدة محرك واحد عن طريق التحفيز الكهربائي لمحور عصبي.

العزل الوظيفي للوحدات الحركية واحدة من الجرذ ميديال Gastrocnemius العضلات

يصف هذا البروتوكول تحضير الأنسجة العصبية الوركية الكاملة للفئران للتحفيز الكهروفسيولوجي خارج الجسم الحي وتسجيلها في حمام ملحي منظم بيئيا ومكون من مقصورتين.

تحضير العصب الوركي للفئران للفسيولوجيا العصبية خارج الجسم الحي

في نظام الاستزراع المشترك للعقد الجذرية الظهرية وخلايا شوان ، يمكن دراسة الميالين في الجهاز العصبي المحيطي. يوفر هذا النموذج فرصا تجريبية لمراقبة الميالين المحيطي وقياسه ودراسة تأثيرات المركبات ذات الأهمية على غمد الميالين.

الميالين في المختبر للمحاور المحيطية في زراعة مشتركة لنباتات العقدة الجذرية الظهرية للفئران وخلايا شوان

تعلم عزل السيتوبلازم المحوري من عصب الفخذ في الجرذ البالغ باستخدام الوسط الافتقاري. تُحقق هذه الطريقة نقاوة عالية للمكونات المحورية لدراسة وظيفة العصبون.

جبلة المحوار من عزل العصب الوركي الجرذ

استكشف المزيد من الفيديوهات