جبلة المحوار من عزل العصب الوركي الجرذ
September 24th, 2010
نظهر بروتوكول للعزلة جبلة المحوار من العصب الوركي الجرذان الكبار على أساس تشريح الأعصاب وكراسات الحضانة في المتوسط للإفراج ناقص التوتر وليز الميلين غير محواري الهياكل ، تليها استخراج المواد محوار التخصيب المتبقية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل السيتوبلازم المحوري النقي أو الإكتوبلازم من العصب المحيطي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح العصب الوركي أولا. الخطوة الثانية من الإجراء هي إزالة النسيج الضام من العصب وفصل الظواهر.
الخطوة الثالثة من الإجراء هي حضانة أجزاء قصيرة من الألواح العصبية في وسط منخفض التوتر. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي الحضانة في الطرد المركزي للمحلول متساوي التوتر و opsm milian. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر درجة عالية من التخصيب للمكونات المحورية عن طريق تحليل اللطخة الغربية.
مرحبا ، اسمي أنا ، إيل وأنا قد أروزنباوم. نحن من مختبر البروفيسور مايك إف ، قسم العمل في الكيمياء البيولوجية ، معهد العلوم. اليوم سوف نمثل تقنية جديدة ل Oxy Opat Mesylation.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية فوق الطرق الحالية مثل الضغط اليدوي OIS للعصب المحيطي. أي أن هذا الإجراء يقلل من المصل ويصل تلوث glos إلى محتويات محورية. لقد استخدمنا هذه التقنية الجديدة لمثيلة جيش التحرير الشعبى الصينى لاستكشاف الإشارات الرجعية القائمة على D بعد إصابة العصب الوركي.
لذلك دعونا نبدأ. ضع واحدة من اثنين من فئران الويستار التي تتراوح أعمارها بين ثمانية إلى 10 أسابيع على جانبها على حصيرة تشريح للاقتراب المباشر من الجزء البعيد من العصب الوركي. احلق الجلد في منتصف الفخذ واستبدله جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول.
استخدم المقص لقطع الجلد عن الفخذ. اقطع بعناية الدهون والأنسجة الضامة بين العضلة ذات الرأسين الفخذية وعضلات الألوية السطحية. استخدم الملقط لرفع المنطقة المكشوفة من العصب الوركي وإزالتها.
سيكون طول القسم الذي تمت إزالته حوالي 1.5 سم. انقل العصب إلى 500 ميكرولتر من الثلج البارد 2X PBS مع مثبطات البروتياز في أنبوب الطرد المركزي الصغير. احتفظ بالأنبوب على الجليد.
كرر إجراء التشريح على الجانب الآخر من الجرذ وعلى جانبي الجرذ الثاني. احفر الجزء السفلي من طبق بتري بماصة الباستير واملأه بملليلترين من درجة حرارة الغرفة. أشر اثنين X PB s مع مثبطات البروتين.
انقل عصب واحد إلى الطبق تحت المجهر التشريح. استخدم ملقطا دقيقا لإزالة epi nearium من العصب عن طريق سحبه بعيدا والتخلص منه ، وترك الواجهات في الطبق. افصل بعناية الوسائل عن بعضها البعض وقاع الطبق.
ستصبح الفتحات الفردية غائمة وتطفو على سطح المحلول. انقل المصابيح المنفصلة على الفور إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 500 ميكرولتر من 0.2 × PB s مع مثبطات البروتياز. احتفظ بالألواح على الجليد.
افصل واجمع الألواح من الوركي المتبقي في الأنبوب مع الممارسة. إزالة epineurium وفصل الظواهر. يجب ألا يستغرق أكثر من 10 دقائق لكل عصب.
قم بإزالة الأنبوب الذي يحتوي على SLES المنفصل من الجليد. احتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة لإطلاق المايلين والقمل الهياكل غير المحورية. اغسل الألواح لكل غسلة.
استخدم الملقط لرفع الألواح برفق ونقلها إلى أنبوب جديد يحتوي على مليلتر واحد من 2X PB s مع مثبطات البروتين. هز الأنبوب على الروك لمدة خمس دقائق. اغسل SLES بهذه الطريقة ثلاث مرات بعد الغسيل.
انقل SLES إلى أنبوب einor فارغ جديد لإزالة السوائل الزائدة ثم انقله إلى أنبوب يحتوي على 300 ميكرولتر من XPBS واحد مع مثبطات البروتيوس تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة. لتخفيف opsm تتداخل تركيزات الملح العالية مع إجراءات بروتينات أخرى. قم بالطرد المركزي للحزمة عند 10 ، 000 جبن لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لتكوير الأنسجة وحطام الخلية من المادة الطافية في أنبوب أينور نظيف.
تم الحصول على المادة الطافية. يجب أن يكون واضحا. استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس تركيز البروتين.
يجب الحصول على عائد من 200 إلى 250 ميكروغرام من البروتين. قم بتخزين مستحضر البلازما المرجعية في حصص عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى ستة أشهر. تجنب دورات الذوبان والتجميد.
فيما يلي كتلة غربية تقارن البلازما المرجعية المعزولة بطريقة الضغط اليدوي مع عينات opsm المعزولة كما هو موضح في هذا البروتوكول. لاحظ المستويات المنخفضة من الألبومين و GFAP التي تمثل بروتين الدم وتلوث الخلايا الدبقية على التوالي. في المقابل ، يتم إثراء التوبولين المحوري بيتا ثلاثة في هذا المستحضر مما يشير إلى مستوى عال من البروتينات المحورية.
بعد مشاهدة كل هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح العصب العصبي وكيفية فصل باكو بشكل صحيح. هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا مفصلًا لعزل المحوربلازما من عصب الساق للفأر البالغ. يتضمن الأسلوب تشريح حزم الأعصاب والاحتضان في وسط قليل التوتر لإطلاق المايلين بشكل فعال وتحلل الهياكل غير المحورية، مما يؤدي إلى استخراج مادة غنية بالألياف العصبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- البحث المحورى
الخلفية
- عزل السيتوبلازم المحورى ضروري لدراسة وظيفة الخلايا العصبية.
- يُعتبر عصب الساق نموذجًا لدراسات الأعصاب الطرفية.
- فهم المكونات المحورية يمكن أن يساعد في البحوث العصبية.
- قد لا تنتج الطرق السابقة مادة محورية نقية.
غرض الدراسة
- لتطوير بروتوكول موثوق لعزل المحوربلازما.
- لتعزيز نقاء السيتوبلازم المحورى لمزيد من التحليل.
- لتسهيل دراسة المكونات المحورية باستخدام التقنيات البيوكيميائية.
الطرق المستخدمة
- تشريح عصب الساق للوصول إلى حزم الأعصاب.
- إزالة الأنسجة الضامة المحيطة بالعصب.
- احتضان مقاطع العصب في وسط قليل التوتر.
- الطرد المركزي اللاحق والاحتضان في محلول متساوي التوتر.
النتائج الرئيسية
- البروتوكول ينجح في عزل السيتوبلازم المحورى.
- تحليل البلوت الغربي يؤكد الإثراء العالي للمكونات المحورية.
- تظهر النتائج فعالية الطريقة.
- يتم توضيح التطبيقات المحتملة في دراسة بيولوجيا الأعصاب المحورية.
الاستنتاجات
- توفر هذه الطريقة نهجًا قويًا لعزل المحوربلازما.
- يمكن استخدامها في دراسات مختلفة تتعلق بوظيفة الخلايا العصبية.
- تساهم النتائج في فهم بنية ووظيفة الألياف العصبية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Isolation of pure axonal cytoplasm enables mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease programs. This protocol supports predictive confidence by reducing biological noise from non-axonal contaminants in peripheral nerve models. It provides a disease-relevant system for studying axonal signaling pathways relevant to neurotherapeutic discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of axonal protein composition to clarify therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Reduces glial and serum contamination that obscures target engagement signals.
- Predictive Value: Supports functional target validation through enrichment of axonal components like tubulin beta three.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized axon-enriched lysates suitable for biochemical screening.
- Quantitative Output: Permits spectrophotometric protein concentration measurement for normalization.
- Reproducibility: Consistent yield of 200-250 micrograms supports reliable compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models peripheral nerve injury and retrograde signaling after sciatic nerve trauma.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation of axonal biology targets.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go decisions based on axonal target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation of axonal modulators.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating axonal cytoplasm for proteomic profiling.
- Screening: Enables preparation of standardized lysates for compound effect assessment.
- Analytics: Western blot analysis provides quantitative readouts for axonal enrichment.
- Translational Research: Connects to retrograde signaling studies relevant to nerve injury models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for peripheral nerve target de-risking.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through high enrichment of axonal components and reduced contaminant signals.
- Operational Value: Standardized dissection and incubation steps ensure reproducibility across labs.
- Strategic Value: Better target prioritization by minimizing false positives from glial or blood proteins.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted advancement of neurotherapeutic candidates based on clean axonal readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peripheral nerve dissection and sterile technique.
- Needs centrifuge, spectrophotometer, and protease inhibitor infrastructure.
- Demands standardization of hypotonic incubation timing across operators.
- Adaptation considerations for other nerve types or species beyond rat sciatic nerve.
- Practical limitation: Procedure duration limits high-throughput application without automation.
