التدخل في الحمض النووي الريبي القراد

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار تقنية تداخل الحمض النووي الريبي في القراد عن طريق الحقن. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل أولا للجين أو الجينات ذات الأهمية. ثم يتم حقن الحمض النووي الريبي في القراد ، وبعد ذلك يتم الاحتفاظ به في غرفة الرطوبة لمدة 24 ساعة.

بعد فترة الاحتجاز هذه ، يسمح للقراد أن يتغذى على مثل الأغنام أخيرا. يتم تحديد معلمات التغذية مثل الوزن وطرح الريش وموضع البويضات والتعبير عن الجين أو الجينات المستهدفة ذات الأهمية بواسطة R-T-P-C-R في الوقت الفعلي. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح تأثير إسكات الجينات المستهدفة على بيولوجيا القراد من خلال تقييم المعلمات البيولوجية للقراد والتعبير الجيني عن طريق R-T-P-C-R في الوقت الفعلي.

تعمل مجموعتنا مع القراد في محاولة لتوصيف الأحداث الجزيئية في واجهة مسببات أمراض القراد لاستخدام هذه المعلومات الأساسية لتطوير طرق للسيطرة على الإصابة بالقراد ونقل مسببات الأمراض إلى البشر. ظهر تداخل الحمض النووي الريبي كأداة أساسية في هذا البحث لأنه الطريقة الوحيدة المتاحة للتلاعب الجيني بالقراد. وظيفة العديد من جينات القراد غير معروفة.

يسمح لنا تداخل الحمض النووي الريبي بتحديد دور جينات القراد والتعبير الجيني في العديد من جوانب بيولوجيا القراد ، بما في ذلك التزاوج والتكاثر والتغذية والهضم ووظيفة الغدد اللعابية وكفاءة ناقل القراد لنقل مسببات الأمراض. سيكون عرض الإجراء هو فريق تداخل الحمض النووي الريبي القراد من مختبرنا ، الدكتور إد لوين ، طالب الدراسات العليا وباسبي وأنا. لتوليد الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، قم أولا بتصنيع بادئات قليل النوكليوتيدات التي تحتوي على T سبعة تسلسلات محفزة للنسخ المختبري للحمض النووي الريبي.

على سبيل المثال ، ديرما سنتر مختلف lesin. استخدم بادئات قليل النوكليوتيدات D ثمانية A A T 75 و D ثمانية DVT 73 الموضحة هنا. تضخيم الجين المستهدف بواسطة R-T-P-C-R باستخدام 10 بيكومول من كل برايمر قليل النوكليوتيدات وواحد إلى 10 نانوجرام من إجمالي الحمض النووي الريبي للقراد.

بعد ذلك ، قم بتنقية منتج PCR. ثم استخدم ثمانية ميكرولتر أو ما يقرب من 100 نانوجرام لتصنيع الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل. لتحضير القراد للحقن أولا ، اغسل القراد في سلسلة المحاليل التالية ، ماء الصنبور 3٪ بيروكسيد الهيدروجين الماء المقطر مرتين ، 70٪ إيثانول وغسلتين أخيرة بالماء المقطر.

قم بإجراء كل غسلة في أنبوب طرد مركزي يمكن التخلص منه سعة 50 مليلتر عن طريق الرج. ثم صب المحلول من خلال شاشة سلكية شبكية دقيقة. امنع القراد حتى يجف على مناشف ورقية ، ثم قم بتقسيم القراد إلى مجموعات من 20 إلى 50 حسب التجربة.

ضع كل مجموعة في كوب بلاستيكي سعة 1.25 أونصة بغطاء محكم وقم بتسمية كل كوب بالمجموعة التجريبية. رقم بعد ذلك ، قم بتجميع فريق RNAi يتكون من ثلاثة أشخاص سيقومون بعملية الحقن. يضع الشخص الأول كل علامة على شريط لاصق مزدوج مثبت على ورقة ثلاثة × ستة بوصات من شمع الأسنان الأحمر.

الشخص الثاني بحقن القراد والثالث يراقب القراد بعد الحقن ، ويتنفس ثاني أكسيد الكربون على القراد لتنشيطها ويحسب ونقل القراد الحي إلى أكواب تحمل رقم المجموعة التجريبية. يجب على جميع أعضاء الفريق ارتداء قفازات يمكن التخلص منها لبدء عملية حقن القراد ، التقط القراد باستخدام ملقط دومون الناعم وضعه على الجانب البطني لأعلى على شريط لاصق مزدوج مثبت على ورقة شمع الأسنان الأحمر عن كثب ضع القراد في مجموعات من خمسة. ضع شريطا صغيرا من الشريط اللاصق على أجزاء الفم من جميع القراد الخمسة.

من أجل كبحها بشكل أكبر ، اترك معظم الجسم مكشوفا بحيث يمكن ملاحظة عملية الحقن بواسطة حاقن القراد. لحقن القراد ، اخترق ثقبا في الربع الأيمن السفلي من السطح البطني للهيكل الخارجي باستخدام حقنة أنسولين أحادية الإخراج مزودة بإبرة قياس 29 نصف بوصة. بعد ذلك ، قم بحقن القراد على الفور ب 0.2 إلى 0.5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل باستخدام حقنة هاميلتون المصنوعة خصيصا وإبرة 33 بوصة واحدة مع نقطة مشطوفة 45 درجة ، ضع الإبرة جيدا في تجويف القراد لضمان وضع الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل والاحتفاظ به.

على الرغم من إطلاق السائل بعد الحقن ، فإن الوضع العميق للإبرة للحقن سيضمن ترسيب ما يكفي من الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل في تجويف القراد لإحداث الحذر الجيني الذي يجب ألا يتم توخيه في التجاوز. حقن القراد ، مما يؤدي إلى فقدان الهيموليمف وموت القراد. مباشرة بعد حقن القراد ، التقطها من الشريط اللاصق المزدوج بالملقط الدقيق وضعها في وعاء استرداد بلاستيكي.

سيبقى القراد غير نشط لفترة وجيزة بعد الحقن ، ولكن يجب أن يبدأ قريبا في الزحف حول الطبق. قم بتنشيط القراد عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون عليها. بمجرد أن يزحف القراد ونشطا ، سوف يلتئم جرح الحقن بسرعة ومن المرجح أن ينجو.

عد القراد في كل مجموعة تجريبية وضع كل مجموعة في كوب بلاستيكي مصنف بغطاء محكم. استبدل أي قراد يموت في المجموعة الحالية قبل حقن المجموعة التجريبية التالية. قم بتنظيف حقنة هاميلتون قبل حقن المجموعة التجريبية التالية عن طريق ملء المحقنة ثم طردها ببيروكسيد الهيدروجين الطازج بنسبة 3٪.

15 مرة تليها 15 غسلة بالماء المعقم. احرص على عدم ثني مكبس حقنة هاميلتون ، وإلا فلن يتحرك المكبس بسلاسة ويستجيب لللمس اللطيف المطلوب لحقن القراد. بعد الحقن ، ضع القراد في غرفة بها وعاء مملوء بالماء وكبريتات البوتاسيوم ، مما يحافظ على رطوبة عالية ولهم ليوم واحد.

بعد ذلك ، ضع القراد الفردي في خلايا تغذية القراد الملصقة على الأغنام واسمح لها بالتغذية بعدد متساو من القراد من الذكور أو الإناث المحقونين ، أيا كان الجنس الذي لم يتم حقنه. اجمع إناث القراد وتلويحها من خلية التغذية بعد إتمام الرضاعة لمدة 10 أيام تقريبا أو عندما تسقط الإناث الضابطة ، يحتضن المضيف كل مجموعة من القراد في غرفة الرطوبة حتى اكتمال وضع البويضات. قم بتقييم موضع البويضات حسب المجموعة عن طريق وزن كتلة البيض التي تنتجها جميع القراد في مجموعة لتقييم النمط الظاهري للقراد بعد الرضاعة.

حدد عدد القراد الذي نجت واحسب وزن القراد وكذلك موضع البويضات وخصوبة البيض. اعتمادا على الجين المستهدف وأهداف الدراسة ، يمكن إجراء تحليلات أخرى لتأكيد إسكات الجينات بواسطة R-T-P-C-R. بعد الرضاعة ، قم بتشريح الغدد اللعابية والأمعاء من القراد الفردي من مجموعات الحمض النووي الريبي المحقون والمزدوجة التي تقطعت بها السبل ، ثم استخرج الحمض النووي الريبي الكلي من عينات الأنسجة الفردية.

قم بتحليل نصوص الجينات المستهدفة في الأنسجة الفردية عن طريق R-T-P-C-R في الوقت الفعلي وتطبيع مستويات الحمض النووي الريبي ضد الحمض النووي الريبي الريبوزومي القراد 16 ثانية. باستخدام طريقة معيار الجين ، قم بتشغيل منحنيات التفكك في نهاية التفاعل للتأكد من تكوين أمبليكون واحد فقط وأن الأمبليكونات تتغير باستمرار في نفس نطاق درجة الحرارة لكل عينة ، وقارن قيم التصوير المقطعي المحوسب الطبيعية لمستويات الرنا المرسال بين التحكم المحقون والمزدوج الذي تقطعت به السبل. حقن الحمض النووي الريبي القراد باستخدام اختبار T الخاص بالطالب.

تم استخدام البروتوكول الموصوف هنا في مختبرنا للحمض النووي الريبي في العديد من أنواع القراد الخارجية المختلفة. تختلف كمية الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل في القراد باختلاف حجم القراد. يمكن أن تستوعب أنواع القراد الأكبر حجما أكبر.

يمكن العثور على المراجع في الجزء المكتوب المصاحب من البروتوكول. إذا تم تنفيذ البروتوكول بشكل صحيح ، فيجب الحصول على أقل من 5٪ من الوفيات من إجراء الحقن بعد 24 ساعة. يظهر هنا نمط ظاهري نموذجي بعد ضربة قاضية للجينات في القراد حيث تم حقن لوحة من القراد بمجموعات من الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل والذي تم استخدامه للكشف عن المستضدات الواقية من القراد.

في القراد الذي يتم فحصه بواسطة الفحص المجهري الضوئي ، يمكن ملاحظة التنكس الخلوي في أنسجة القراد. قد تكون التغييرات المظهرية مصحوبة أيضا بفقدان الوظيفة. على سبيل المثال ، ينتج عن RNAI من SUBIN ذكور معقمين لا يستطيعون التزاوج بنجاح مع الإناث بعد تداخل الحمض النووي الريبي والقراد.

يمكن استخدام طرق أخرى لتحديد تأثير إسكات الجينات على التعبير الجيني والبروتيني وعلى بيولوجيا القراد ، بما في ذلك R-T-P-C-R في الوقت الفعلي أو الإلكترون الخفيف أو الفحص المجهري متحد البؤر. علم الجينوم أو البروتينات. يمكن أيضا إجراء تداخل الحمض النووي الريبي في مزارع خلايا القراد ويوفر طريقة في المختبر لدراسة تفاعلات مسببات الأمراض لخلايا القراد.