التدخل في الحمض النووي الريبي القراد

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح تقنية تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNA interference) في القراد عن طريق الحقن. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تخليق RNA مزدوج السلسلة للجين أو الجينات المستهدفة. بعد ذلك، يُحقن الـ RNA في القراد، ثم تُحفظ الحشرات في غرفة رطوبة لمدة 24 ساعة.

بعد فترة الاحتجاز هذه، يُسمح للقرادات بالتغذية على حيوان مثل الأغنام في المرحلة النهائية. يتم تحديد معاملات التغذية مثل الوزن، والانسلاخ، ووضع البيض، والتعبير عن الجين أو الجينات المستهدفة ذات الأهمية بواسطة real-time R-T-P-C-R. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح تأثير إسكات الجينات المستهدفة على بيولوجيا القراد من خلال تقييم المعاملات البيولوجية للقراد والتعبير الجيني بواسطة real-time R-T-P-C-R.

تعمل مجموعتنا البحثية على دراسة القراد في محاولة لتوصيف الأحداث الجزيئية عند نقطة التفاعل بين القراد والمسبب المرضي، وذلك لاستخدام هذه المعلومات الأساسية في تطوير طرق للسيطرة على تفشي القراد وانتقال المسببات المرضية إلى البشر والحيوانات. وقد ظهر تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNA interference) كأداة أساسية في هذا البحث لأنه الطريقة الوحيدة المتاحة للتلاعب الجيني في القراد. ولا تزال وظائف العديد من جينات القراد غير معروفة.

يتيح تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNA interference) لنا تحديد دور جينات القراد والتعبير الجيني في العديد من جوانب بيولوجيا القراد، بما في ذلك التزاوج، والتكاثر، والتغذية، والهضم، ووظيفة الغدد اللعابية، وكفاءة القراد كناقل لنقل المسببات المرضية. سيقوم فريق تداخل RNA للقراد من مختبرنا، المكون من الدكتور Ed Lewin، وطالب دراسات عليا، وBusby، وأنا، بشرح هذا الإجراء. ولتوليد RNA مزدوج السلسلة، يتم أولاً تخليق بادئات قليلة النيوكليوتيد (oligonucleotide primers) تحتوي على تسلسلات محفز T7 للنسخ المختبري لـ RNA.

على سبيل المثال، مركز الجلد vari lesin. استخدم بادئات قليلة النوكليوتيد D eight A a T 75، و D eight DVT 73 الموضحة هنا. قم بتضخيم الجين المستهدف عن طريق R-T-P-C-R باستخدام 10 picomoles من كل بادئة قليلة النوكليوتيد ومن 1 إلى 10 nanograms من RNA الكلي للقراد.

بعد ذلك، قم بتنقية ناتج PCR. ثم استخدم 8 µL أو ما يقرب من 100 ng لتخليق RNA مزدوج السلسلة. ولتجهيز القراد للحقن أولاً، اغسل القراد في سلسلة المحاليل التالية: ماء الصنبور، و3% hydrogen peroxide، والماء المقطر مرتين، و70% ethanol، ثم غسلتين نهائيتين بالماء المقطر.

أجرِ كل عملية غسيل في أنبوب طرد مركزي مخصص للاستخدام مرة واحدة سعة 50 milliliter عن طريق الرج. بعد ذلك، صبّ المحلول من خلال شاشة سلكية ذات شبكة ناعمة. جفف القراد على مناشف ورقية، ثم وزع القراد في مجموعات تتراوح من 20 إلى 50 حسب التجربة.

ضع كل مجموعة في كوب بلاستيكي سعة 1.25 أونصة بغطاء محكم الإغلاق، وقم بتسمية كل كوب باسم المجموعة التجريبية. بعد ذلك، قم بتشكيل فريق RNAi يتكون من ثلاثة أشخاص لتنفيذ عملية الحقن. يقوم الشخص الأول بوضع كل قراد على شريط لاصق مزدوج مثبت على ورقة من شمع الأسنان الأحمر مقاس ثلاث في ست بوصات.

يقوم الشخص الثاني بحقن القراد، بينما يراقب الشخص الثالث القراد بعد الحقن، حيث يقوم بتعريضها لثاني أكسيد الكربون لتنشيطها، ثم يقوم بعدّ القراد الحي ونقله إلى أكواب تحمل ملصقات برقم المجموعة التجريبية. يجب على جميع أعضاء الفريق ارتداء قفازات تستخدم لمرة واحدة. لبدء عملية حقن القراد، يتم الإمساك بالقرادة باستخدام ملقط Dumont دقيق ووضعها بحيث يكون الجانب البطني للأعلى على شريط لاصق مزدوج مثبت على قطعة من شمع الأسنان الأحمر. يتم وضع القراد في مجموعات مكونة من خمس قرادت. ثم يوضع شريط صغير من شريط لاصق فوق أجزاء الفم لجميع القرادات الخمس.

من أجل مزيد من التثبيت، اترك معظم الجسم مكشوفاً بحيث يمكن للقائم بالحقن مراقبة عملية الحقن. ولحقن القراد، اصنع ثقباً في الربع السفلي الأيمن من السطح البطني للهيكل الخارجي باستخدام حقنة إنسولين أحادية الاستخدام مزودة بإبرة قياس 29 ومقاس نصف بوصة. بعد ذلك، احقن القراد فوراً بـ 0.2 إلى 0.5 µL من محلول RNA مزدوج الشريط باستخدام حقنة Hamilton مصنعة خصيصاً وإبرة قياس 33 ومقاس بوصة واحدة ذات سن مائل بزاوية 45 درجة، مع إدخال الإبرة جيداً في تجويف القراد لضمان وضع واستبقاء الـ RNA مزدوج الشريط.

على الرغم من تسرب السائل بعد الحقن، فإن الغرز العميق للإبرة عند الحقن يضمن ترسب كمية كافية من الـ double stranded RNA داخل تجويف القراد لإحداث إسكات جيني، ويجب توخي الحذر لتجنب الإفراط في الحقن، مما قد يؤدي إلى فقدان الليمف الدموي وموت القراد. فور الانتهاء من حقن القراد، يتم التقاطها من الشريط اللاصق المزدوج باستخدام ملاقط دقيقة ووضعها في حاوية بلاستيكية للاستعادة.

ستظل القراد غير نشطة لفترة وجيزة بعد الحقن، ولكن يجب أن تبدأ قريباً في الزحف حول الطبق. قم بتنشيط القراد عن طريق نفخ ثاني أكسيد الكربون عليها. بمجرد أن تصبح القراد زاحفة ونشطة، سيلتئم جرح الحقن بسرعة وسيكون من المرجح جداً نجاتها.

قم بعدّ القراد في كل مجموعة تجريبية وضع كل مجموعة في كوب بلاستيكي مُصنف بغطاء محكم الإغلاق. استبدل أي قراد يموت في المجموعة الحالية قبل حقن المجموعة التجريبية التالية. نظف محقنة Hamilton قبل حقن المجموعة التجريبية التالية عن طريق ملء المحقنة ثم تفريغها باستخدام بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 3% الطازج.

15 مرة، تليها 15 غسلة بالماء المعقم. احرص على عدم ثني مكبس حقنة Hamilton، وإلا فلن يتحرك المكبس بسلاسة ولن يستجيب للمسة الخفيفة المطلوبة لحقن القراد. بعد الحقن، ضع القراد في غرفة تحتوي على وعاء مملوء بالماء وكبريتات البوتاسيوم، مما يحافظ على رطوبة عالية لهم لمدة يوم واحد.

بعد ذلك، يتم وضع القرادات الفردية في خلايا تغذية ملصقة بجسم أغنام، مع السماح لها بالتغذي جنباً إلى جنب مع عدد مساوٍ من القرادات الذكور أو الإناث غير المحقونة، حسب الجنس الذي لم يتم حقنه. يتم جمع إناث القراد من خلية التغذية بعد إتمام عملية التغذي التي تستغرق حوالي 10 أيام، أو عند سقوط إناث المجموعة الضابطة من المضيف. تُحضن كل مجموعة من القرادات في غرفة الرطوبة حتى اكتمال عملية وضع البيض. يتم تقييم وضع البيض لكل مجموعة عن طريق وزن كتلة البيض التي أنتجتها جميع القرادات في المجموعة لتقييم النمط الظاهري للقراد بعد التغذية.

حدد عدد القراد الذي نجا واحسب وزن القراد بالإضافة إلى موضع البويضات وخصوبة البيض. وبناءً على الجين المستهدف وأهداف الدراسة، يمكن إجراء تحليلات أخرى لتأكيد إسكات الجين بواسطة R-T-P-C-R. بعد التغذية، قم بتشريح الغدد اللعابية والأمعاء من عينات فردية من القراد من مجموعات الحقن الضابطة ومجموعات الحقن بالـ RNA مزدوج الشريط، ثم استخلص الـ RNA الكلي من عينات الأنسجة الفردية.

قم بتحليل نسخ الجين المستهدف في الأنسجة الفردية باستخدام تقنية real-time R-T-P-C-R، وقم بتطبيع مستويات RNA مقابل 16 s ribosomal RNA الخاصة بالقراد. باستخدام طريقة gene norm، قم بتشغيل منحنيات التفكك في نهاية التفاعل للتأكد من تكوّن ناتج تضخيم (amplicon) واحد فقط، وأن نواتج التضخيم تتفكك باستمرار في نفس النطاق الحراري لكل عينة، ثم قارن قيم CT المطبّعة لمستويات mRNA بين القراد المحقون بمجموعة التحكم والقراد المحقون بـ double stranded RNA باستخدام اختبار t لـ student.

لقد تم استخدام البروتوكول الموصوف هنا في مختبرنا لتطبيق تقنية RNAi في العديد من أنواع القراد المختلفة. وتختلف كمية الـ RNA مزدوج السلسلة التي يتم حقنها في القراد وفقاً لحجم القرادة، حيث يمكن لأنواع القراد الأكبر حجماً استيعاب حجم أكبر.

يمكن العثور على المراجع في الجزء المكتوب المرفق من البروتوكول. إذا تم تنفيذ البروتوكول بشكل صحيح، يجب أن تكون نسبة الوفيات الناتجة عن إجراء الحقن أقل من 5% بعد مرور 24 ساعة. يظهر هنا النمط الظاهري النموذجي بعد تثبيط الجينات في القراد، حيث تم حقن مجموعة من القراد بتجمعات من الحمض النووي الريبي مزدوج السلسلة (dsRNA) التي استُخدمت لفحص مستضدات الحماية في القراد.

في القراد التي يتم فحصها بالمجهر الضوئي، يمكن ملاحظة تنكس خلوي في أنسجة القراد. وقد تصاحب التغيرات المظهرية فقدان في الوظيفة. على سبيل المثال، يؤدي تداخل الحمض النووي الريبي (RNAI) لـ SUBIN إلى إنتاج ذكور عقيمة لا يمكنها التزاوج بنجاح مع الإناث في أعقاب تداخل الحمض النووي الريبي في القراد.

يمكن استخدام طرق أخرى لتحديد تأثير إسكات الجينات على التعبير الجيني والبروتيني وعلى بيولوجيا القراد، بما في ذلك تقنية real-time R-T-P-C-R، أو المجهر الإلكتروني الضوئي أو المجهر البؤري، أو علم الجينوم أو علم البروتينات. كما يمكن إجراء تداخل الـ RNA في مستنبتات خلايا القراد، مما يوفر طريقة في المختبر لدراسة التفاعلات بين خلايا القراد ومسببات الأمراض.