السيليكون لمعالجة الرقائق خلية خلية التفاعل

مرحبا ، أنا إليوت هو ، أنا زميل ما بعد الدكتوراه في مختبر تيا هنا في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا. سنقوم اليوم بإعداد مزارع الخلايا على رقائق ميكانيكية دقيقة من السيليكون. تبدو الأجهزة وكأنها أمشاط صغيرة تغلق معا وتسمح لنا بمعالجة التفاعلات بين مجموعتين مختلفتين من الخلايا بدقة.

اليوم سوف ندرس التفاعل بين خلايا الكبد والخلايا اللحمية الداعمة. على وجه التحديد ، يتم زراعة ثلاث خلايا من الخلايا الليفية على السطح العلوي للأمشاط ، بحيث يمكنك تحريك الخلايا وتغيير ترتيبها المكاني عن طريق تحريك أصابع المشط ينقسم كل جهاز إلى جزأين يلتصقان معا في تكوينين محتملين.

الأول يجلب مجموعتي الخلايا على اتصال مع بعضهما البعض. والثاني يفصل بين المجموعتين قليلا حتى لا تتمكن الخلايا من اللمس. هنا ، يتم منع تفاعلات الاتصال ، ولكن يتم الحفاظ على التفاعلات من خلال العوامل المفرزة.

لنبدأ بالحديث عن كيفية التعامل مع الأجزاء باستخدام الملقط. أحب استخدام كل من ملاقط التفلون الأكبر حجما بالإضافة إلى ملاقط معدنية ذات طرف دائري أصغر. باستخدام الملقط الأكبر حجما ، يمكنك التقاط الأجزاء الموجودة على الحواف مثل هذه مع الأجزاء الأكبر مع الذراعين ، عليك أن تكون حريصا على عدم كسر الذراعين لأنها هشة للغاية.

لذلك تريد التقاطها في الجزء الخلفي من الجزء مثل هذا. باستخدام الملقط المعدني ، يمكنك الوصول إلى الحفرة والتقاط الرقائق مباشرة. سوف تتناسب الأجزاء الأكبر مع جدار من لوحة 12 بئر ، في حين أن الأجزاء الأصغر سوف تتناسب مع لوحة 24 بئر أو يمكن إقرانها بالجزء الأكبر.

في لوحة 12 بئر ، عادة ما أستخدم الملقط المعدني. عندما أتعامل مع الأجزاء الموجودة في الألواح لربط جزأين معا ، عادة ما أضع الجزء الأكبر في البئر أولا وأدفعه إلى جانب واحد. ثم آخذ الإصلاح المجاني وأضعه على الجانب الآخر من البئر ، ودفعتهم معا عن طريق أخذ ملاقطين واحدة في كل حفرة.

حتى الآن يمكنني فقط قفل الأجزاء معا ، إما في تكوين الفجوة أو تكوين جهة الاتصال. إذا كنت أرغب في تفكيك الأجزاء ، فأنا أحب سحب الأجزاء إلى تكوين الفجوة ثم سحبها عموديا لإزالة الجزء. الآن الأجهزة مصنوعة من السيليكون ، لذلك يجب أن تكون مغلفة للسماح بالالتصاق الصحيح للخلية.

من المحتمل أن تتلقى الأجهزة المطلية بالفعل بالبوليسترين والبلازما المعالجة ، لذلك سنفترض أن هذه هي نقطة البداية. بادئ ذي بدء ، سنستخدم الكولاجين لتغطية السطح الذي ستلتصق به خلايا الكبد. سنضع أمشاط خلايا الكبد في 50 ميكروغراما لكل مطحنة كولاجين ، محلول واحد ، ونحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.

ناحية أخرى ، لا نحتاج إلى تغطية الأمشاط الليفية. بعد الحضانة ، نشنشق محلول الكولاجين ونغسله والماء. الآن سنقوم بقفل ES معا عند ملامسة الأجزاء المجانية بحيث نشكل سطحا مستويا لتلقيح الخلايا.

أولا ، سنملأ بعض الآبار بنسبة 70٪ من الإيثانول. سأضع زوجا في كل بئر ثم أغلقهما معا. بعد القفل معا ، نريد أن ننظر إلى الأجزاء الموجودة تحت المجهر للتأكد من وجود متطابقين.

من حين لآخر يمكن أن تقفل الأجزاء معا بشكل غير محاذا. وعلى المجهر سترى أنهما على مستويين بؤريين مختلفين. في هذه الحالة ، ما عليك سوى فصل الأجزاء ودفعها معا مرة أخرى بعد التحقق من أن المحاذاة جيدة ، نترك الأجزاء تجلس في الإيثانول لفترة من الوقت لتعقيمها.

غالبا ما أكون في عجلة من أمري ، لذلك أنقع لمدة 10 دقائق. بعد التعقيم ، نحتاج إلى شطفها. يشنش الإيثانول جيدا ويغسل في الماء ، ثم يستنشق ويغسل بالماء مرة أخرى ، وأخيرا يستنشق الماء ويستبدله بوسائط الثقافة الخاصة بك.

الآن دعنا نزرع الخلايا على الأجهزة. عادة ، نقوم بتعليق الخلايا بتركيز 500 ، 000 خلية لكل مليلتر ، ونضع ماصة واحدة من المليلتر المعلق فوق كل زوج من المشط باستخدام صفيحة 12 بئر. لذلك قمنا بزرع الخلايا الليفية في 500،000 خلية لكل مليلتر في اثنين من الآبار.

وبالمثل ، أخذنا تعليقا قدره 500،000 خلية كبدية لكل بئر وزرعناها في البئرين الآخرين. الآن ، قبل الحضانة ، سنقوم بهز الخلايا جيدا للتأكد من توزيعها بالتساوي. وأحب أن أهز ثلاث مرات عموديا ، وثلاث مرات أفقيا ، ثم أكرر هذا ثلاث مرات.

بعد الاهتزاز ، سنضعها في الحاضنة وسنترك الخلايا تجلس لمدة 15 دقيقة ، وعند هذه النقطة سنهزها مرة أخرى. بعد الاهتزاز كل 15 دقيقة لمدة ساعة واحدة ، سنقوم بعد ذلك بسحب تعليق الخلية واللعب على تعليق جديد للخلايا. وسنكرر هذا حتى نحصل على طبقة ملتقية من الخلايا.

عادة مع الخلايا الليفية ، يأخذ مقعدا أو مقعدين. ومع خلايا الكبد ، يمكن أن يستغرق الأمر من مقاعدين إلى أربعة مقاعد. للحصول على طبقة أحادية التقاء ، تجلس الخلايا بكثافة عالية إلى حد ما ، وتهتز ، وتضمن توزيع الخلايا بالتساوي.

بعد الجلوس الأول ، تتشكل طبقة متفرقة من الخلايا. لاحظ أن الخلايا تلتصق فقط بالأصابع المغلفة بالبوليسترين والكولاجين. بعد زرع الخلايا الطازجة واحتضانها لمدة ساعة أخرى ، مرة أخرى مع الاهتزاز كل 15 دقيقة ، تزداد كثافة طبقة الخلية.

بعد البذر الثالث ، لدينا كثافة خلوية جيدة ، والآن يمكننا التوقف بعد زرع الخلايا على الأمشاط. نريد معالجة الخلايا في التكوين التجريبي المطلوب. يتم الآن فصل الأجهزة عن أجزائها التكميلية واحتضانها لمدة 24 ساعة.

بعد 24 ساعة ، انتشرت الخلايا لتشكيل طبقة أحادية ملتصقة على سطح الأمشاط. الآن نريد تكوين ثقافة مشتركة. يتم الآن نقل مشط الخلايا الكبدية ومشط الخلايا الليفية إلى نفس البئر ويتم تثبيتها معا في التكوين الأولي المطلوب.

إذا رغبت في ذلك. بعد فترة زمنية معينة ، يمكنك تغيير التكوين. على سبيل المثال ، يمكننا الانتقال إلى تكوين الفجوة بعد 18 ساعة ، ويتم وضع الأجزاء في نفس الوقت ، ويتم دفعها جيدا معا حتى يتم الوصول إلى تكوين الفجوة ثم دفعها إلى التلامس مرة أخرى في تكوين الفجوة.

والآن سنقوم بإزالة مشط واحد. ما سنفعله الآن هو أننا سنمر بعملية تجريد الطلاء القديم من البوليسترين ، وتنظيف الرقائق ، ثم وضع طلاء جديد من البوليسترين وإعداده لزراعة الخلايا. مرة أخرى ، من خلال تجريد طلاء البوليسترين القديم ووضع طبقة جديدة ، نضمن عدم تداخل أي من تاريخ التجربة السابقة مع تجربة جديدة.

لذلك بعد الانتهاء من تجربتك ، أول شيء تريد القيام به هو تبييض خلاياك ثم شطف الأمشاط والماء. لذا قبل وضع الرقائق في أصابع القدم ، فأنت تريد التأكد من أنها جافة تماما. لذلك لدينا هنا عدد قليل من الأمشاط التي تركتها للتو لتجف في الهواء لفترة من الوقت والتحقق من أنها جافة تماما.

والآن سنأخذ بعض أصابع القدم ونضعها في هذه السماعة الزجاجية. سنستخدم ماصة زجاجية هنا حتى لا نذوبها. يذيب الهالوين البلاستيك ، لذلك لا يمكننا استخدام ماصة البوليسترين النموذجية.

حسنا ، هذا يكفي. والآن سنأخذ جزأين من هذه الأجزاء، ونضعهما في إصبع القدم، وسأقوم بتشغيل شاكر لتحريكه، وسنقوم بتغطيته بورق الألمنيوم لمنع التولوين من التبخر. لذلك بعد ساعتين ، يجب أن يذوب التولوين معظم البوليسترين على الأمشاط ، ويمكننا فقط سحبها وتجفيف الأمشاط بالهواء.

بعد شطف الهالوين ، يجب أن تكون الأجزاء خالية نسبيا من البوليسترين ويجب أن تكون نظيفة نسبيا. ومع ذلك ، نحتاج إلى أن تكون الأجزاء نظيفة للغاية بحيث تشكل الطبقة الجديدة من البوليسترين التصاق جيد إذا لم تكن نظيفة للغاية. يميل البولي تي إلى التقشر في منتصف التجربة عندما تبدأ الخلايا في سحبه.

لذا ما سنفعله الآن هو تنظيف حمض سمكة الضاري المفترسة. لقد وضعت الأجزاء في مكبر صوت زجاجي وسنقوم بتسخين هذا. لذلك سنضع طبقا ساخنا.

وهنا لدينا حمض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين. سأسكب حمض الكبريتيك أولا ، وهنا ، تأكد من غمر جميع الرقائق تحت السائل. في بعض الأحيان لديهم ميل إلى الطفو.

والآن أيضا بعد أن عملنا مع مواد كيميائية مسببة للتآكل ، تأكد من أنك ترتدي معدات الحماية المناسبة. هنا. أنا أرتدي قفازات النتريل. الآن سنسكب بيروكسيد الهيدروجين في الحمض وننتبه هنا لأنه تفاعل طارد للحرارة.

لذا يمكنك أن ترى أنه يدخن قليلا أثناء تفاعله ، لكننا نريد إضافة بعض الطاقة إلى النظام لجعله أكثر تفاعلا. لذا سنقوم الآن بتسخينه حتى 120 درجة مئوية عند حوالي 20 الآن ، لذلك يمكنك أن تطمئن إلى أن أي بقايا من مزرعة الخلايا الخاصة بك سيتم تنظيفها تماما من رقائقك. إذن، في هذه المرحلة، يجب أن تدع التفاعل يسير على كامل مساره حتى يتم استهلاك بيروكسيد الهيدروجين بالكامل.

وعند هذه النقطة ، سيتوقف الخليط عن الغليان. لذا فإن التفاعل يستغرق حوالي نصف ساعة لأخذ مجراه. وبعد التوقف عن رؤية الفقاعات ، يمكنك فقط إيقاف تشغيل اللوح الساخن وتركه يبرد.

وسنقوم بنقلها إلى مياه منحنى BAK. ومرة أخرى ، تأكد من أنك تستخدم ملاقط تفلون هنا ، وليس معدنا ، ويمكنك فقط التقاطها ونقلها. حتى الآن سنقوم بشطفه تحت تيار مستمر من DDH two O.I عادة ما آخذه مباشرة من Meine وسنتركه يعمل لمدة 10 دقائق على الأقل هنا.

وبالقيام بذلك، سنغسل كل آثار الحمض بعد فرمه تحت تيار من الماء لمدة 10 دقائق. يجب إعادة إزالة الحمض من الرقائق ، وسنقوم فقط بتخزينه تحت الماء حتى الوقت الذي نكون فيه مستعدين لتغليف البوليسترين 45 ، 000 الوزن الجزيئي للبوليسترين الذي حصلنا عليه من سيجما. وسنزن كمية صغيرة منه هنا.

لدينا 400 ملليغرام وسنذوبها في تولوين بمعدل 100 ملليغرام لكل ملليلتر. لذلك يجب التعامل مع التولوين في غطاء المحرك. والشيء الآخر هو أنه بما أننا سنستخدم التولوين لإذابة البوليسترين ، نريد التأكد من أننا لا نستخدم أي ملابس معملية مصنوعة من البوليسترين.

لذلك نحن هنا نستخدم البولي بروبيلين والمخروطية والماصة الزجاجية. وبما أن لدي 400 ملليغرام من البوليسترين، سأضع أربعة ملليلترات من أصابع القدم، والآن سندورها لمدة نصف ساعة حتى يذوب البولي ستايرين. والآن سنعكف على دوامة الأنبوب بأقل سرعة لمدة 20 دقيقة إلى نصف ساعة تقريبا.

لذلك سأقوم بتوصيل الأنبوب بالدوامات. لست مضطرا للاحتفاظ بها هناك طوال الوقت. بعد 20 إلى 30 دقيقة ، يجب إذابة البوليسترين ونحن على استعداد لتغطيته.

الآن سنقوم بتدوير البوليسترين في منشأتنا. مبرمج الدوران الخاص بنا موجود في منشأة غرفة نظيفة. وهنا علينا ارتداء نظارات واقية من الغطاء ، وثوب ، وجوارب ، وقفازات ، ولكن قد لا يكون هذا هو نفسه في منشأتك.

قبل أن نستخدم هذا الظرف ، أريد حمايته من البوليسترين. لذلك سنقوم بتغطيته بورق الألمنيوم ، ونريد أن نجعله مسطحا قدر الإمكان على السطح حتى تتمكن الشريحة من الجلوس على السطح. سنقوم بعمل ثقب صغير في المنتصف مباشرة حتى نتمكن من الاحتفاظ بفراغ على الشريحة.

تم ضبط مبرمج الدوران على 2 ، 400 دورة في الدقيقة و 30 ثانية. الآن يمكننا أن نأخذ إحدى رقائقنا ، ونضعها بحيث يغطي مركز الشريحة الفتحة ، وسأقوم بإيقاف تشغيل المكنسة الكهربائية في البداية عندما أضع البوليسترين ، وأشغل المكنسة الكهربائية ، ثم أبدأ الدوران. إذن، بالنسبة للأجزاء الأصغر، يمكننا وضع أقل من 10 قطرات.

وبالنسبة للأجزاء الأكبر ، يستغرق الأمر أكثر بقليل من 10 قطرات من البوليسترين. وسنقوم بتدويرها لمدة 30 ثانية عند 2,400 دورة في الدقيقة. الآن سنأخذ الرقائق المطلية بالبولي ستايرين ونضعها في الفرن عند 120 درجة مئوية ، وهذا أعلى من نقطة التزجج للبوليسترين.

لذلك سيقوم بإعادة تدفق السطح لتنعيمه قليلا ، كما أنه سيكثف البلاستيك ويصلبه. لذلك عادة ما أتركه في الفرن طوال الليل. ربما يستغرق الأمر بضع ساعات على الأقل حتى تكتمل العملية.

لذلك بعد الخبز طوال الليل ، تكون الرقائق جاهزة للعلاج بالبلازما. الآن سنقوم بتعريض البوليسترين لبلازما الأكسجين، وهذا سيغير الطاقة السطحية بحيث تلتصق البروتينات والخلايا به بشكل أفضل. لذلك سنقوم فقط بتحميل الرقائق في حجرة البلازما وضخها إلى الفراغ.

الإعداد الجيد للاستخدام هو 200 مل ، جولة من الفراغ و 200 واط من الطاقة لمدة دقيقة واحدة تحت تدفق غاز الأكسجين. والآن بعد أن تم ضخ النظام، سنقوم بإدخال الأكسجين. حسنا ، يمكننا الآن تشغيل طاقة التردد اللاسلكي ، وضرب البلازما لمدة دقيقة واحدة.

لذلك عندما تعمل البلازما ، فإنها تتوهج بالفعل. إنه مثل مصباح الفلورسنت. بعد دقيقة واحدة من التعرض للبلازما ، سنعيد الضغط إلى الغلاف الجوي ويمكننا سحب الأجزاء للخارج.

الآن الأجزاء جاهزة لطلاء البروتين وتغذية الخلايا. كان الهدف من تصميم هذا الجهاز هو أن نكون قادرين على معالجة الهندسة المعمارية الدقيقة للأنسجة بطريقة ديناميكية. لذا فإن التنظيم الدقيق للأنسجة في الجسم ، وتحديدا حيث يتم وضع الخلايا فيما يتعلق ببعضها البعض ، مهم جدا في تحديد وظيفة كل خلية معينة في الثقافة المختبرية.

حتى وقت قريب ، لم نتمكن من القيام بعمل جيد في تكرار ذلك ، ولكن على مدى السنوات الخمس أو العشر الماضية ، بدأ الناس في القدرة على نمط الخلايا الدقيقة على ركيزة زراعة الأنسجة ، وبالتالي وضع الخلايا في المكان الذي نريد أن نحصل عليه بالضبط في لوحة زراعة الأنسجة. ومن خلال القيام بذلك ، تمكنا من اكتشاف بعض الجوانب المهمة لعلم الأحياء الأساسي لتفاعلات الخلايا الخلوية على النطاق الجزئي. الآن ، ما لم نتمكن من القيام به حتى هذه اللحظة هو القيام بذلك ديناميكيا.

هذا هو تغيير تنظيم ثقافة الخلية في منتصف التجربة. وهذا مهم لأنه في الجسم ، لذا فإن الأنسجة ليست في الواقع بيئة ثابتة. لدينا خلايا تتحرك وتعيد تنظيمها ، لا سيما في التئام الجروح أو تطورها.

ولكن حتى في العضو الطبيعي في التوازن ، هناك الكثير من الأشياء التي تتحرك. أصعب جانب تقني للتعلم هو كيفية تناول الأجزاء جسديا. وفي البداية عندما تبدأ العمل مع النظام ، قد تخاف من مدى هشاشة الأجزاء أو مدى صغر المشاعر التي تحتاج إلى صنعها.

لكنني أعتقد أنه إذا تدربت معها لفترة قصيرة ، فلن تواجه الكثير من المتاعب. بعض الأماكن التي نرى فيها هذا الجهاز يلعب دورا ، على سبيل المثال ، في التطور الجنيني ، ستتلامس الخلايا مع سلسلة من بيئات الخلايا المختلفة حيث تتبرعم الخلايا من خلال طبقات جنينية مختلفة. ومن المعروف أن التفاعلات مع كل طبقة من الطبقات عند ملامستها بالتتابع ، تدفعنا جميعا إلى أبعد من ذلك على طول مسار تمايز محدد.

ولذا نعتقد أن هذا النوع من الأجهزة قد يكون مفيدا لمحاولة تكرار هذا النوع من الأحداث في المختبر. كان أحد جوانب التنظيم الجزئي الذي أردنا النظر إليه بشكل خاص هو الاختلاف بين الخلايا التي تتواصل من خلال تفاعلات التلامس حيث يمكن لأغشية الخلايا أن تلامس بعضها البعض ، مقابل العوامل القابلة للذوبان التي تفرز في الوسائط المحيطة التي تنتشر إلى خلية أبعد قليلا. وفي كثير من الأحيان عندما تكون الخلايا في ثقافة مشتركة ولها تأثير على بعضها البعض ، لم يكن من الواضح ما إذا كانت هذه تفاعلات اتصال أم لا أو عوامل مفرزة تلعب الدور أم لا.