الزخرفة الخلية على Photolithographically معرفة Parylene-C: شافي ₂ ركائز

يصف هذا البروتوكول على طريقة التصنيع الدقيق تتلاءم مع الزخرفة الخلية على شافي _2. يتم طباعة المعرفة مسبقا تصميم parylene-C photolithographically على شافي ₂ رقائق. بعد الحضانة مع المصل (أو حل التنشيط الأخرى) الالتزام الخلايا على وجه التحديد (وتنمو وفقا لمطابقة) الكامنة parylene-C، في حين يجري صدت من قبل شافي ₂ المناطق.

الهدف العام من هذا الإجراء هو نقوش الخلايا على خدمات ثاني أكسيد السيليكون وفقا لتصميم أساسي محدد مسبقا للبارالين. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء قناع صور للنمط المطلوب أولا. الخطوة الثانية هي أكسدة ثم طلاء رقاقة السيليكون بالبارالين.

بعد ذلك ، يتم استخدام العمليات الحجرية الضوئية التي يتم إجراؤها في منشأة غرفة نظيفة للإلكترونيات الدقيقة لحفر طلاء البارالين بشكل انتقائي للكشف عن التصميم المطلوب. الخطوة الأخيرة هي تنشيط الرقائق باستخدام حمض البيرانا أولا ثم احتضانها في مصل ربلة الساق الجنينية لمدة ثلاث إلى 12 ساعة وبعد ذلك يمكن تطبيق تعليق الخلية للزراعة. في النهاية ، يمكن تقييم زخرفة الخلايا إما عن طريق تصوير الخلايا الحية باستخدام مجهر تشريح أو بعد التثبيت باستخدام الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على العديد من منصات زخرفة الخلايا الحالية هي أنه ليست هناك حاجة لإحضار عوامل بيولوجية إلى الغرفة النظيفة. أيضا ، يمكن الاحتفاظ برقائق الأنماط إلى أجل غير مسمى حتى يتم تنشيطها باستخدام حمض الاسمية أولا ثم المصل. لتصميم تكوين Paraline C المطلوب ، استخدم حزمة برامج محرر التخطيط القادرة على قراءة ملفات CIF أو GDS أو كتابتين.

الاستعانة بمصادر خارجية لمصنع قناع الصور إلى منشأة إلكترونيات دقيقة مناسبة أو صنعها داخليا. إذا كانت المرافق موجودة ، فقم بأكسدة رقاقة السيليكون في فرن أفقي في الغلاف الجوي عند 950 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة لإنتاج طبقة ثاني أكسيد السيليكون 200 نانومتر. بعد ذلك ، قم بتأكيد السماكة ببقعة صغيرة.

مقياس الانعكاس الطيفي. ضع الرقائق في نظام ترسيب الفراغ ، وقم بتطبيق محفز التصاق الجيبية على الجزء الداخلي من غطاء الغرفة. أثناء دورة المضخة لأسفل ، يقوم محفز الالتصاق الجيبي بتغطية البارالين لحمل الرقاقة المؤكسدة في رواسب الفرن Paraline C عند درجة الحرارة المحيطة بمعدل 1.3 نانومتر لكل ملليغرام من ثنائي باستخدام نظام ترسيب الفراغ.

بعد ذلك ، مروج التصاق HMDS على الرقاقة المطلية بالبارالين. باستخدام نظام طلاء مناسب لمقاومة الصور ، قم بتدوير الرقاقة عند 4 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية مع تطبيق مقاومة الصورة الإيجابية من أجل الحصول على سمك ميكرون واحد باستخدام نظام الطلاء المقاوم للصور ، ثم اخبز الرقاقة لمدة 60 ثانية عند 90 درجة مئوية. أدخل الآن كل من الرقاقة وقناع الصور المصنع مسبقا في مقويم القناع.

قم بتعريض الرقاقة المطلية بمقاومة للضوء بضوء الأشعة فوق البنفسجية لنقل النمط المطلوب إلى مقاومة الضوء. بعد ذلك ، اخبزي الرقاقة المكشوفة لمدة 60 ثانية عند 110 درجة مئوية. ثم قم بإزالة جميع مقاومة الضوء المكشوفة من الرقاقة عن طريق تطويرها في حل مطور مناسب في Hoff ، البارالين غير المحمي باستخدام نظام حفر بلازما الأكسجين للكشف عن ثاني أكسيد السيليكون الأساسي.

ثم قم بتخزين الرقائق بعد تقطيعها إلى مكعبات في صناديق خالية من الغبار لحين الحاجة. في هذا الإجراء ، قم بإزالة المقاومة الضوئية المتبقية من الرقائق عن طريق غسل الأسيتون لمدة 10 ثوان. ثم اشطفها في H2O المقطر منزوع الأيونات ثلاث مرات ، واصنع حمض البيرانا الطازج في غطاء دخان حمضي بعد ذلك ، ونظف الرقائق وحفرها عن طريق الغمر في حمض البيانا لمدة 10 دقائق.

ثم اشطف الرقائق ثلاث مرات في H2O منزوع الأيونات وانقلها إلى طبق ثقافة معقم في غطاء مزرعة الأنسجة ذات التدفق الرقائقي. قم بتنشيط الرقائق لزخرفة الخلايا عن طريق وضع شريحتين لكل بئر في صفيحة من ستة آبار. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من مصل الأبقار الجنيني لغمر جميع الرقائق بالكامل.

احتضان الرقائق في المصل لمدة ثلاث إلى 12 ساعة عند 37 درجة مئوية. الآن قم بإزالة الرقائق من حل التنشيط الخاص بها. يغسل مرة واحدة لمدة 10 ثوان في محلول الملح المتوازن من هانك.

ثم ضع الرقائق في بئر مزرعة وقم بلوحة نوع الخلية المختارة كتعليق في وسط النمو المعتاد. تعتمد كثافة طلاء الخلية المثلى على نوع الخلية والنمط الهندسي للبارالين C على الرقاقة. كثافة خمسة في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل مليلتر هي نقطة انطلاق معقولة.

تم تصميم التصوير وفقا للدافع الأساسي لزخرفة الخلايا ، ولكن يمكن بسهولة تقييم سلوك الخلايا الحية باستخدام مجهر تشريح وكاميرا رقمية مع عدسة ترحيل مناسبة. فيما يلي تصوير الخلايا الحية لخلايا HEC 2 93 المزروعة على ثاني أكسيد السيليكون البارالين C بعد ثلاثة أيام. في المختبر ، تم تحضين السفن لمدة ثلاث ساعات في مصل الأبقار الجنينية ، وتم طلاء الخلايا في معلق بتركيز خمسة في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل مليلتر.

يعزز Paraline C التصاق الخلايا بينما يصد ثاني أكسيد السيليكون العاري الخلايا. يوضح هذا الشكل صور التألق المناعي للخلايا الشبيهة بالجذع المشتقة من الورم الدبقي البشري الأولي التي نمت على أنماط مختلفة من البارالين C على ثاني أكسيد السيليكون. يوضح التخطيطي هنا تصميم الخط الشبكي ، والصورة المجهرية الفلورية للخلايا الثابتة الملطخة بالبروتين الحمضي الليفي الدبقي ، والصورة المجهرية الضوئية للخلايا الحية على نفس الشريحة.

فيما يلي صورة فلورية توضح الخلايا الملطخة ب GFAP على تصميم بارالين مختلف وصورة انعكاس العقدة في تصميم البارالين المتحدث. ويوضح هذا الشكل تصوير الخلايا الحية لثلاث خلايا T وثلاث L واحدة مستزرعة على ثاني أكسيد السيليكون البارالي C. بعد أربعة أيام في المختبر ، تم تنشيط الرقائق لمدة ثلاث ساعات في مصل الأبقار الجنينية ، وتم طلاء الخلايا في تعليق بتركيز خمسة في 10 من الخلايا الرابعة لكل مليلتر.

في هذه الحالة ، لا تتيح المنصة الزخرفة مع الخلايا التي تصبح متساوية في مناطق Lene C وثاني أكسيد السيليكون. عند إجراء هذا البروتوكول ، من المهم أن تتذكر أن تنشيط المصل يجب أن يحدث مباشرة بعد علاج سمكة الضاري المفترسة. يؤدي عدم القيام بذلك إلى تقويض عملية الزخرفة.

لا تنس أن العمل مع حمض البيرانا يمكن أن يكون خطيرا للغاية. قم بإعداد واستخدام حمض سمكة البيرانا في غطاء الدخان الكيميائي وتأكد من ارتداء نظارات واقية ومعاطف مختبر وقفازات مناسبة.