اكتشاف الجزيئية البيولوجية توظيف الانعكاس التداخل التصوير الاستشعار (IRIS)

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس كمية ارتباط الأجسام المضادة بالمستضدات المثبتة على السطح باستخدام منصة استشعار حساسة وخالية من الوسم تسمى Iris. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير مصفوفة من مسابير الاختبار والضبط على سطح موحد من ثاني أكسيد السيليكون المعالج كيميائيًا لالتقاط البروتينات المستهدفة من المحلول. ويمكن أن تكون المسابير المثبتة أجسامًا مضادة أو مستضدات، أو DNA أو RNA، أو أي نوع آخر من الجزيئات الكبيرة المتوافقة مع كيمياء الأسطح الوظيفية أو البوليمرية أو السطحية.

يتم بعد ذلك تحضين المصفوفة الدقيقة المُجهزة مع عينة تحتوي على البروتينات المستهدفة، مما يسمح بحدوث الارتباط في ظل ظروف يحددها الباحث. بعد ذلك، يتم تصوير مصفوفة المستشعرات بأكملها عند أطوال موجية مختلفة من الضوء. وفي نظام IRIS، تتم معالجة شدة الضوء المنعكس لكل بكسل باستخدام خوارزميات مبرمجة خصيصاً.

من أجل قياس كمية المادة الحيوية المرتبطة بكل حالة اختبار أو حالة ضابطة، يتم الحصول على نتائج ما بعد الحضانة التي تظهر الكشف الفعال والتقدير الكمي المطلق للأجسام المضادة في خليط معقد استنادًا إلى قياسات التداخل الضوئي الخالية من الوسوم الخاصة بهذا النظام. وبناءً على أكثر من عقد من البحث والتطوير في مجال التداخل البصري وأجهزة تجاويف الراتنج، قمنا بتطوير هذه الطريقة الجديدة التي يمكن أن تتغلب على العديد من المشكلات المربكة التي واجهناها في أنظمة المستشعرات الحيوية السابقة الخالية من الوسوم. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرًا بالغ الأهمية لأن خطوات جمع البيانات تتطلب التطبيع الصحيح واتباع إجراءات مراقبة الجودة، وذلك لضمان الحصول على بيانات دقيقة وقابلة للتكرار.

لتغطية ركائز ثاني أكسيد السيليكون بطبقة من بوليمر dmma NAS ذاتي الامتصاص، قم أولاً بتحضير المحلول البوليمري عن طريق إضافة 100 milligrams من البوليمر إلى 5 milliliters من الماء منزوع الأيونات. ثم أضف 5 milliliters من كبريتات الأمونيوم المشبعة بنسبة 40% للوصول إلى تركيز نهائي من كبريتات الأمونيوم يبلغ 0.92 molar. اغمر الرقائق في المحلول البوليمري لمدة 30 minutes على جهاز هزاز بعد عملية الحضن.

اشطف الرقائق جيداً بالماء منزوع الأيونات، وجففها باستخدام غاز الأرجون أو النيتروجين، ثم قم بتجفيفها حرارياً عند 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تُخزن الرقائق ذات الركائز المطلية بالبوليمر في بيئة جافة مثل المجفف الفراغي لمدة تصل من شهرين إلى ثلاثة أشهر حتى تبدأ إجراءات تنقيط المسبار لتخفيف كل مسبار. أولاً، حدد الحجم الصحيح من المحلول المخزون للمسبار والمحلول المنظم للوصول إلى التركيز النهائي المطلوب.

تستخدم التجربة النموذجية المستضد أو IgG بتركيز 0.5 mg/mL في محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)، حيث يتم إضافة الكمية المحسوبة من كل محلول مخزون للمسبار إلى أنابيب "eend orph" صغيرة تحتوي على الكمية المطلوبة من محلول PBS المنظم، مع خلط المحاليل جيداً. بعد ذلك، يتم نقل محاليل المسبار باستخدام الماصة إلى لوحة ذات 96 بئراً منخفضة الارتباط بالبروتين، والتي ستُستخدم كلوحة مصدر لجهاز التنقيط (spotter). أخيراً، يتم ضبط معاملات التنقيط للمصفوفة المطبوعة عن طريق تحديد عدد المكررات لكل حالة في كل شبكة.

تحدد تخطيطات الشبكة عدد الشبكات المتكررة وموقع التنقيط المطلوب على الشريحة. ضع الركيزة ولوحة المصدر في جهاز التنقيط، ثم تحقق من زجاجات النفايات والإمداد. ابدأ عملية الطباعة.

بعد الانتهاء من عملية التنقيط، ضع الركيزة في بيئة عالية الرطوبة طوال الليل للسماح بعملية التثبيت وإبطال المفعول بالاستمرار بعد التحضين. اغسل الركائز مع التقليب عن طريق وضع الشريحة أولاً في محلول PBS مع 0.1%tween لمدة ثلاث دقائق، وتكرار ذلك ثلاث مرات منفصلة. اتبع ذلك بثلاث عمليات تحضين لمدة ثلاث دقائق في محلول PBS ثم في الماء منزوع الأيونات.

في حال إجراء قياس جاف، جفف الشريحة تماماً باستخدام غاز الأرجون. قم بإلغاء تنشيط مجموعات NHS المتبقية على سطح البوليمر المشترك عن طريق غمر الشرائح في محلول إيثانول أمين بتركيز 50 millimolar مع ضبط pH عند 7.4 لمدة 30 دقيقة أثناء وضعها على لوح الهزاز. اشطف الإيثانول أمين جيداً باستخدام PBS ثم الماء منزوع الأيونات قبل البدء في إجراء الحضن.

قم بتحضير محلول من البروتين المستهدف بتركيز مناسب في محلول PBS لهذا العرض التوضيحي. يُستخدم تركيز 500 nanograms per milliliter من anti-human serum albumin، مع تضمين حجم مكافئ من المنظم بدون البروتين المستهدف لعملية تحضين العينة الضابطة السالبة. يتكون نظام iris من عدة عناصر أساسية، مثل مصدر إضاءة، ومكونات بصرية لإضاءة مصفوفة مسبار الاستشعار بشكل صحيح، وكاميرا لتسجيل شدة الضوء المنعكس، ومنصة توضع عليها العينة لإجراء القياسات.

ابدأ بإجراء مسح لمرآة السيليكون باستخدام شريحة سيليكون نظيفة وعارية لمعايرة جميع البيانات التي سيتم جمعها لاحقاً قبل تنفيذ عملية المسح. قم بتجهيز نظام القزحية عن طريق ضبط المعلمات الخاصة بالتجربة، ويتضمن ذلك قياس المدرج التكراري لشدة الضوء التي تسجلها الكاميرا، وتحديد وقت التعرض للحصول على شدة إضاءة مثالية.

بعد إجراء مسح المعايرة، قم بتحميل مصفوفة المجسات المُجهزة في نظام IRIS ونفذ عملية الإعداد كما سبق، واضبط التركيز لتصوير سطح الركيزة بشكل صحيح. تأكد من استواء منصة العينة من خلال فحص المدرجات التكرارية المسجلة لكثافات الضوء المنعكس. وأخيراً، اختر اسماً للملف لحفظ البيانات تحته.

قم بتشغيل البرنامج لمسح المصفوفة، وهو ما يؤدي إلى إضاءة السطح بأطوال موجية مختلفة عدة مرات وحساب متوسط الصور التي تم جمعها. يتم تحديد الارتفاع البصري الأولي لنقطة التعلم، مما يسمح بالتحليل السليم للتغيرات في الكتلة على السطح بعد الحضن. عقب عملية المسح الأولي، اغمر الشريحة في محلول الحضن المُحضّر لمدة ساعة واحدة على لوح هزاز. يمكن أن تختلف مدة الحضن بشكل كبير اعتماداً على مستوى التغطية، وتركيز الهدف المراد اكتشافه، وقوة ألفة زوج المسبار والهدف.

بعد الحضن، كرر إجراء الغسل كما تم تنفيذه سابقاً. قم بمسح مصفوفة البروتينات (pro array) نفسها باستخدام نظام iris للحصول على صور ما بعد الحضن لمقارنتها بصور ما قبل الحضن. يمكن تكرار هذه العملية لخطوات حضن مختلفة إذا لزم الأمر.

على سبيل المثال، في تنسيق مقايسة الساندويتش (sandwich assay) حيث يتم استخدام جسم مضاد ثانوي، يتم مواءمة الصور التي تم جمعها لكل مسح بالقزحية باستخدام برنامج مطور تجارياً لإنتاج صورة للمجس تحتوي على تكوين السماكة البصرية. ويمكن إجراء تحليل نوعي سريع للارتباط عن طريق طرح صور ما قبل وما بعد الحضن. وسيظهر الارتباط على شكل تغير في الشدة في تلك البقع التي لوحظت فيها تغيرات في الكتلة.

للتحليل الكمي، حدد كثافات الكتلة لكل بقعة مقارنة بالخلفية عن طريق حساب متوسط معلومات السماكة الضوئية لكل بكسل داخل البقعة وبداخل حلقة تحيط بالبقعة من الخارج. ثم قم بإجراء مقارنة مباشرة بين هاتين المنطقتين الموضحتين هنا. ومثال على ذلك، مخطط لركيزة من السيليكون وثاني أكسيد السيليكون ذات طبقات، ومطبوع عليها مصفوفة أجسام مضادة نموذجية.

يتم وضع كل مجموعة من الأجسام المضادة في مكررات ذات خصوصية لمحددات مستضدية (epitope) مختلفة، بحيث تستهدف كل منها بروتيناً مختلفاً. وتم تمثيل فيروسين كاملين مختلفين وبروتين فيروسي كأمثلة على الأهداف. وتعتمد الأجسام المضادة للتحكم السلبي على نوع المقايسة، ويمكن أن تكون غير متخصصة و/أو متخصصة في الفيروس.

فيما يلي مثال على النتائج النوعية لارتباط الأجسام المضادة المتخصصة ببروتين الألبومين المصلي البشري بمصفوفة من بقع HSA وبقع تحكم من IgG الأرنب كما هو موضح هنا. بعد إجراء المطابقة وتحديد السمك البصري لصور ما قبل وما بعد الحضانة، يمكن إنشاء صورة فارق لمصفوفة الارتباط لتقييم الارتباط بسرعة. ويكشف المزيد من التحليل الكمي عن ملاحظة تغير في متوسط الارتفاع البصري قدره 2.05 و0.13 نانومتر لبقع HSA وبقع IgG الأرنب على التوالي، وذلك عند تركيز حضانة لـ anti HSA قدره 500 نانوجرام لكل milliliter.

يمثل هذا الرسم البياني بالأعمدة مثالاً على البيانات الكمية التي يمكن أن توفرها قياسات iris. في هذا المثال، يتم عرض اعتماد ارتباط بروتين fur على تركيز البروتين وطول all ligament مزدوج السلسلة. يوضح هذا الرسم البياني بالأعمدة قياسات الارتفاع البصري المطلقة لارتفاعات all ligament المثبتة أولياً، وبعد الحضانة لعملية الارتباط.

أدى زيادة تركيزات بروتين fur إلى 5 و100 و200 نانومولار إلى زيادة الارتباط بمجسات DNA. وهنا، يتم عرض ارتباط ثنائي بروتين fur المحسوب لكل رابطة DNAA مزدوجة السلاسل. وقد زاد ارتباط الثنائي بشكل ملحوظ عند تركيز بروتين fur يبلغ 200 نانومولار، مما يشير إلى مستوى عالٍ من التفاعلات غير النوعية مع جميع الروابط أو آلية مختلفة لارتباط بروتين fur، مثل تجمع العديد من الثنائيات.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر البدء بركائز نظيفة وموحدة ذات سمك أكسيد مناسب، والحفاظ على نظافة العينات من خلال التعامل معها بعناية باستخدام الملاقط. كما أنه من الضروري استخدام كواشف تم تخزينها بشكل صحيح ومن المعروف أنها فعالة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس التفاعلات الجزيئية الحيوية بتنسيق خالٍ من الوسوم من خلال تحضير مصفوفات مجسات وظيفية على سطح ثاني أكسيد السيليكون، بالإضافة إلى الحصول على البيانات وتحليلها باستخدام مستشعر التصوير بالانعكاس التداخلي أو iris.