MG53 تصور بوساطة غشاء الخلية عن طريق إصلاح في الجسم الحي و في المختبر أنظمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم قدرة إصلاح الغشاء في كل من الحيوان والخلايا المعزولة. يتم جمع ألياف العضلات الهيكلية المعزولة وإحاطتها بوسط يحتوي على صبغة FM 1 43. ثم يُستخدم ليزر فوق بنفسجي لإشعاع وإتلاف جزء من غشاء الخلية للسماح بدخول الصبغة إلى الخلية.

تُعدى الخلايا المعزولة بـ plasma DNA الذي يعبر عن GFP MG 53، والذي سيتمركز في الغشاء البلازمي وسيتوبلازم الخلية. بعد ذلك، يتم إدخال طرف قطب كهربائي دقيق في غشاء C two C 12 لإحداث تلف. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر انتقال GFP MG 53 إلى موقع الإصابة.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً للممارسات المطلوبة لإتقان تقنيات اختراق القطب الدقيق وعزل الألياف العضلية. سيقوم بشرح الإجراء كل من الدكتور Lin، مدير المختبر، والدكتور Wazu، وهو زميل ما بعد الدكتوراه، وMatt Orange، وهو طالب دراسات عليا، والدكتورة Shaza، وهي أستاذ مساعد للبحوث في قسمنا. للبدء، ضع صينية أو وسادة مختبر زرقاء أسفل جهاز المشي لجمع الفضلات من الحيوانات أثناء التجربة.

بعد ذلك، قم بضبط زاوية سطح جهاز المشي. تحتوي بعض أجهزة المشي على جهاز مدمج لضبط درجة الانحدار، بينما تتطلب أجهزة أخرى رفع جهاز المشي بوسائل أخرى. وعادةً ما يتم استخدام سطح مستوٍ أو زاوية تتراوح بين 7 و 15 درجة صعوداً أو هبوطاً.

أكّف الفئران عن طريق وضعها على جهاز المشي مع إيقاف تشغيل الشبكة الكهربائية وتشغيل محرك سير الدفع، على ألا يتحرك السير لمدة 15 دقيقة؛ وبعد انتهاء فترة التكيف، قم بتشغيل الشبكة الكهربائية التحفيزية. ابدأ تشغيل جهاز المشي بسرعة أولية تبلغ حوالي خمسة أمتار في الدقيقة. ومع زيادة السرعات بمعدل متر واحد إلى مترين في الدقيقة كل دقيقة، امنح الحيوان فترة إحماء مدتها خمس دقائق.

كرر فترة الإحماء هذه يومياً لمدة تتراوح من 3 إلى 10 أيام لزيادة الامتثال أثناء الاختبار. ولإجراء تمرين الإنهاك الحاد، قم بزيادة سرعة جهاز المشي تدريجياً حتى الوصول إلى السرعة القصوى مع مراقبة علامات الإنهاك.

يُعتبر الحيوان منهكاً عندما يقضي أكثر من نصف الوقت خارج جهاز المشي أو خمس ثوانٍ متتالية على الشبكة. قم بإزالة الفأر المنهك وسجّل إجمالي وقت الجري. التدريب على التحمل.

تبدأ بروتوكولات الجري بنفس إجراء الإحماء. ومع ذلك، تكون السرعة القصوى أقل بشكل عام، ويمكن أن تكون فترات الجري طويلة للغاية. أعد الفئران إلى أقفاصها بعد الاختبار ونظف جهاز المشي باستخدام 70%ethanol.

قم بعزل الطبقة السطحية من العضلة ثانية الأصابع القصيرة من القدم لإجراء مزيد من التحليل. أولاً، اقطع جلد أخمص القدم عند الخط الناصف، مع الحرص على عدم إتلاف العضلة الموجودة تحته. بعد ذلك، قم بإجراء شقوق أفقية وأزل الجلد.

حدد الوتر الأبيض المسطح لعضلة FDB المتصل بعظمة العقب. استخدم الملقط لفصل الوتر ثم قطعه بالقرب من موقع الارتباط. اسحب الوتر للأعلى بلطف مع إزالة أي نسيج ضام.

حدد موقع تفرع الأوتار القاصية إلى الأصابع الفردية. اقطع الأوتار عند نقطة اتصالها بطبقة العضلات العميقة ثم قم بإزالة عضلة FDB. ضع حزمة عضلة FDB في 1 mL من محلول collagenase المسخن مسبقًا إلى 37 °C.

ثبّت الأنبوب شريطياً بشكل أفقي على هزاز مداري عند درجة حرارة 37 degree Celsius، وهزّه بسرعة 200 RPM لمدة 65 دقيقة. يُستدل على إتمام عملية الهضم بظهور مظهر متفكك ولون باهت. اقطع طرف رأس ماصة سعة one milliliter للسماح بمرور الحزمة المهضومة من خلاله.

انقل الحزمة بسهولة إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على حوالي 600 µL من 2.5. Calcium tyro. اقلب الأنبوب بلطف لهز الألياف السائبة وفصلها عن الحزمة.

بعد ذلك، اقطع طرف رأس ماصة سعة 30 µL بحيث يكون القطر أصغر بقليل فقط من حزمة العضلات. استخدم هذا الرأس لسحب الحزمة إلى داخل الماصة ثم دفعها مرة أخرى إلى المحلول. كرر هذه العملية حتى تنفصل غالبية الألياف عن الحزمة.

امزج الألياف المفصولة عن طريق تدوير الأنبوب برفق. خذ الكمية المطلوبة وضعها في طبق delta T ذو قاعدة زجاجية. تُحفظ الألياف المتبقية في درجة حرارة 4 °C لمدة ست ساعات تقريباً لاستخدامها في دراسات إضافية.

اترك الطبق دون تحريك لمدة خمس دقائق؛ وذلك للسماح للألياف بالالتصاق بالقاع الزجاجي للطبق. ضع الطبق ذو القاع الزجاجي على مجهر بؤري (confocal microscope) مجهز بليزر UV.

افحص الألياف تحت مجهر تباين الطور بتكبير يزيد عن 100x للتحقق من وجود نمط تخطيط طبيعي وشكل عصوي مستقيم. أضف صبغات FM 1 43 أو FM 4 64 styro perineum إلى المحلول للوصول إلى تركيز نهائي قدره 2.5 micromolar. وجّه الليف بزاوية 45 درجة من أعلى يسار مجال الرؤية إلى أسفل اليمين لإحداث تلف.

قم بتسليط الأشعة على منطقة بمساحة خمسة في خمسة بكسل من الغشاء البلازمي. باستخدام ليزر UV مضبوط على أقصى طاقة لمدة خمس ثوانٍ، يجب أن تعمل المنطقة المشععة على شق الغشاء البلازمي بحيث يكون نصف المربع (خمسة في خمسة) داخل الليف بينما يكون الجزء المتبقي خارج الليف. التقط صوراً لدخول الصبغة إلى الليف على فترات زمنية مدتها خمس ثوانٍ لكل منها ولمدة تصل إلى خمس دقائق. يمكن تسليط الأشعة على ثلاثة ألياف فقط في كل طبق، لأن الصبغة الفلورية ستنتقل في النهاية إلى داخل الليف عبر عملية الالتقام الخلوي (endocytosis)، مما سيؤدي إلى تعقيد تحليل البيانات.

بعد استخدام ثلاثة ألياف، يجب تحضير طبق جديد. وباستخدام برنامج تحليل، احسب التغير في شدة الفلورة في مساحة تبلغ 200 ميكرون مربع تقريباً للمقارنة بين الألياف. يجب إجراء الحساب التالي لكل إطار: delta F مقسومة على F zero، حيث تمثل F zero متوسط الفلورة لمنطقة الاهتمام في أول إطار تم التقاطه، وتمثل delta F التغير في الفلورة في كل إطار لاحق.

استخدم الطرق القياسية لنقل الحمض النووي البلازميدي الذي يعبر عن GFP MG 53 إلى الخلايا. بعد ذلك، قم بتجهيز الماصات الدقيقة. ضع أنبوبًا شعريًا من نوع Pyrex على الماصة الدقيقة.

يتم السحب والشد وفقاً لبرنامج محدد مسبقاً. يتم تثبيت الماصة الدقيقة (micro pipette) بجهاز تحريك دقيق ثلاثي المحاور في المزرعة. يتم إزالة الوسط من طبق delta T واستبداله بمحلول calcium tyro buffer بتركيز 2.5 millimolar.

ضع الطبق الذي يحتوي على الخلايا المنقولة جينياً على مجهر بؤري ماسح بالليزر مزود بعدسة شيئية غمر زيتية 40 x 1.3 NA. قم بتحفيز تلف حاد في الخلايا الحية عن طريق إدخال الماصة الدقيقة في الغشاء الخلوي ثم سحب الماصة الدقيقة بسرعة من الخلية. اجمع صوراً متتالية للخلايا الحية بفاصل زمني قدره 1.54 ثانية لكل إطار لمراقبة تمزق الغشاء الناجم عن التروپونين.

قم بتنقيط troponin بتركيز 0.005% بمعدل ملليلتر واحد تقريباً في الدقيقة مباشرة فوق الخلية التي يتم تصويرها. يمكن استخدام جهاز المشي لقياس الانخفاض في القدرة على الجري. تُظهر فئران MG 53 knockout الموضحة هنا انخفاضاً في القدرة على الجري نتيجة لتضرر العضلات الهيكلية.

يعتمد مدى الضرر الناجم عن ليزر UV على قدرة إصلاح الغشاء لليفة المرئية. تظهر هنا ليفة قبل الإصابة في فأر طبيعي. تم التقاط هذه الصورة بعد 200 ثانية وهي تظهر إصابة طفيفة.

ستظهر ليفة عضلية مشتقة من الفئران التي تعاني من تعطيل جين MG 53، والتي لديها قدرة ضعيفة على إصلاح الغشاء، دخولاً أكثر وضوحاً للصبغة بعد الإصابة. وفيما يلي مثال لأنبوب عضلي من نوع C two C 12 تم تحويله جينياً بواسطة GFP MG 53 وهو غير تالف. يشير السهم في هذه الصورة إلى حويصلات تحتوي على GFP MG 53 تتحرك نحو مواقع التلف.

في هذا المثال، استُخدم السابونين لإتلاف الغشاء البلازمي. لاحظ انتقال GFP MG 53 من العصارة الخلوية إلى غشاء الخلية بعد الإصابة. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عزل ألياف عضلية جيدة ذات أغشية ساركولمية ملساء وأنماط تخدد واضحة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم قدرة إصلاح الغشاء في العضلات وكيفية زراعة الخلايا.