MG53 تصور بوساطة غشاء الخلية عن طريق إصلاح في الجسم الحي و في المختبر أنظمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم قدرة إصلاح الغشاء في كل من الخلايا الحيوانية والخلايا المعزولة. يتم جمع ألياف العضلات الهيكلية المعزولة وتحيط بها وسائط تحتوي على صبغة FM 1 43. ثم يتم استخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية لإشعاع وإتلاف جزء من غشاء الخلية للسماح بدخول الصبغة إلى الخلية.

يتم نقل الخلايا المعزولة باستخدام الحمض النووي للبلازما الذي يعبر عن GFP MG 53 ، والذي سيتم توطينه في غشاء البلازما والعزلة الخلوية للخلية. ثم يتم إدخال طرف القطب الكهربائي الصغير في غشاء C two C 12 لإحداث الضرر. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر انتقال GFP MG 53 إلى موقع الإصابة.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن الممارسات المطلوبة لإتقان تقنيات اختراق القطب الكهربائي الدقيق وعزل ألياف العضلات. سيوضح الإجراء الدكتور لين ، مدير المختبر لدينا ، والدكتور وازو ، زميل ما بعد الدكتوراه مات أورانج ، طالب دراسات عليا ، والدكتور شازا ، أستاذ مساعد باحث في قسمنا. للبدء ، ضع صينية أو وسادة مختبر زرقاء أسفل جهاز المشي لجمع النفايات من أثناء التجربة.

بعد ذلك ، اضبط زاوية سطح جهاز المشي. تحتوي بعض المطاحن على جهاز متكامل لضبط المنحدر بينما يتطلب البعض الآخر رفع جهاز المشي من خلال وسائل أخرى. يتم استخدام سطح مستو أو زاوية تتراوح بين سبع و 15 درجة منحدرا أو صعودا بشكل عام.

تأقلم الفئران عن طريق وضعها على جهاز المشي مع إيقاف تشغيل الشبكة الكهربائية وتشغيل محرك الحزام ، ولكن لا تتحرك لمدة 15 دقيقة بعد فترة التأقلم ، قم بتشغيل الشبكة الكهربائية التحفيزية. ابدأ جهاز المشي بسرعة أولية تبلغ حوالي خمسة أمتار في الدقيقة. مع زيادة السرعات بمقدار متر إلى مترين في الدقيقة كل دقيقة ، اسمح للحيوان بفترة إحماء لمدة خمس دقائق.

كرر فترة الإحماء هذه كل يوم لمدة ثلاثة إلى 10 أيام لزيادة الامتثال أثناء الاختبار. لتشغيل تمرين الإرهاق الحاد. قم بزيادة سرعة جهاز المشي بمرور الوقت حتى يتم تحقيق السرعة القصوى ومراقبة علامات الإرهاق.

يعتبر مرهقا عندما يقضي أكثر من نصف الوقت بعيدا عن جهاز المشي أو خمس ثوان متتالية على الشبكة. قم بإزالة الماوس المنهك وسجل إجمالي وقت التشغيل. تدريب التحمل.

تبدأ بروتوكولات التشغيل بنفس إجراء الإحماء. ومع ذلك ، فإن السرعة القصوى أقل بشكل عام ويمكن أن تكون أوقات التشغيل طويلة جدا. أعد الفئران إلى قفص منزلها بعد الاختبار ونظف جهاز المشي بنسبة 70٪ من الإيثانول.

عزل الطبقة السطحية للعضلة المثنية الإصغام الدهشة عن القدم لمزيد من التحليل. أولا ، قم بقص جلد النعل عند الخط المتوسط ، مع الحرص على عدم إتلاف العضلات تحتها. بعد ذلك ، قم بعمل تخفيضات أفقية وإزالة الجلد.

تحديد الوتر الأبيض المسطح لعضلة FDB المرتبط بعظم العقبي. استخدم الملقط لفصل الوتر ثم قطعه بالقرب من موقع التعلق اسحب الوتر برفق مع قطع أي نسيج ضام.

حدد مكان تفرع الأوتار البعيدة إلى الأرقام الفردية. اقطع الأوتار حيث تتصل بالطبقة العميقة من العضلات وقم بإزالة FDB. ضع حزمة عضلات FDB في مليلتر واحد من محلول الكولاجيناز الدافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية.

قم بلصق الأنبوب أفقيا على شاكر مداري بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ورجه بسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة 65 دقيقة. يتميز الهضم الكافي بمظهر خائف ولون شاحب. قم بقص نهاية طرف ماصة سعة مليلتر واحد للسماح للحزمة المهضومة بالمرور.

انقل الحزمة بسهولة إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على حوالي 600 ميكرولتر من 2.5. كالسيوم تايرو. اقلب الأنبوب برفق لهز الألياف السائبة من الحزمة.

بعد ذلك ، قم بقص نهاية طرف ماصة سعة 30 ميكرولتر بحيث يكون قطرها أصغر قليلا من حزمة العضلات. استخدم هذا الطرف لسحب الحزمة إلى الماصة ثم دفعها مرة أخرى إلى المحلول. كرر هذه العملية حتى تنفصل غالبية الألياف عن الحزمة.

امزج الألياف المنفصلة عن طريق تدوير الأنبوب برفق. قم بإزالة الكمية المرغوبة وقم بإسقاطها في طبق دلتا تي ذو قاع زجاجي. قم بتخزين الألياف المتبقية على درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة ست ساعات تقريبا للاستخدام والدراسات الإضافية.

دع الطبق يجلس دون إزعاج لمدة خمس دقائق. هذا يسمح للألياف بالالتصاق بالجزء السفلي الزجاجي للطبق. ضع الطبق السفلي الزجاجي على مجهر متحد البؤر مزود بليزر الأشعة فوق البنفسجية.

راقب الألياف تحت الفحص المجهري الطوري بتكبير أكبر من 100 × للتحقق من وجود نمط مخطط طبيعي وشكل مستقيم يشبه القضيب. أضف FM 1 43 أو FM 4 64 يموت العجان الستايرو إلى محلول إلى تركيز نهائي يبلغ 2.5 ميكرومولار. قم بتوجيه الألياف بزاوية 45 درجة من أعلى يسار مجال الرؤية إلى أسفل اليمين لإحداث الضرر.

تشعيع مساحة خمسة في خمسة بكسل من غشاء البلازما. باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية الذي تم ضبطه على الطاقة القصوى لمدة خمس ثوان ، يجب أن تقسم المنطقة المشعة غشاء البلازما الذي يمثل نصف صندوق خمسة في خمسة يجب أن يكون داخل الألياف بينما يجب أن يكون الباقي خارج الألياف ، يلتقط الصور لدخول الصبغة إلى الألياف على فترات خمس ثوان لكل منها لمدة تصل إلى خمس دقائق. يمكن تشعيع ثلاثة ألياف فقط لكل طبق لأن صبغة الفلورسنت ستكون في النهاية داخل الخلايا في الألياف وتعقد أي تحليل للبيانات.

بعد استخدام ثلاثة ألياف ، يجب تحضير طبق جديد. باستخدام برنامج التحليل ، احسب التغير في شدة التألق في مساحة تبلغ مساحتها حوالي 200 ميكرون مربع للمقارنة بين الألياف. يجب إجراء الحساب التالي لكل دلتا رتل F مقسوما على F صفر ، حيث F صفر هو متوسط مضان المنطقة التي تهم في الرتل الأول الملتقط ودلتا F هي تغير التألق في كل رتل لاحق.

استخدم الطرق القياسية لنقل الخلايا باستخدام الحمض النووي البلازميد الذي يعبر عن GFP MG 53. ثم قم بإعداد الماصات الدقيقة. ضع شعرية Pyrex على ماصة دقيقة.

سحب وسحب عن طريق برنامج محدد مسبقا. قم بتوصيل الماصة الدقيقة بثقافة مناور صغير ثلاثي المحاور. تتم إزالة الوسائط من طبق دلتا T واستبدالها بمحلول 2.5 مللي مولار من الكالسيوم تايرو.

ضع الطبق الذي يحتوي على خلايا منقولة على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر مع هدف غمر الزيت 40 × 1.3 NA. إحداث تلف حاد للخلايا الحية عن طريق إدخال الماصة الدقيقة في غشاء الخلية ثم سحب الماصة الدقيقة بسرعة خارج الخلية. اجمع صور الخلايا الحية المتتالية بفاصل 1.54 ثانية لكل إطار لاضطراب الغشاء الناجم عن التروبونين.

PERFU 0.005٪ تروبونين بمعدل واحد مليلتر واحد تقريبا في الدقيقة فوق الخلية التي يتم تصويرها مباشرة. يمكن استخدام جهاز المشي لقياس انخفاض قدرة التشغيل. لقد قللت الفئران بالضربة القاضية MG 53 التي تظهر هنا من قدرتها على الجري بسبب تلف عضلات الهيكل العظمي.

يعتمد مدى الضرر الناجم عن ليزر الأشعة فوق البنفسجية على قدرة إصلاح الغشاء للألياف المرئية. هنا ألياف قبل الإصابة في الماوس العادي. تم التقاط هذه الصورة بعد 200 ثانية وتظهر إصابة طفيفة.

ستعرض ألياف العضلات المشتقة من الفئران MG 53 بالضربة القاضية ذات القدرة على إصلاح الغشاء المعرضة للخطر دخول صبغة أكثر أهمية بعد الإصابة التي شوهدتها. فيما يلي مثال على أنبوب GFP MG 53 غير التالف C اثنين من C 12 myo. يشير السهم الموجود في هذه الصورة إلى GFP MG 53 الذي يحتوي على حويصلات تتحرك نحو مواقع التلف.

في هذا المثال ، تم استخدام الصابونين لإتلاف غشاء البلازما. لاحظ انتقال GFP MG 53 من العصارة الخلوية إلى غشاء الخلية بعد الإصابة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عزل ألياف العضلات الجيدة بأغشية سارال ناعمة وأنماط مخطط واضحة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم قدرة إصلاح الغشاء للعضلات والثقافة والخلايا.