HLA - الإيج بناء خلايا مولدة الاصطناعي تقديم الكفء لل خارج الحي توسيع CTL الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام الخلايا العارضة للمستضد الاصطناعي أو جهاز كمبيوتر A للتوسع خارج الجسم الحي ل CTL الخاص بالمستضد البشري للاستخدام المحتمل في العلاج المناعي بالتبني. يتم تحقيق ذلك عن طريق الاقتران أولا HLA A اثنين من IG و CD 28 المضاد للإنسان إلى حبات الدينا المغناطيسية لصنع جهاز كمبيوتر. الخطوة الثانية من الإجراء هي إجراء مراقبة الجودة وتحميل الببتيد لجهاز الكمبيوتر A. الخطوة الثالثة من الإجراء هي عزل الدم المحيطي البشري CD ثماني خلايا تائية موجبة. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي احتضان ثمانية خلايا تائية موجبة للقرص المضغوط مع جهاز كمبيوتر A لمدة أسبوع.

ثم يتم حصاد CTL وتمييزه قبل استخدامه أو إعادة تحفيزه لمدة أسبوع آخر لتحقيق المستوى المطلوب من خصوصيتها وتوسعها. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج teum أو تلطيخ تظهر أن CTL التي يتم توسيعها في وجود جهاز كمبيوتر A لها خصوصية مستضد متزايدة. سأريكم اليوم نظام كمبيوتر يعتمد على HI IG وكيفية استخدام هذا النظام لتوسيع نطاق CTL البشري الخاص ب CMV بكفاءة مقارنة بالطرق الأخرى الموجودة.

توفر تقنية A A PC الخاصة بنا العديد من المزايا المهمة. إنه متاح على الرف ، وهو بكمية غير محدودة ، ودعنا نقول أنه يمكن استخدام جهاز كمبيوتر لجميع المتبرعين الإيجابيين من HRAA. حسنا ، لنبدأ بنقل مليلتر واحد من M أربعة حبة إيبوكسي 50 من مخزون حوالي 400 مليون حبة إلى ملف زجاجي معقم.

اغسل الخرزات مرة واحدة عن طريق إضافة مليلتر واحد من المخزن المؤقت ثم وضع القارورة الزجاجية على مغناطيس NBC واحد بينما يتم لصق الخرزات على جانب القارورة. إزالة snat عن طريق الشفط Resus. قم بتعليق الخرزات في خليط من المخزن المؤقت للجسم HLA A ثنائي IG ثنائي وجسم مضاد أحادي النسيلة CD 28 المضاد للإنسان.

ثم لتسهيل اقتران البروتين للحبة ، قم بتدوير القارورة الزجاجية على دوار عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، ضع الأنبوب في مغناطيس MPC واحد وقم بإزالة كل المخزن المؤقت للبورات. بعد إزالة المخزن المؤقت ، اغسل الخرزات مرتين باستخدام مليلتر واحد من المخزن المؤقت لغسيل الخرز.

الآن احتضان الخرزات في مليلتر واحد من مخزن غسيل الخرز وقم بتدوير القارورة عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة أخرى لمنع مواقع ربط البروتين المتبقية على الخرز. ثم قم بإزالة المخزن المؤقت من القارورة الزجاجية واستبدله بمليلتر واحد من المخزن المؤقت لغسيل الخرزة الطازجة. انقل 100 ميكرولتر من مخزن غسيل الفاكس إلى أنابيب الفاكس ، ثم أضف خمس مرات 10 إلى الخرزات الخامسة.

تلطخ الخرزات بميكرولتر واحد من IgG المضاد للموسى ، وواحد PE وميكرولتر واحد من IgG المضاد للموسى اثنين بعد تلطيخ لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. عند ثلاثة ملليلتر من الفاكس الغسيل عازلة لكل عينة من عينات التلوين. ثم قم بتقطيع جهاز الكمبيوتر A عن طريق الإنفاق عند 300 Gs لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

قم بتعليق جهاز الكمبيوتر A في مخزن فاكس جديد وقراءة نتيجة التلوين على الفور بواسطة مقياس التدفق الخلوي. اغسل الخرزات مرتين باستخدام PBS معقم كما كان من قبل. بعد ذلك ، قم بتحميل الخرزات ب 10 ميكرولتر من الببتيد CMV.

عد الخرزات بواسطة مقياس الخلوي الدموي ثم قم بتسميتها بتاريخ وتركيز الخرز. كحبات لكل مليلتر. احتضان جهاز الطرد المركزي A PC مع الببتيد لمدة ثلاثة أيام على الأقل عند أربع درجات مئوية ما يقرب من 100 مل من الدم المحيطي الطازج من HLA A اثنين من المتبرعين الإيجابيين في 10 أنابيب فراغ هيبارين الصوديوم عند 300 Gs لمدة 10 دقائق.

في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة طبقة البلازما العلوية بعناية عن طريق الشفط. استبدل البلازما المجمعة ب PBS معقم وانقل الدم إلى قارورة ثقافة T 75 معقمة. امزج الدم و PBS جيدا عن طريق سحب العينة بمجرد جمع الدم بالكامل عند 15 مل من عبوة المال بالإضافة إلى أربعة أنابيب مخروطية سعة 50 مل.

قم بتراكب 30 إلى 35 مل من خلايا الدم ببطء فوق القرص في كل أنبوب. الحفاظ على الواجهة متميزة بين القرص وخلايا الدم ، ويقوم بالطرد المركزي للدم والتدرج الورقي عند 500 GS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الانفصال والتسارع إلى أدنى مستوى ممكن للحفاظ على واجهة واضحة بين الطبقات بعد أن يتساقط الدوران من طبقة البلازما العليا ثم استخدم ماصة مصلية لشفط طبقة PBMC بعناية. انقل PBMC إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر عندما يتم حصاد كل PBMC عند 30 مل من PBS إلى الخلايا وقم بطردها المركزي.

بعد ذلك ، تخلص من supernat واغسل الحبيبات. مرة أخرى مع 30 مل من PBS لإزالة مكالمة fi المتبقية ثم إثراء ثمانية خلايا تائية إيجابية للقرص المضغوط باستخدام مجموعة عزل الخلايا التائية الإيجابية من Milton Human CD ثمانية إيجابية. وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، احسب القرص المضغوط ثماني خلايا تائية موجبة وتأكد من النقاء عن طريق تحليل الفاكس.

قم بتعليق 1 مليون CTL في ثمانية ملليلتر من عامل نمو الخلايا التائية اثنين × وسط الثقافة بالإضافة إلى ثمانية ملليلتر من وسط RPMI الكامل وأضف واحدا في 10 من ستة مزيج A PC. حسنا ، استخدم ماصة متعددة القنوات لصفيحة 160 ميكرولترا من الخلايا لكل بئر على لوحة زراعة الأنسجة السفلية 96 بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة سبعة أيام.

قم بتغذية الخلايا في اليوم الرابع ب 80 ميكرولتر لكل بئر من نمو الخلايا التائية. العامل الثاني × وسط الثقافة. احصد الخلايا في اليوم السابع ثم ضع الخلايا على المغناطيس لإزالة جهاز الكمبيوتر القديم عندما تلتصق جميع الخرزات بجدار القارورة.

احصد الخلايا وانقلها إلى أنبوب مخروطي آخر سعة 50 مليلتر واحسب رقم الخلية. تحديد خصوصية المستضد لجهاز الكمبيوتر A A عن طريق تلطيخ رباعي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أعد تشغيل الخلايا التي تم حصادها باستخدام جهاز كمبيوتر A جديد في نفس الظروف لتوليد أعداد خلايا متزايدة في خصوصية المستضد.

فيما يلي نتيجة تلطيخ رباعي تمثيلية ل CTL الخاص ب CMV تم إنشاؤه بواسطة جهاز كمبيوتر A بعد أسبوع واحد من الثقافة. تظهر هنا نتيجة تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا التمثيلية ل CTL الخاص ب CMV الناتج عن خصوصية A-A-P-C-C-M-V كانت 61٪ عن طريق تلطيخ رباعي. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلايا التائية ، مثل كيف يمكننا تحديد الظروف الثقافية المثلى ومتطلبات التعديل الوظيفي للخلية التائية.

قدمت الطريقة المتواضعة نظرة ثاقبة لعلاج الأمراض الفيروسية. يمكن تطبيقه أيضا في مجالات أخرى مثل السرطان.