HLA - الإيج بناء خلايا مولدة الاصطناعي تقديم الكفء لل خارج الحي توسيع CTL الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام خلايا اصطناعية عارضة للمستضد (a APC) للتوسع الخارجي لخلايا T السامة للخلايا (CTL) البشرية النوعية للمستضد، وذلك لاستخدامها المحتمل في العلاج المناعي التبني. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ربط HLA A2 IG وجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ CD28 البشري بخرزات dyna المغناطيسية لتصنيع a APC. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إجراء مراقبة الجودة وتحميل الببتيدات على a APC. أما الخطوة الثالثة فهي عزل خلايا T الموجبة لـ CD8 من الدم المحيطي البشري. والخطوة النهائية من الإجراء هي تحضين خلايا T الموجبة لـ CD8 مع a APC لمدة أسبوع.

يتم بعد ذلك حصاد الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL) وتوصيفها قبل استخدامها أو إعادة تحفيزها لمدة أسبوع آخر لتحقيق المستوى المطلوب من النوعية والتوسع. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تحليل T-cell elution أو التلوين التي تُظهر أن الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا التي تم توسيعها في وجود APC الاصطناعية تمتلك نوعية مستضدية متزايدة. سأعرض لكم اليوم نظام APC يعتمد على HI IG وكيفية استخدام هذا النظام لتوسيع الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا البشرية النوعية لـ CMV بكفاءة خارج الجسم (ex vivo) مقارنة بالطرق الحالية الأخرى.

توفر تقنية A A PC لدينا العديد من المزايا الهامة؛ فهي متوفرة كمنتج جاهز، وبكميات غير محدودة، ويمكن استخدام A A PC لجميع المتبرعين الإيجابيين لـ HRAA two. حسنًا، لنبدأ: انقل 1 mL من حبيبات epoxy M4 50 من المخزون (حوالي 400 مليون حبيبة) إلى أنبوب زجاجي معقم ذو غطاء لولبي.

اغسل الحبيبات مرة واحدة بإضافة 1 mL من boid buffer، ثم ضع الأنبوبة الزجاجية مقابل dyin all magnet NBC one بينما تكون الحبيبات ملتصقة بجدار الأنبوبة. قم بإزالة snat عن طريق الشفط. علّق الحبيبات في خليط من boid buffer وHLA A two IG dimer وجسم مضاد أحادي النسيلة anti-human CD 28.

بعد ذلك، ولتسهيل اقتران البروتين بالخرزات، يتم تدوير القارورة الزجاجية على جهاز تدوير عند درجة حرارة 4 °C لمدة 24 ساعة. ثم، ضع الأنبوب في مغناطيس MPC one وقم بإزالة كل منظم البورات. وبعد إزالة المنظم، اغسل الخرزات مرتين باستخدام 1 mL من منظم غسيل الخرزات.

الآن قم بتحضين الخرزات في 1 mL من محلول غسل الخرزات المنظم، وقم بتدوير الأنبوب عند درجة حرارة 4 °C لمدة 24 ساعة أخرى لحجب مواقع ارتباط البروتين المتبقية على الخرزات. بعد ذلك، قم بإزالة المحلول المنظم من الأنبوب الزجاجي واستبدله بـ 1 mL من محلول غسل الخرزات المنظم الجديد. انقل 100 µL من محلول غسل fax إلى أنابيب fax، ثم أضف 5 × 10⁵ من الخرزات.

قم بصبغ الخرز باستخدام ميكرولتر واحد من anti muse IgG, one PE وميكرولتر واحد من anti muse IgG two a fite بعد الصبغ لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. أضف 3 mL من fax washing buffer إلى كل عينة من عينات الصبغ. ثم قم بترسيب A A PC عن طريق الطرد المركزي عند 300 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

أعد تعليق A A PC في محلول fax buffer طازج واقرأ نتيجة الصبغ فوراً باستخدام مقياس التدفق الخلوي. اغسل الخرز مرتين باستخدام PBS معقم كما سبق. بعد ذلك، حمّل الخرز بـ 10 µL من ببتيد CMV.

قم بعدّ الخرزات باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، ثم ضع عليها ملصقاً يوضح التاريخ وتركيز الخرزات كعدد من الخرزات لكل ملي لتر. قم بتحضين A A PC مع الببتيد لمدة ثلاثة أيام على الأقل عند درجة حرارة 4 °C، ثم قم بطرد مركزي لنحو 100 milliliters من الدم المحيطي الطازج المأخوذ من متبرع موجب لـ HLA A two في 10 أنابيب vacutainer تحتوي على هيبارين الصوديوم بسرعة 300 Gs لمدة 10 دقائق.

في درجة حرارة الغرفة، قم بإزالة طبقة البلازما العلوية بعناية عن طريق الشفط. استبدل البلازما المجمعة بمحلول PBS معقم وانقل الدم إلى قارورة زراعة T 75 معقمة. اخلط الدم ومحلول PBS جيداً باستخدام الماصة بمجرد تجميع كل الدم في عبوة fial pack سعة 15 milliliters بالإضافة إلى أربعة أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter.

أضف ببطء من 30 إلى 35 ملليلتر من خلايا الدم فوق الـ fial في كل أنبوب. مع الحفاظ على تمايز الواجهة بين الـ fial وخلايا الدم، قم بطرد مركزي للدم وتدرج الـ fial بسرعة 500 GS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع إيقاف الكبح (break off) وضبط التسارع عند أدنى مستوى ممكن للحفاظ على واجهة واضحة بين الطبقات. بعد عملية الطرد المركزي، اسحب طبقة البلازما العلوية، ثم استخدم ماصة سيرولوجية لسحب طبقة الـ PBMC بعناية. انقل الـ PBMC إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر، وعند الانتهاء من جمع كل الـ PBMC، أضف 30 ملليلتر من PBS إلى الخلايا ثم قم بطردها مركزياً.

بعد ذلك، تخلص من الطافي واغسل الراسب. كرر العملية مرة أخرى باستخدام 30 milliliters من PBS لإزالة بقايا fi call، ثم قم بإثراء مجموعة خلايا T الموجبة لـ CD eight باستخدام طقم Milton لعزل خلايا T الموجبة لـ CD eight البشرية. وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة، قم بعد خلايا T الموجبة لـ CD eight وتأكيد النقاوة عن طريق تحليل fax.

قم بتعليق 1 مليون من الخلايا التائية السامة للخلايا (CTL) في ثمانية ملليلتر من وسط استنبات العامل المنمي للخلايا التائية (T-cell growth factor two x culture medium) بالإضافة إلى ثمانية ملليلتر من وسط RPMI الكامل، ثم أضف 1 × 10⁶ من خليط A A PC. بعد ذلك، استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 160 µL من الخلايا في كل بئر على طبق زراعة أنسجة ذو 96 بئراً بقاع على شكل حرف U. حضن الخلايا عند 37 °C في 5% CO2 لمدة سبعة أيام.

قم بتغذية الخلايا في اليوم الرابع بإضافة 80 µL لكل بئر من وسط نمو الخلايا التائية (T-cell growth factor 2x culture medium). احصد الخلايا في اليوم السابع، ثم ضع الخلايا مقابل المغناطيس لإزالة الـ A A PC القديمة عندما تلتصق جميع الخرزات بجدار القارورة.

قم بحصد الخلايا ونقلها إلى أنبوب مخروطي آخر سعة 50 milliliter وقم بعدد الخلايا. حدد خصوصية المستضد لـ A A PC عن طريق صبغ التترامير (tetramer staining) وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. أعد تحفيز الخلايا المحصودة بـ A A PC جديدة تحت نفس الظروف لزيادة أعداد الخلايا ذات الخصوصية للمستضد.

تظهر هنا نتيجة صبغ رباعي الأجسام (tetramer) ممثلة لخلايا CTL النوعية لفيروس CMV والتي تم إنتاجها بواسطة A A PC بعد أسبوع واحد من الزراعة. كما تظهر هنا نتيجة ممثلة لصبغ السيتوكينات داخل الخلايا لخلايا CTL النوعية لفيروس CMV التي تم إنتاجها بواسطة A-A-P-C-C-M-V، حيث بلغت النسبة النوعية 61% عن طريق صبغ رباعي الأجسام. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الخلايا التائية، مثل كيفية تحديد الظروف الزراعية المثلى ومتطلبات التعديل الوظيفي للخلايا التائية.

وفرت طريقة Lowly رؤى حول علاج الأمراض الفيروسية. ويمكن تطبيقها أيضاً في مجالات أخرى مثل السرطان.