القاتل مستضد تقديم الخلايا الاصطناعي (KaAPC) للكفاءة في المختبر استنفاد خلايا T الإنسان مستضد محددة

الهدف العام من هذه التجربة هو إنشاء خلية عرض مستضد اصطناعي قاتل غير خلوي قائم على HLA IG ، أو K-A-A-P-C لاستنفاد مجموعات الخلايا التائية ذاتية التفاعل أو غير المرغوب فيها. يتم تحقيق ذلك من خلال الربط الأول تساهميا لجزيئات HLA IG والأجسام المضادة أحادية النسيلة Antifa بجزيئات ديكستران الحديد بحجم الخلية لتوليد K-A-A-P-C الوظيفية في الخطوة الثانية ، تتميز K-A-A-P-C بقياس التدفق الخلوي لضمان وظائفها المناسبة. بعد ذلك ، يتم تحميل K-A-A-P-C بتيدات مختلفة ذات أهمية لاستهداف مجموعة الخلايا التائية الخاصة بالمستضد غير المرغوب فيه.

في النهاية ، يمكن إجراء تحليل السيتريك التدفق لقياس القتل المضاد للدهون الخاص بالمستضد للخلايا التائية بواسطة التحميل المتشابه. كيه إيه بي سي. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما واجهنا مشكلات في العمل على تطوير خلية تقديم مستضد قاتل قائم على الخلية بينما نعمل في نفس الوقت على تطوير منصة قائمة على الإيقاع. تقنية تعديل الخلايا المناعية لتوليد K-A-A-P-C أولا ، أضف 250 ميكرولترا من حبات الإيبوكسي من المخزون و 250 ميكرولترا من عازلة البورات المعدة حديثا في قارورة زجاجية علوية لولبية معقمة.

ضع القارورة على مغناطيس للسماح للخرز بالالتصاق بعد دقيقتين ، واستنشق المخزن المؤقت وإزالة القارورة من المغناطيس. اغسل الخرزات مرة واحدة بمليلتر آخر من المخزن المؤقت ثمانية ، ثم أعد تعليقها في 550 ميكرولتر من HLA A two IG و CD 95 MAB المضاد للإنسان. رج القارورة برفق لخلط الخرزات مع الأجسام المضادة ثم احتضان الخرزات على طرف مدور عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي ، قم بتدوير الخرزات لمدة دقيقتين عند 300 جي ودرجة حرارة الغرفة وأعد القارورة إلى المغناطيس. بعد دقيقتين ، استنشق المخزن المؤقت للتحميل. قم بإزالة القارورة من المغناطيس واغسل الخرزات في ملليلتر واحد من محلول الغسيل مع رج دقيق.

بعد الغسيل الثالث ، قم بتدوير القارورة في مليلتر واحد من محلول غسيل الخرز الطازج لمنع أي مواقع ربط بالبروتين المتبقية. في اليوم التالي ، قم بتدوير الخرزات مرة أخرى وضع القارورة مرة أخرى على المغناطيس. بعد دقيقتين ، قم بشفط مخزن الغسيل.

قم بإزالة القارورة من المغناطيس وأضف ملليلتر واحد من PBS إلى KAPC. للتحقق من جودة الخرزات ، انقل 1.5 مرة 10 إلى خمس K-A-A-P-C إلى أنبوب فاكس واغسلها بمليلتر واحد من مخزن غسيل الفاكس Resus. قم بتعليق حبيبات الخرزة في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل وأضف ميكرولتر واحد من IgG المضاد للماوس PE واحد للكشف عن HLA A و Two IG وميكرولتر واحد من IG MFI TC المضاد للفأر للكشف عن CD 95 MAB المضاد للبشر.

ثم بعد حضانة لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، اغسل الخرزات في ملليلتر واحد من مخزن غسيل الفاكس Resus. قم بتعليقها في 250 ميكرولتر من محلول الغسيل واقرأ العينات على مقياس التدفق الخلوي لتحميل الببتيد. انقل مرتين 10 إلى السابع من K-A-A-P-C إلى قارورة زجاجية معقمة جديدة.

ثم بعد وضع الخرزات على المغناطيس لمدة دقيقتين ، قم بشفط PBS وأعد تعليق الخرزات في 500 ميكرولتر من PBS الطازج الذي يحتوي على خمسة ميكروغرامات من الببتيد. قم بتسمية القارورة بتاريخ واسم الببتيد المحمل ، K-A-A-P-C. ثم قم بتخزين K-A-A-P-C المحمل عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة أيام على الأقل للسماح بتحميل الببتيد الكافي على HLA A ثنائي IG لإجراء اختبار القتل في المختبر.

اغسل الببتيد المحمل K-A-A-P-C كما هو موضح ست مرات على الأقل لإزالة جميع الببتيد الحر. ثم انقل K-A-A-P-C ومرتين 10 إلى الخلايا التائية الخاصة بالمستضد الخامس إلى بئر واحد لكل عينة من صفيحة سفلية مستديرة 96 بئر في 200 ميكرولتر من وسط الزراعة المشتركة بنسبة واحد إلى واحد بعد 48 ساعة من الزراعة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. انقل العينات إلى أنابيب الفاكس المناسبة واغسلها في مليلتر واحد من مخزن مؤقت ملزم من nexin خمسة.

بعد ذلك ، أعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من مخزن مؤقت ملزم nexin five ، ثم احتضان العينات في ميكرولتر واحد من nexin five FITC وخمسة ميكرولترات من سبعة أ د في درجة حرارة الغرفة. بعد 10 إلى 15 دقيقة ، اغسل العينات بمليلتر واحد من مخزن مؤقت ملزم من nexin five وأعد تعليق الكريات في 250 ميكرولتر من مخزن مؤقت ملزمة nin خمسة. ثم اقرأ العينات على الفور على مقياس التدفق الخلوي.

شاشة K-A-A-P-C HLA A TWO IG ، و Antifa MAB في نفس الوقت ، والتي بالمقارنة مع الأساليب القائمة على الخلايا ، لا يتم تغييرها عن طريق كفاءات الترميز أو التحويل ويمكن تعديلها بسهولة أثناء الإنتاج. K-A-A-P-C قادرة على استنفاد الخلايا التائية الخاصة بالمستضد في المختبر عند تحميلها بالببتيد المماثل ، بينما يتم تحميلها بشكل غير متشابه. لا تستنفد K-A-A-P-C الخلايا التائية ، وبالتالي فإن موت الخلايا المبرمج للخلايا التائية الناجم عن K-A-A-P-C بطريقة محددة للمستضد.

بعد ذلك ، عند استخدام K-A-A-P-C للاستنفاد الانتقائي للخلايا التائية الخاصة بالمستضد من خليط من خصائص الخلايا التائية المختلفة فقط ، يتسرب الحد الأدنى من السمية الخلوية إلى الخلايا التائية المجاورة. وبالتالي ، فإن K-A-A-P-C تمثل أداة رائعة للمستضد في المختبر ، واستنفاد خاص بالمستضد للخلايا التائية الخاصة بالمستضد البشري المنشط مع قابلية تطبيق سريرية محتملة لعلاج أمراض المناعة الذاتية ورفض الطعم الخيفي بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة الخلوية لاستكشاف طرق جديدة لعلاج أمراض المناعة الذاتية بوساطة الخلايا التائية ورفض الزرع.