القياس الكمي القائم على الجسيمات النانوية المترافقة بالأجسام المضادة باستخدام المجهر المجهري للمجال المظلم: إجراء لالتقاط وقياس جسيمات خارجية معينة من سوائل الجسم

الإكسوسومات عبارة عن هياكل صغيرة محاطة بالغشاء تفرزها الخلايا في الفضاء خارج الخلية. توجد الإكسوسومات بكثرة في السوائل الحيوية.

لتحديد والتقاط جسيمات خارجية معينة من سوائل الجسم ، ابدأ بأخذ شريحة مقايسة مناعية متعددة الآبار. تعمل هذه الشريحة بالبروتينات التي تعمل كمستضدات وترتبط بأجسام مضادة معينة.

استكمل الشريحة بمحلول الجسم المضاد الأساسي المطلوب واحتضانه. ترتبط هذه الأجسام المضادة بالمستضدات المطلية مسبقا على سطح الشريحة.

استنشق المحلول المتبقي لإزالة أي أجسام مضادة غير مرتبطة. الآن ، أضف حاجزا حاجب يمنع المستضدات الحرة ، وبالتالي يمنع الارتباط غير المحدد للإكسوسومات.

بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت المانع ، وقم بتحميل الإكسوسومات التي تحتوي على تعليق المصل على الشريحة ، واحتضنها. هذا يسمح بالارتباط الحصري للإكسوسومات الخاصة بالهدف بالأجسام المضادة الأولية التي تم التقاطها.

بعد ذلك ، قم بتحميل تعليق من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بجسيمات الذهب النانوية على سطح الشريحة. ترتبط هذه الأجسام المضادة بالإكسوسومات المرتبطة مسبقا وتشكل مركب كشف.

أخيرا ، باستخدام ماصة ، تخلص من أي أجسام مضادة ثانوية غير مرتبطة. تصور الشرائح تحت مجهر المجال المظلم. جسيمات الذهب النانوية الموجودة على سطح الإكسوسومات تشتت الضوء وتظهر كبقع مضيئة على الخلفية المظلمة.

لبدء تحضير الشريحة ، قم بتخفيف الأجسام المضادة المطلوبة لالتقاط الإكسوسوم إلى 0.025 ملليغرام لكل مليلتر في PBS. ماصة 1 ميكرولتر من المحلول في كل بئر من شريحة معالجة بالبروتين A / G مدعومة بزجاج بصري. بعد ذلك ، انقل الشريحة إلى صندوق ترطيب لضمان عدم جفاف الآبار أثناء الحضانة.

احتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لشل حركة الأجسام المضادة الملتقطة. ثم استنشق المحلول المتبقي لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة. اغسل الآبار بإضافة وشفط 1 ميكرولتر من PBS ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بتحميل كل بئر بسرعة ب 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب القائم على PBS ، واحتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.

عند تشغيل حوالي 15 عينة ، يجب علينا استخدام ماصة أحادية القناة لتحميل عازلة العمل على 120 بئرا في أقل من 5 دقائق لتجنب تبخر عامل الحبس.

ابدأ في تحضير محلول من قضبان الذهب النانوية المترافقة بالأجسام المضادة أثناء حجب الانزلاق. قبل حوالي 30 دقيقة من انسداد التشطيبات ، قم بإذابة عينات البلازما أو المصل بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة الغرفة. دوامة العينات المذابة لمدة 30 ثانية للتأكد من أن المعلقات متجانسة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 500 × جم لمدة 15 دقيقة لترسيب مجاميع البروتين وغيرها من الحطام.

انقل 10 ميكرولتر من المواد الطافية إلى أنابيب جديدة وقم بعمل تخفيفات فردية باستخدام PBS. امزج العينات المخففة عن طريق دوامة لطيفة أو انعكاس حسب الاقتضاء. عند الانتهاء من حجب الشرائح ، قم بشفط المخزن المؤقت للحجب واغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 1 ميكرولتر من PBS. قم بتحميل العينات على الفور في الآبار مع 1 ميكرولتر لكل بئر و 8 مكررات لكل عينة.

قم بتحميل معايير الإكسوسوم في الآبار المناسبة بنفس الطريقة. احتضن الشريحة لمدة 12 إلى 18 ساعة في الثلاجة عند 4 درجات مئوية. ثم قم بشفط الآبار واغسل كل بئر مرة واحدة باستخدام 1 ميكرولتر من PBS. قم بتحميل 1 ميكرولتر من تعليق قضبان الذهب النانوية المترافقة بالأجسام المضادة في كل بئر واحتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.

بعد ذلك ، قم بشفط تعليق القضيب النانوي واغسل الشريحة في PBS مع 0.01٪ Polysorbate-20 لمدة 10 دقائق باستخدام الخلاط. ثم قم بشفط الآبار واغسل الشريحة بالماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق على خلاط دوار. قم بإزالة الماء واترك الشريحة تجف في الهواء في طبق بتري نظيف قبل إحضار الشريحة إلى مجهر المجال المظلم.