المتلازم الخفيفة والمجهر الإلكتروني عن طريق الكم دوت النانوية

الهدف العام لهذه الطريقة هو الحصول على ضوء مترابط وفحص مجهري إلكتروني ، أو بيانات CLEM ، من خلال الجمع بين المعلومات الكيميائية المناعية الفلورية مع التشكل الهيكلي الفائق من المجهر الإلكتروني للإرسال في صورة واحدة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال كيمياء الخلايا المناعية وعلم الأمراض ، مثل البنية الخلوية الفرعية التي تعتبر بروتين معين ذي أهمية مرتبطة بها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم نفس مسبار الجسيمات النانوية ذات النقاط الكمومية للحصول على كل من إشارة الفحص المجهري الحي من البروتين المستهدف والتوطين الهيكلي للمجهر الإلكتروني.

بعد تثبيت وتضمين وتقسيم أنسجة ورم الورم الجسدي البشري وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد محلول لاصق عن طريق وضع 20 سم من الشريط اللاصق الشفاف في زجاجة سعة خمسة ملليلتر تحتوي على 2.0 مل من الأسيتون واتركها لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الشريط واغمس شبكة النيكل في المحلول ، ثم قم بإزالة الشبكة واتركها تجف في الهواء. بمجرد أن يجف ، استخدم الجانب الباهت من الشبكة لالتقاط قسم رفيع للغاية.

من الأهمية بمكان تحديد وقت النقش الصحيح لتركيبة الراتنج المختارة. تعمل 30 دقيقة بشكل جيد لهذه التركيبة ، ولكن قد تحتاج إلى إعادة حسابها للحصول على تركيبات أكثر صلابة أو نعومة. قم بإعداد مليلتر واحد من محلول نقش ميتابريدات الصوديوم المشبع الطازج في الماء المقطر وضع قطرات من المحلول على سطح فيلم مختبر نظيف.

ضع شبكات جافة تماما مع أقسام على القطرات واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم انقل الشبكات إلى قطرات الماء المقطر لمدة 60 ثانية لغسلها. لإجراء الأجسام المضادة والنقطة الكمومية ، أو وضع العلامات على QD ، على سطح فيلم مختبر نظيف ، قطرات ماصة 0.05 مولار جلايسين و PBS.

ضع الشبكات على القطرات واحتضانها لمدة 10 دقائق لمنع الألدهيد المتبقي على الأقسام. لإزالة كتلة الألدهيد ، امسح حافة الشبكة لفترة وجيزة. ثم ضع الشبكة على قطرة من مصل الماعز العادي بنسبة واحد بالمائة ، أو NGS ، وواحد بالمائة من BSAC في PBS لمدة 10 دقائق.

قم بإعداد مليلتر واحد من محلول الحجب عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من NGS و 100 ميكرولتر من BSAC إلى 890 ميكرولتر من PBS. بعد ذلك ، قم بتكييف الأقسام عن طريق وضعها على قطرة من مخفف الأجسام المضادة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، استخدم مخفف الأجسام المضادة لتخفيف الجسم المضاد متعدد النسيلة المضاد للسوماتوستاتين من واحد إلى 10 ، ووضع الشبكات على قطرات المحلول.

احتضن في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. بعد الحضانة ، قم بإزالة كاشف الجسم المضاد عن طريق نشاف حافة الشبكة. ثم استخدم مخفف الأجسام المضادة لغسل الأقسام مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما.

بعد تخفيف الجسم المضاد الثانوي من واحد إلى 10 وتحضير القطرات ، احتضان الشبكات على القطرات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم قم بإزالة محلول الجسم المضاد وغسل الأقسام مرتين. تمييع الستربتافيدين QDs مترافق من واحد إلى 10 واحتضان العينات على قطرات من المحلول في الظلام ، في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

ثم استخدم مخفف الأجسام المضادة لغسل الشبكات مرتين ، كل مرة لمدة خمس دقائق ، وصمة عار على حافة الشبكات. بعد ذلك ، اغسل الشبكات بالماء المقطر لمدة دقيقتين قبل تجفيف الحواف. ضع قسم الشبكة الملطخة بالمناعة في قطرة ماء على شريحة زجاجية واستخدم زلة غطاء زجاجي لتغطيتها.

لإجراء الفحص المجهري الضوئي الفلوري ، أدخل مكعب مرشح بالخصائص التالية واستخدم إضاءة LED 365 نانومتر. ضع القسم المناعي على مرحلة المجهر المناعي. استخدم الفحص المجهري الضوئي لتقييم نمط الملصقات ومستوى أي وضع علامات غير محددة وإثبات أن الضوابط السلبية واضحة.

بعد ذلك ، حدد عائد الاستثمار فيما يتعلق بأشرطة الشبكة. ثم اضبط كاميرا رقمية ملونة بالكامل على لون FL التلقائي واضبط توازن اللون الأبيض على 3 ، 200 كلفن ، واضبط الكاميرا على وضع التعريض التلقائي مع إعداد جاما بين 0.45 و 1.00 لتحسين مظهر الصور ، وضبط الكسب التناظري على X واحد ، انقر فوق رمز الكاميرا في الواجهة الرسومية لبرنامج ZEN Two Light للعيش. ثم ركز على الصورة وانقر فوق Snap في الواجهة الرسومية لبرنامج ZEN Two Light لالتقاط الصورة إلى متجر الإطارات.

احفظ الصور كملفات tf لتجنب الضغط والبكسل. قم بإعداد طباعة توضح موضع عائد الاستثمار فيما يتعلق بقضبان الشبكة أو غيرها من معالم الأنسجة المهمة. ثم قم بإزالة الشبكة من الشريحة ، واغسلها بالماء المقطر ، وجفف الحواف برفق.

لإجراء الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال ، انقل الشبكة إلى المجهر لفحصها باستخدام جهد متسارع يبلغ 100 كيلو فولت. ابدأ بتكبير منخفض يبلغ حوالي 1,400X للتنقل حول الشبكة والعثور على عائد الاستثمار مع تلك الموجودة في الفحص المجهري الضوئي. راقب QDs الفردية بتكبير 70 ، 000X أو أعلى.

ستظهر كهياكل بلورية غير منتظمة ذات كثافة إلكترون معتدلة. بعد ذلك ، باستخدام كاميرا رقمية مزودة بمستشعر أحادي اللون 1 ، 392 × 1 ، 040 بكسل في الواجهة الرسومية لبرنامج التصوير ، انقر فوق رمز الكاميرا لتشغيل الصور والحصول عليها. حرك أيقونة الكاميرا إلى وضع إيقاف التشغيل لتخزين الصورة في مخزن الإطارات.

لإجراء تصوير CLEM ، استخدم طباعة من التصوير المجهري الضوئي لتحديد عائد الاستثمار المقابل بواسطة TEM. الميزات المعمارية للأنسجة مفيدة للتنقل حول القسم. التقط صورة لعائد الاستثمار المقابل بواسطة TEM.

بعد ذلك ، لإعداد صورة CLEM ، تأكد من توجيه صورة TEM بشكل صحيح وتكبيرها إلى نفس حجم ودقة صورة المجهر الضوئي ، في هذه الحالة ، 300 بكسل لكل بوصة. قم بتوسيع حجم لوحة الصورة المجهرية الضوئية لمضاعفة حجمها. ثم انسخ والصق صورة TEM بجانب الصورة الفلورية.

لإنشاء تراكب مضان في Photoshop CS2 ، انقر فوق أداة تحديد مستطيلة ، وحدد صورة الفلورسنت ، وقم بإنشاء طبقة مكررة منها. اضبط خيارات مزج نمط الطبقة على شفافية 30 إلى 40٪. ثم انقر فوق أداة النقل واسحب طبقة تراكب التألق فوق صورة TEM المقابلة ، وقم بمحاذاة الصور.

بعد محاذاة الصور ، قم بتسطيح الصورة لإنتاج التراكب النهائي. ثم استخدم أداة تحديد الإطار المستطيلة لتحديد صورة التراكب الجديدة ونسخها إلى لوحة قماشية جديدة. أخيرا ، احفظ الصورة كملف tf.

في صورة المجهر الفلوري هذه ، تحتوي الخلايا السرطانية الفردية للورم الجسدي على حبيبات إفرازية وفيرة وتم تصنيفها بشكل إيجابي لهرمون السوماتوستاتين. ظهرت النوى على شكل ثقوب داكنة وعند تكبير منخفض ، شوهد مضان QD برتقالي حبيبي مكثف بشكل متغير في السيتوبلازم. تم التعرف على عائد الاستثمار الذي تم اختياره بواسطة الفحص المجهري الضوئي وتصويره باستخدام TEM من خلال الرجوع إلى صورة مجهرية ضوئية 20X كما هو موضح هنا.

عند التكبير العالي ، تظهر الخلية تألق ساطع وملصقات QD مكثفة في حبيبات السيتوبلازم. يشير تراكب بيانات التألق على صور TEM ، كما في هذا المثال ، إلى أن الملصقات الإيجابية القوية تتوافق مع الحبيبات التي تحتوي على مادة كثيفة الإلكترون بشكل معتدل داخل الغشاء المحدد للحويصلة. أخيرا ، كما هو موضح هنا عند التكبير العالي ، أظهرت الحبيبات الكثيفة الإلكترون بشكل معتدل وضع العلامات المناعية المكثفة للبلورات النانوية QD.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل مع الشبكات بعناية ، من خلال الحواف فقط. قد يؤدي لمس القسم أثناء التقاط الشبكة إلى فصل القسم عن الشبكة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل وضع العلامات المناعية متعددة الإرسال من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل هل يتوطين البروتين الذي يثير اهتمامك مع بروتين آخر. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأمراض لاستكشاف توطين البروتين في عملية الأنسجة البشرية الأرشيفية للفحص المجهري الإلكتروني. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الجمع بين المعلومات الكيميائية المناعية من الفحص المجهري الضوئي الفلوري مع البنية الفائقة من المجهر الإلكتروني للإرسال.

لا تنس أن العمل باستخدام رابع أكسيد الأوزميوم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية والعمل في غطاء الدخان والتخلص المناسب من النفايات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.