المتلازم الخفيفة والمجهر الإلكتروني عن طريق الكم دوت النانوية

الهدف العام من هذه الطريقة هو الحصول على بيانات المجهر الضوئي والإلكتروني المترابط، أو بيانات CLEM، من خلال دمج معلومات الكيمياء النسيجية المناعية الفلورية مع المورفولوجيا فائقة البنية المستمدة من المجهر الإلكتروني النافذ في صورة واحدة. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الكيمياء النسيجية المناعية وعلم الأمراض، مثل تحديد البنية تحت الخلوية المرتبطة ببروتين معين محل الدراسة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدام نفس مسبار الجسيمات النانوية من النقاط الكمومية للحصول على كل من إشارة المجهر الحي من البروتين المستهدف والتحديد الموضعي البنيوي بالمجهر الإلكتروني.

بعد تثبيت وأطمار وتقطيع نسيج ورم السوماتوستاتينوما البشري وفقاً للبروتوكول المكتوب، قم بتحضير محلول لاصق للمقاطع عن طريق وضع 20 سنتيمتر من شريط لاصق شفاف في زجاجة سعة خمسة مليليتر تحتوي على 2.0 مليليتر من الأسيتون واتركها لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الشريط واغمس شبكة نيكل في المحلول، ثم أخرج الشبكة واتركها لتجف في الهواء. وبمجرد جفافها، استخدم الجانب غير الحاد من الشبكة لالتقاط مقطع فائق الرقة.

من الضروري تحديد وقت النقش الصحيح لتركيبة الراتنج المختارة. تعد مدة 30 دقيقة مناسبة لهذه التركيبة، ولكن قد يلزم إعادة حسابها للتركيبات الأكثر صلابة أو ليونة. قم بتحضير واحد مليليتر من محلول نقش ميتابيريودات الصوديوم المشبع الطازج في ماء مقطر، وضع قطرات من المحلول على سطح فيلم مختبري نظيف.

ضع الشبكات الجافة تماماً والتي تحتوي على المقاطع فوق القطرات واتركها لتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، انقل الشبكات إلى قطرات من الماء المقطر لمدة 60 ثانية لغسلها. ولإجراء عملية وسم الأجسام المضادة والنقاط الكمومية، أو QD، على سطح فيلم مختبري نظيف، استخدم الماصة لإضافة قطرات من جلايسين بتركيز 0.05 مولار ومحلول PBS.

ضع الشبكات فوق القطرات واتركها لمدة 10 دقائق لحجب الألدهيد المتبقي على المقاطع. ولإزالة حاجب الألدهيد، قم بتجفيف حافة الشبكة بسرعة. ثم ضع الشبكة فوق قطرة من مصل الماعز الطبيعي (NGS) بتركيز 1%، و BSAC بتركيز 1% في محلول PBS لمدة 10 دقائق.

قم بتحضير واحد ملليلتر من محلول الحجب عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من NGS و100 ميكرولتر من BSAC إلى 890 ميكرولتر من PBS. بعد ذلك، قم بتهيئة المقاطع بوضعها على قطرة من مخفف الأجسام المضادة لمدة 10 دقائق. تالياً، استخدم مخفف الأجسام المضادة لتخفيف الجسم المضاد متعدد النسائل لـ anti-somatostatin بنسبة واحد إلى 10، وضع الشبكات على قطرات من هذا المحلول.

يتم التحضين في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد التحضين، يتم إزالة كاشف الأجسام المضادة عن طريق تجفيف حافة الشبكة. ثم يُستخدم مخفف الأجسام المضادة لغسل القطاعات مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة.

بعد تخفيف الجسم المضاد الثانوي بنسبة 1 إلى 10 وتحضير القطرات، يتم تحضين الشبكات على القطرات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، يتم إزالة محلول الجسم المضاد وغسل المقاطع مرتين. يتم تخفيف النقاط الكمومية (QDs) المقترنة بالستريبتاديفيدين بنسبة 1 إلى 10 وتحضين العينات على قطرات من المحلول في الظلام، في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، استخدم مُخفف الأجسام المضادة لغسل الشبكات مرتين، لمدة خمس دقائق في كل مرة، ثم جفف حواف الشبكات بالتربيت. بعد ذلك، اغسل الشبكات بالماء المقطر لمدة دقيقتين قبل تجفيف الحواف بالتربيت. ضع مقطع الشبكة المصبوغ مناعياً في قطرة من الماء على شريحة زجاجية، ثم غطِّه باستخدام غطاء شريحة زجاجي.

لإجراء الفحص بالمجهر الضوئي الفلوري، أدخل مكعب ترشيح بالخصائص التالية واستخدم إضاءة LED بطول موجي 365 نانومتر. ضع المقطع المصبوغ مناعيًا على منصة مجهر التألق المناعي. استخدم المجهر الضوئي لتقييم نمط الوسم، ومستوى أي وسم غير نوعي، وللتأكد من خلو الضوابط السلبية من أي إشارات.

بعد ذلك، حدد المناطق ذات الاهتمام (ROIs) بالنسبة لأشرطة الشبكة. ثم اضبط الكاميرا الرقمية ذات الألوان الكاملة على وضع FL auto color واضبط توازن اللون الأبيض على 3,200 K. اضبط الكاميرا على وضع التعريض التلقائي مع ضبط قيمة غاما بين 0.45 و1.00 لتحسين مظهر الصور، واضبط الكسب التناظري (analog gain) على 1X. انقر فوق أيقونة الكاميرا في الواجهة الرسومية لبرنامج ZEN Two Light للعرض المباشر. ثم قم بضبط تركيز الصورة وانقر على Snap في الواجهة الرسومية لبرنامج ZEN Two Light لالتقاط الصورة وحفظها في مخزن الإطارات.

احفظ الصور بتنسيق tf لتجنب الضغط وتكسر البكسلات. قم بإعداد نسخة مطبوعة توضح موضع منطقة الاهتمام (ROI) بالنسبة لقضبان الشبكة أو أي معالم نسيجية بارزة أخرى. ثم قم بإزالة الشبكة من الشريحة، واغسلها بالماء المقطر، وجفف الحواف بلطف عن طريق التنشيف.

لإجراء المجهر الإلكتروني النافذ، انقل الشبكة إلى المجهر للفحص باستخدام جهد تسريع قدره 100 kilovolts. ابدأ بتكبير منخفض يبلغ 1, 400X تقريبًا للتنقل عبر الشبكة والعثور على المناطق ذات الأهمية (ROIs) التي تم تحديدها باستخدام المجهر الضوئي. لاحظ النقاط الكمومية (QDs) الفردية عند تكبير 70, 000X أو أعلى.

ستظهر على شكل تراكيب بلورية غير منتظمة ذات كثافة إلكترونية متوسطة. بعد ذلك، وباستخدام كاميرا رقمية بمستشعر أحادي اللون بدقة 1,392 في 1,040 بكسل في الواجهة الرسومية لبرنامج التصوير، انقر على أيقونة الكاميرا لتفعيلها والتقاط الصور. حرك أيقونة الكاميرا إلى وضع الإيقاف لتخزين الصورة في مخزن الإطارات.

لإجراء التصوير المجهري المترابط (CLEM)، استخدم نسخة مطبوعة من تصوير المجهر الضوئي لتحديد مناطق الاهتمام (ROIs) المقابلة بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). وتعتبر السمات البنيوية للأنسجة مفيدة للتنقل عبر المقطع. قم بالتقاط صورة لمنطقة الاهتمام المقابلة بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM).

بعد ذلك، لتحضير صورة CLEM، تأكد من توجيه صورة TEM بشكل صحيح وتكبيرها لتصبح بنفس حجم ودقة صورة المجهر الضوئي، وهي في هذه الحالة 300 بكسل لكل بوصة. قم بزيادة حجم مساحة عمل (canvas) صورة المجهر الضوئي إلى ضعف حجمها. ثم قم بنسخ لصق صورة TEM بجانب صورة الفلورة.

لإنشاء تراكب فلوري في برنامج Photoshop CS2، انقر على أداة التحديد المستطيل (rectangular marquee tool)، وحدد الصورة الفلورية، ثم أنشئ طبقة مكررة منها. اضبط خيارات المزج في نمط الطبقة لتكون الشفافية بنسبة 30 إلى 40%. بعد ذلك، انقر على أداة التحريك (move tool) واسحب طبقة التراكب الفلورية فوق صورة TEM المقابلة، وقم بمحاذاة الصور.

بعد محاذاة الصور، قم بتسطيح الصورة لإنتاج التراكب النهائي. ثم استخدم أداة التحديد المستطيل (rectangular marquee tool) لتحديد صورة التراكب الجديدة ونسخها إلى مساحة عمل جديدة. وأخيرًا، احفظ الصورة كملف tf.

في صورة المجهر الفلوري هذه، تحتوي خلايا ورم السوماتوستاتينوما الفردية على حبيبات إفرازية وفيرة، وقد تم وسمها بشكل إيجابي لهرمون السوماتوستاتين. ظهرت النوى كثقوب داكنة، وعند استخدام تكبير منخفض، لوحظ فلورة نقاط كمومية (QD) برتقالية حبيبية متفاوتة الكثافة في السيتوبلازم. وقد تم التعرف على المنطقة المختارة (ROI) بواسطة المجهر الضوئي وتصويرها باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) بالرجوع إلى صورة مجهر ضوئي بتكبير 20X كما هو موضح هنا.

عند التكبير الأعلى، تظهر الخلية فلورية ساطعة ووسمًا كثيفًا بالنقاط الكمومية (QD) في الحبيبات السيتوبلازمية. ويشير تراكب بيانات الفلورية على صور المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)، كما في هذا المثال، إلى أن الوسم الإيجابي القوي يتوافق مع الحبيبات التي تحتوي على مادة متوسطة الكثافة الإلكترونية داخل الغشاء المحدِّد للحويصلة. وأخيرًا، كما يظهر هنا عند التكبير الأعلى، أظهرت الحبيبات متوسطة الكثافة الإلكترونية وسمًا مناعيًا كثيفًا بالبلورات النانوية للنقاط الكمومية (QD).

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون ثماني ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق الإجراء، من المهم تذكر التعامل مع الشبكات بحذر، ومن الحواف فقط؛ إذ إن لمس المقطع أثناء التقاط الشبكة قد يؤدي إلى فصل المقطع عنها.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الوسم المناعي المتعدد (multiplex immunolabeling) للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما إذا كان البروتين محل الدراسة يتوضع بشكل مشترك مع بروتين آخر. وقد مهدت هذه التقنية، بعد تطويرها، الطريق للباحثين في مجال علم الأمراض لاستكشاف توضع البروتين في أنسجة بشرية مؤرشفة ومعالجة للمجهر الإلكتروني. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دمج المعلومات الكيمياوية المناعية الخلوية المستمدة من مجهر الفلورسنس الضوئي مع البنية فائقة الدقة المستمدة من المجهر الإلكتروني النافذ.

لا تنسَ أن التعامل مع رباعي أكسيد الأوزميوم قد يكون خطيراً للغاية، ويجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء معدات الوقاية، والعمل داخل خزانة استخلاص الغازات (fume hood)، والتخلص السليم من النفايات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.