الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن تفاعلات الجسيمات النانوية الفلورية مع مجموعات الخلايا المناعية الأولية عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة الخلايا ذات الأهمية أولا بالجسيمات النانوية. في الخطوة التالية ، يتم تصنيف الخلايا بجسم مضاد ضد علامات السطح الخاصة بالخلية ثم يتم تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

في النهاية ، يمكن قياس تفاعل الجسيمات النانوية مع مجموعات الخلايا المناعية الفردية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحص المجهري هي أنه باستخدام هذه التقنية ، يمكن قياس الاختلافات في شدة التألق التي تسببها الجسيمات النانوية في مجموعات الخلايا غير الملتصقة لاستيعاب الجسيمات النانوية في الدم البيضاء ، أو الخلايا الوحيدة المنقاة تبدأ بالطلاء خمس مرات 10 إلى خمس الخلايا ذات الأهمية في مليلتر واحد لكل بئر. في كل بئر من 12 بئر صفيحة.

ثم أضف 10 ميكرولترات من تعليق الجسيمات النانوية لثاني أكسيد السيليكون الفلوري المحضر حديثا إلى كل بئر تجريبي ، مع إضافة حجم متساو من الوسط الكامل إلى آبار التحكم غير المعالجة في هذا الوقت أيضا. بعد استيعاب ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، انقل العينات إلى أنابيب بولي بروبلين فردية سعة 1.5 مليلتر ، ثم قم بتدوير العينات لمدة ثلاث دقائق عند 6،000 مرة G ودرجة حرارة الغرفة لتلطيخ الخلايا بقرص مضغوط 14 عبر احتضان 100 ميكرولتر من كل معلق خلية في 10 ميكرولتر من الجسم المضاد البشري بنسبة واحد إلى 11 في تشغيل المخزن المؤقت لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد غسل الجسم المضاد غير المرتبط في مليلتر واحد من المخزن المؤقت الجاري ، أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الطازج لتحليل قياس التدفق الخلوي.

بعد ذلك ، لإعداد تعويض الامتداد الطيفي ، افتح مربع إعدادات الجهاز في برنامج قياس التدفق الخلوي ، ثم احصل على عينة خالية من الجسيمات النانوية غير المسماة بجسم مضاد بسرعة سائلة منخفضة. يعد ضبط إعدادات التعويض في وجود الجسيمات النانوية الفلورية هو أصعب جزء من الإجراء حيث يمكن للجسيمات النانوية أن تتداخل مع التشتت الجانبي لضمان النجاح ، ويجب تحديد بوابة لمجموعة الخلايا ذات الأهمية اضبط التشتت الأمامي والجانبي يدويا عن طريق تنظيم قنوات الجهد. ثم ارسم بوابة كبيرة بشكل مناسب حول مجموعة الخلايا المطلوبة.

قم بتحميل عينة أخرى غير مسماة، وافتح علامة تبويب التعويض في مربع إعدادات الجهاز. اضبط عامل التعويض أثناء الاستحواذ حتى تكون شدة التألق في قناة الامتداد هي نفسها تقريبا بالنسبة للمجموعات السكانية الإيجابية والسالبة للفلوروكروم. أخيرا ، بعد ضبط التعويض لكل أنبوب تحكم فلوروكروم ملطخ ، اقرأ العينات المعالجة بالجسيمات النانوية في محاولة لتوصيف سلوك خلايا الدم البيضاء بشكل أفضل استجابة للجسيمات النانوية ، تم إجراء فحوصات الاستيعاب كما هو موضح للتو.

على سبيل المثال ، في هذه التجربة التمثيلية ، تم تحديد ثلاث مجموعات سكانية فرعية رئيسية من كريات الدم البيضاء بوضوح عن طريق التشتت الأمامي والجانبي بعد عزل PBMC. علاوة على ذلك ، بعد معالجة ثاني أكسيد السيليكون fz ، أظهرت الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة والخلايا المحببة معدلات استيعاب مختلفة للجسيمات النانوية كما يتضح من شدة تألقها. في هذه الصور ، يتم توضيح استيعاب الجسيمات النانوية في الخلايا الوحيدة الموجبة CD 14 الأولية المنقاة من pbmc.

تعرض هذه المخططات المبعثرة الخلايا الوحيدة الموجبة CD 14 في وجود جزيئات ثاني أكسيد السيليكون النانوية في فيتز. يوضح الرسم البياني القياس الكمي للخلايا الموجبة اللطيفة التي يتم التعبير عنها على أنها شدة التألق. تم إجراء تجارب استيعاب مماثلة مع الخلايا الوحيدة TP one المعالجة بتركيزات متزايدة من جزيئات ثاني أكسيد السيليكون النانوية في فيتز مع خلايا غير معالجة كعنصر تحكم سلبي.

توضح المخططات النقطية الزيادة المعتمدة على الجرعة في التشتت الجانبي مع تشتت أمامي غير متغير في خط خلية TP واحد بعد استيعاب الجسيمات النانوية. تشير البيانات من هذه الرسوم البيانية إلى أن العلاج بجسيمات ثاني أكسيد السيليكون النانوية من فيتز يحفز استيعاب يعتمد على الجرعة في الخلايا الوحيدة التي تم تسليط الضوء عليها من خلال تعزيز الحبيبات داخل الخلايا لاكتساب مزيد من التبصر في التفاعلات بين الخلايا المناعية والجسيمات النانوية ، تم زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة لمدة سبعة أيام في المختبر واحتضانها بالجسيمات النانوية لمدة ساعة واحدة. أشار الفحص المجهري الفلوري إلى ثقافة الخلايا الدبقية الأولية المختلطة مع عدد كبير من الخلايا النجمية غير الملتصقة السلبية GFP وبعض الخلايا الإيجابية GFP.

في هذه التجربة التمثيلية ، يمكن تمييز ثلاثة مجموعات سكانية فرعية دبقية عن طريق قياس التدفق الخلوي مع جسم مضاد واحد CD 11 B تلطيخ CD 11 B ، والخلايا النجمية السلبية GFP السلبية والخلايا الدبقية الأخرى الخلايا الدبقية CD 11 B إيجابية GFP السلبية ، و CD 11 B إيجابية GFP الفرعية الإيجابية. المجموعتان الفرعيتان الأخيرتان قادران على استيعاب الجسيمات النانوية مع نقص متزايد قليلا من قبل السكان الإيجابيين الإجماليين. يمكن التحقق من استيعاب الجسيمات النانوية بشكل أكبر عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر كما هو موضح في هذه الصورة باستخدام الجسيمات النانوية لثاني أكسيد السيليكون الدومين.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الاحتفاظ بالعينات في الظلام لتجنب تبيض الأصباغ الفلورية والحفاظ على العينات عند أربع درجات أثناء حضانة الأجسام المضادة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص المجهري متحد البؤر للإجابة على سؤال إضافي حول توطين الجسيمات النانوية داخل الخلايا.