الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن تفاعلات الجسيمات النانوية الفلورية مع المجموعات الفرعية للخلايا المناعية الأولية باستخدام قياس التدفق الخلوي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق معالجة الخلايا المستهدفة بالجسيمات النانوية. وفي الخطوة التالية، يتم وسم الخلايا باستخدام أجسام مضادة ضد علامات سطحية محددة للخلايا، ومن ثم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي.

وفي النهاية، يمكن قياس تفاعل الجسيمات النانوية مع مجموعات الخلايا المناعية الفردية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل المجهر في أنها تسمح بقياس التباينات في شدة الفلورسنت الناتجة عن الجسيمات النانوية في مجموعات الخلايا غير الملتصقة. وفيما يخص استيعاب الجسيمات النانوية داخل كرات الدم البيضاء، أو المونوسيتات المنقاة، ابدأ بنثر 5×10⁵ من الخلايا المستهدفة في 1 mL لكل بئر، وذلك في كل بئر من أطباق ذات 12 بئراً.

ثم أضف 10 µL من معلق جسيمات ثاني أكسيد السيليكون النانوية الفلورية العاملة والمحضرة حديثًا إلى كل بئر تجريبي، مع إضافة حجم مساوٍ من الوسط الكامل إلى آبار التحكم غير المعالجة في هذا الوقت أيضًا. بعد عملية الاستيعاب الداخلي لمدة ساعة واحدة عند 37 °C، انقل العينات إلى أنابيب بولي بروبيلين فردية سعة 1.5 mL، ثم قم بطرد العينات مركزياً لمدة ثلاث دقائق عند 6,000 ×g وفي درجة حرارة الغرفة، ولصبغ الخلايا بـ CD 14، قم بحضن 100 µL من كل معلق خلوي مع 10 µL من الجسم المضاد البشري بنسبة 1:11 في محلول التثبيت (running buffer) لمدة 10 دقائق عند 4 °C. بعد غسل الأجسام المضادة غير المرتبطة باستخدام 1 mL من محلول التثبيت، أعد تعليق الخلايا في 200 µL من محلول تثبيت جديد لإجراء تحليل التدفق الخلوي (flow cytometric analysis).

بعد ذلك، لإعداد تعويض التداخل الطيفي (spectral spillover compensation)، افتح صندوق إعدادات الجهاز في برنامج قياس التدفق الخلوي، ثم قم بجمع عينة خالية من الجسيمات النانوية غير المرتبطة بالأجسام المضادة بسرعة تدفق منخفضة. يُعد ضبط إعدادات التعويض في وجود جسيمات نانوية فلورية الجزء الأكثر صعوبة في الإجراء، حيث يمكن للجسيمات النانوية أن تتدخل في التشتت الجانبي؛ ولضمان النجاح، يجب تحديد بوابة لمجتمع الخلايا المستهدف. قم بضبط التشتت الأمامي والجانبي يدويًا عن طريق تنظيم قنوات الجهد. ثم ارسم بوابة ذات حجم مناسب حول مجتمع الخلايا المطلوب.

قم بتحميل عينة أخرى غير معلمة، وافتح علامة تبويب التعويض (compensation) في مربع إعدادات الجهاز. اضبط عامل التعويض أثناء عملية الاستحواذ حتى تصبح شدة الفلورة في قناة التداخل (spillover channel) متساوية تقريبًا لكل من المجموعات الإيجابية والسلبية للفلوروكروم. وأخيرًا، بعد ضبط التعويض لكل أنبوب تحكم من الفلوروكرومات المصبوغة بشكل فردي، قم بقراءة العينات المعالجة بالجسيمات النانوية؛ وبغرض توصيف سلوك خلايا الدم البيضاء استجابةً للجسيمات النانوية بشكل أفضل، تم إجراء فحوصات الاستدخال كما تم توضيحه للتو.

على سبيل المثال، في هذه التجربة التمثيلية، تم تحديد ثلاث مجموعات فرعية رئيسية من كريات الدم البيضاء بوضوح من خلال التشتت الأمامي والجانبي بعد عزل PBMC. علاوة على ذلك، بعد المعالجة بـ fz silicon dioxide، أظهرت الخلايا اللمفاوية، والخلايا الوحيدة، والخلايا المحببة معدلات مختلفة من استيعاب الجسيمات النانوية كما يتضح من شدة الفلورة الخاصة بها. وفي هذه الصور، يظهر استيعاب الجسيمات النانوية في الخلايا الوحيدة الأولية الموجبة لـ CD 14 المنقاة من pbmc.

تعرض مخططات التبعثر هذه الخلايا الوحيدة الموجبة لـ CD 14 في وجود جسيمات ثاني أكسيد السيليكون النانوية fitz. ويوضح المدرج التكراري التكميم للخلايا الموجبة لـ fitzy والتي يتم التعبير عنها من خلال شدة الفلورة. وقد أُجريت تجارب استيعاب داخلي مماثلة باستخدام الخلايا الوحيدة TP one المعالجة بتركيزات متزايدة من جسيمات ثاني أكسيد السيليكون النانوية fitz، مع استخدام الخلايا غير المعالجة كعنصر تحكم سلبي.

توضح المخططات النقطية الزيادة المعتمدة على الجرعة في التشتت الجانبي مع بقاء التشتت الأمامي دون تغيير في الخط الخلوي TP one بعد استيعاب الجسيمات النانوية. وتشير البيانات المستمدة من هذه الرسوم البيانية إلى أن المعالجة بجسيمات ثاني أكسيد السيليكون النانوية الخاصة بـ fitz تحفز استيعاباً معتمداً على الجرعة في الخلايا الوحيدة، وهو ما يتضح من خلال تعزيز الحبيبات داخل الخلايا. وللحصول على رؤية أعمق حول التفاعلات بين الخلايا المناعية والجسيمات النانوية، تم استزراع الخلايا الدبقية الصغيرة لمدة سبعة أيام في المختبر وتحضينها مع الجسيمات النانوية لمدة ساعة واحدة. وقد أشار المجهر الفلوري إلى وجود مستنبت مختلط من الخلايا الدبقية الأولية يحتوي على عدد كبير من الخلايا النجمية غير الملتصقة والسالبة لـ GFP وبعض الخلايا الموجبة لـ GFP.

في هذه التجربة التمثيلية، أمكن تمييز ثلاث مجموعات فرعية من الخلايا الدبقية عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام صبغة واحدة للجسم المضاد CD 11 B؛ وهي الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الأخرى التي كانت سالبة لـ CD 11 B وسالبة لـ GFP، والخلايا الدبقية الصغيرة الموجبة لـ CD 11 B والسالبة لـ GFP، ومجموعة فرعية موجبة لـ CD 11 B وموجبة لـ GFP. وتستطيع المجموعتان الفرعيتان الأخيرتان استيعاب الجسيمات النانوية، مع زيادة طفيفة في الكفاءة لدى المجموعة الموجبة لـ GFP. ويمكن التحقق بشكل أكبر من استيعاب الجسيمات النانوية عن طريق المجهر البؤري كما هو موضح في هذه الصورة باستخدام جسيمات ثاني أكسيد السيليكون النانوية ذات الشكل العصوي.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الاحتفاظ بالعينات في الظلام لتجنب بهتان الأصباغ الفلورية، والحفاظ على العينات عند درجة حرارة 4 °C أثناء تحضين الأجسام المضادة. وعقب هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل المجهر البؤري (confocal microscopy) للإجابة على أسئلة إضافية حول التموضع داخل الخلايا للجزيئات النانوية.