الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال لتحديد توزيع الجليكوجين في عضلات الهيكل العظمي البشري

الجليكوجين ، وهو بوليمر جلوكوز متفرع ، هو احتياطي طاقة في المقصورات العضلية تحت الخلايا ، والفيفي الداخلي ، وتحت الحمامي داخل العضلة الهيكلية البشرية.

لتحديد توزيع الجليكوجين تحت الخلوي باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال ، TEM ، احصل على أنسجة عضلية هيكلية بشرية معزولة. إصلاح مع الجلوتارالديهايد للحفاظ على بنية الأنسجة. بعد تثبيت الأنسجة في محلول رابع أكسيد الأوزميوم ومحلول فيروسيانيد البوتاسيوم.

يرتبط مركب الأوزميوم والفيروسيانيد المنخفض بمجموعات الهيدروكسيل في الجليكوجين ، مما يحسن تباين جزيئات الجليكوجين في العضلات. بالإضافة إلى ذلك، تلطخ الأغشية والشبكة الساركوبلازمية — وهي عضية مرتبطة بالغشاء —

تجفيف الأنسجة في زيادة تركيزات الإيثانول. تضمينه في الراتنج ، وتشكيل كتلة صلبة. الحصول على أقسام رقيقة جدا مع ألياف عضلية طولية المنحى. نقل إلى شبكات TEM.

اغمر الشبكات في أسيتات اليورانيل ، محلول المعادن الثقيلة. ترتبط أيونات اليورانيل بالدهون والبروتينات سالبة الشحنة ، مما يجعلها كثيفة الإلكترون. وصمة عار بمحلول سترات الرصاص.

ترتبط أيونات الرصاص بالمناطق الملطخة بالأوزميوم بما في ذلك جزيئات الجليكوجين ، مما يعزز التباين. كما أنها ترتبط بالمناطق المتفاعلة مع أسيتات اليورانيل ، مما يزيد من عتامة الإلكترون.

أثناء التصوير TEM ، عندما تمر حزم الإلكترون عبر الأنسجة ، تشتت المناطق الملطخة كثيفة الإلكترون ، بما في ذلك الجليكوجين ، المزيد من الإلكترونات ، بينما تنقل المناطق غير الملوثة الإلكترونات.

في صورة TEM عالية التباين المنتجة ، تظهر جزيئات الجليكوجين مميزة ومظلمة ؛ تظهر المناطق غير الملوثة أفتح ، مما يسهل تصور وقياس توزيع الجليكوجين تحت الخلية في العضلات.

عزل عينة صغيرة من خزعة العضلات أو العضلة بأكملها ، والتي يبلغ قطرها الأقصى 1 ملم في أي اتجاه ، وهي أطول طوليا من المقطع العرضي.

ضع العينة في الأنبوب الذي يحتوي على محلول التثبيت الأولي البارد. قم بتخزينه على حرارة 5 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. ثم اغسل العينة 4 مرات في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 مولار. باستخدام ماصات النقل، قم بإزالة المخزن المؤقت المستخدم من الأنبوب، مع ترك العينة كما هي، وأضف المخزن المؤقت الجديد. بعد إصلاح العينة بنسبة 1٪ من رابع أكسيد الأوزميوم ، و 1.5٪ من فيروسيانيد البوتاسيوم في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 مولار لمدة 120 دقيقة عند 4 درجات مئوية.

اشطف العينة مرتين في ماء مقطر مزدوج في درجة حرارة الغرفة. يجفف عن طريق الغمر في سلسلة متدرجة من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة. تسلل العينة بأكسيد البروبيلين ومخاليط متدرجة بالراتنج الإيبوسيدي في درجة حرارة الغرفة باستخدام نسب الحجم المذكورة.

في اليوم التالي ، قم بتضمين العينات في راتنج الإبوسيدي الطازج بنسبة 100٪ في القوالب ، وبلمرة عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

قم بتركيب كتلة العينة على حامل الميكروتوم. قم بقص الكتلة على السطح بشفرة حلاقة للوصول إلى مستوى الأنسجة. قم بتركيب سكين ماسي أمام العينة ، وقم بمحاذاة سطح العينة بالتوازي مع السكين.

أنتج قسما شبه رقيق بسمك 1 ميكرومتر بسكين الماس للتحقق من اتجاه العينة. تلطخ القسم شبه الرقيق باللون الأزرق تولويدين للمراقبة باستخدام الفحص المجهري الضوئي. بعد ذلك ، قم بقص الكتلة بشكل أكبر لتقليل منطقة الاهتمام للحصول على أقسام رقيقة جدا مناسبة.

قطع أقسام رقيقة جدا بسمك 60 إلى 70 نانومتر بسكين ماسي ثان. اجمع 1 إلى 2 أقسام على شبكات نحاسية ذات ثقب واحد باستخدام حلقة مثالية. لتباين الأقسام ، اغمر الشبكات في محلول أسيتات اليورانيل لمدة 20 دقيقة ، واغسل الشبكات بالماء المقطر المزدوج ، ثم اغمر الشبكات في سترات الرصاص لمدة 15 دقيقة ، وأعد غسل الشبكات بالماء المقطر المزدوج.

قم بتشغيل المجهر الإلكتروني للإرسال والكمبيوتر وبرنامج تسجيل الصور. سجل الصور الرقمية باستخدام كاميرا CCD الرقمية ذات المسح البطيء وبرنامج التصوير المرتبط بها. بعد إدخال الشبكة بأقسام متعددة في مرحلة المجهر ، قم بفحص الشبكة في البداية بتكبير منخفض لاختيار أفضل أقسام الجودة ، وتحديد اتجاه ألياف العضلات.

بعد ذلك ، ركز الصورة عند التكبير فوق 30,000 ، مع تركيز الشعاع على ألياف طرفية في القسم ، وسجل الصور بوقت تعريض ضوئي واحد بمعدل التكبير المطلوب. تأكد من توزيع الصور على طول وعرض الألياف بترتيب عشوائي ولكن منهجي للحصول على نتائج غير متحيزة ، وكرر التصوير حتى يتم تصوير 6 إلى 10 ألياف.

قم باستيراد الصور إلى imageJ بالنقر فوق ملف ، متبوعا بفتح. قم بتعيين المقياس العام لمطابقة الحجم الأصلي للصورة بالنقر فوق تحليل ، ثم تعيين المقياس. للتكبير بنسبة 100٪ ، انقر فوق صورة ، وانتقل إلى Zoom ، وانقر فوق In.

قم بقياس سمك قرص Z واحد لكل صورة من مساحة الليفياف العضلي، باستخدام أداة Straight Line من قائمة Tools، واحسب متوسط سمك القرص Z لكل من الألياف من 6 إلى 10. استخدم أداة الخط المجزأ لقياس طول اللييفات العضلية الخارجية، المرئية أسفل المنطقة تحت الحمامية مباشرة.

لإدراج شبكة، انقر فوق تحليل، وحدد أدوات، ثم حدد الشبكة. الآن قم بتعيين المساحة لكل نقطة عند 32,400 نانومتر مربع. احسب عدد الزيارات ضمن الطول المتاح ، في 12 صورة تحت الحمامية حيث يصطدم الصليب بالجليكوجين تحت الحمامي.

أدخل شبكة بالنقر فوق تحليل ، ثم حدد الأدوات ، متبوعا بالشبكة ، واضبط المساحة لكل نقطة على 160,000 نانومتر مربع. احسب عدد الزيارات في 12 صورة لييفات عضلية ، حيث يصطدم الصليب بالفضاء الليفي الداخلي.

ثم مرة أخرى ، لإدراج شبكة ، انقر فوق تحليل ، وحدد أدوات ، ثم حدد شبكة. الآن ، قم بتعيين المساحة لكل نقطة على 3,600 نانومتر مربع. احسب عدد الزيارات في 12 صورة لييفات عضلية حيث يصطدم الصليب بالجليكوجين الليفي الداخلي.

أدخل شبكة بالنقر فوق تحليل ، ثم حدد الأدوات ، متبوعا بالشبكة ، واضبط المساحة لكل نقطة على 32,400 نانومتر مربع. احسب عدد الزيارات في 12 صورة لييفات عضلية حيث يصطدم الصليب بالجليكوجين بين اللييفات العضلي.

32,400 نانومتر مربع لاختيار جزيئات الجليكوجين بشكل عشوائي ، ابدأ بالمربع الأيسر العلوي وتحرك يسارا إذا لزم الأمر. باستخدام أداة الخط المستقيم ، قم بقياس قطر 5 جزيئات جليكوجين تم اختيارها عشوائيا لكل تجمع لكل صورة من الصور ال 12 للحصول على ما معدله 60 جسيما لكل تجمع لكل ألياف.