توجه التمييز بين الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة نحو الخلايا اللمفية تي

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد وتوصيف الخلايا الليمفاوية التائية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو الخلايا IPS. يمكن بعد ذلك تمييز خلايا IPS في المختبر على نظام ثقافة OP nine DL واحد ثم تنضج في الجسم الحي في فأر يعاني من نقص في الخرق. أو يمكن هندسة الخلايا وراثيا للتعبير عن OT واحد TCR ثم نقلها بالتبني لتطوير في الجسم الحي.

بعد ستة أسابيع من التمايز في الجسم الحي ، يمكن تحدي الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق باستخدام مخطط كهربية الدماغ سبع خلايا سرطانية ومن ثم يمكن تقييم خصوصية المستضد للخلايا التائية المشتقة من IPS. في النهاية ، يمكن لخلايا IPS أن تتمايز إلى كل من الخلايا التائية التقليدية والخاصة بالمستضد ، والتي تكون الأخيرة قادرة على حماية من تحدي الورم. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو العلاج المناعي للسرطان الفردي.

تسمح الطريقة بجيل من أعداد كبيرة من الخلايا التائية التفاعلية للورم المستمدة من الحد الأدنى من دم المريض أو أنسجة الجلد في اليوم صفر ، قم بنقل خمس مرات 10 إلى خلايا IPS الرابعة إلى طبق ثقافة 100 ملم يحتوي على طبقة أحادية الخلية اللاصقة من OP تسعة ، DL أحادية الخلية في وسائط FBS alpha MEM بنسبة 20٪ في اليوم الخامس ، عيون التربسين. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا بعد احتضانها على طبق استزراع جديد 100 ملم لمدة 30 دقيقة ولوحة حاضنة 37 درجة ، خمس مرات 10 إلى خمس الخلايا العائمة في 20٪ FBS alpha ، وسائط MEM والفأر المسطح ثلاثة روابط على طبق جديد 100 ملم يحتوي على طبقة أحادية من OP تسعة. تقوم خلية DL بخلية واحدة في اليوم الثامن بسحب الخلايا المرتبطة بشكل فضفاض ، وتقوم بالطرد المركزي للخلايا ، ثم تنقل الخلايا إلى بئر واحد من ستة آبار مزرعة مطلية ب OP تسعة خلايا DL واحدة تحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوعين آخرين في اليوم 22.

احتضان خلايا IPS المنفصلة في وسائط جديدة على طبق استزراع جديد عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم قم بإزالة حوالي نصف الخلايا العائمة وقم بتمريرها عبر مصفاة نايلون 70 ميكرون لاستبعاد كتل الخلايا وغسل تعليق الخلية المفردة الناتج ثلاث مرات باستخدام PBS البارد. بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الخلايا في PBS عند 1.5 مرة 10 من الخلايا السابعة لكل مليلتر وحافظ على الخلايا على الجليد قبل الحقن الوريدي.

ضع فأرة قصور خرقة عمرها أربعة أسابيع تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء لتوسيع الوريد الذيل. ثم املأ حقنة سعة مليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 26 ونصف ب 200 ميكرولتر من تعليق الخلية ونقل الخلايا بالتبني عبر وريد الذيل الموسع. بعد ثلاثة أسابيع بعد تأكيد القتل الرحيم للفأر المنقول بالتبني ، قم بإزالة الغدد الليمفاوية والطحال بعد تكسير الأنسجة ميكانيكيا.

قم بغسل تعليق الخلية المفردة باستخدام عازلة تحلل CK ثم اغسل الخلايا أحادية النواة الناتجة مرتين في PBS البارد. ثم بعد تلطيخ علامات سطح الخلية ، قم بتقييم الخلايا عن طريق تحليل التدفق الخلوي في اليوم صفر ، واستخدم كاشف تعداء الجين JAMA لنقل خلايا التعبئة والتغليف E المطلية طوال الليل باستخدام OT واحد MIDR في اليوم الأول بذرة واحدة في 10 إلى خلايا IPS الست في بئر واحد من 0.1٪ جيلاتين مشفر مسبقا 24 لوحة في اليوم الثاني ، اجمع الفيروس الزائف الذي يحتوي على S natin من خلايا اللوحة E ثم قم بتمريره عبر مرشح 0.4 ميكرون لاستبعاد الملوثات المحتملة بعد أجهزة الطرد المركزي. تحويل الخلايا في وجود الدماغ المتعدد لمدة ساعة واحدة عند 330 مرة جم عند 32 درجة مئوية.

احتضنها طوال الليل في نفس درجة الحرارة بعد تكرار إجراء التنبيغ. يعين التربسين خلايا IPS المنقولة في اليوم الرابع ثم بعد التكوير ، تقوم الخلايا بتعليق الخلايا في وسائط جديدة وبذرها على خلايا مغذية مشعة مشعة مسبقا 7 6 7. بمجرد أن تصل الخلايا المنقولة إلى الطلاقة ، قم بفرز الخلايا الموجبة المزدوجة GFP و DS الحمراء عن طريق قياس التدفق الخلوي.

بعد ستة أسابيع من النقل بالتبني لخلايا IPS ، حقن 50 ميكرولترا من مخطط كهربية الدماغ سبع خلايا ثومة في التجويف البريتوني لنفس الفأر في اليوم 50 من تحدي الورم. استخدم مجموعة عزل الخلايا التائية الإيجابية للتكنولوجيا الحيوية Mil E لفرز ثماني خلايا تائية إيجابية من الطحال والغدد الليمفاوية للحيوان المنقول بالتبني. امزج الخلايا التائية المجمعة الثماني الموجبة المعزولة بحجم SPOC مشع من فأر ساذج C 57 أسود ستة J بنسبة واحد إلى 10 ونبض الثقافة المشتركة مع 0.5 ميكرومول لكل مل من البويضات لمدة 40 ساعة.

بعد ذلك ، أضف الفيلدن أ إلى الخلايا لمدة أربع ساعات أخرى. أخيرا ، قم بتقييم مجموعات الخلايا عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي بعد عزل خلايا SP من فأر C 57 أسود ساذج ستة J. قسم تعليق الخلية إلى مجموعتين.

قم بتسمية المجموعة المرتفعة CFSE بخمسة ميكرومول لكل مل من CFSE وانبض الخلايا ب 10 ميكروغرام لكل مل من ببتيد البويضات لمدة ساعة واحدة ، المسمى مجموعة منخفضة A-C-F-S-E مع 0.5 ميكرومول لكل مل CFSE ولا تنبض. امزج 2.5 في 10 إلى السادس, الخلايا العليا CFSE مع 2.5 في 10 إلى السادس, الخلايا المنخفضة CFSE في PBS. ثم قم بتحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي لتعبير CFSE.

بعد 16 ساعة من نقل التبني إلى الفأر محل الاهتمام لحساب الخلايا السرطانية داخل الصفاق في اليوم 20 من تحدي الورم. استخدم حقنة سعة 10 مليلتر مزودة بإبرة قياس 18 ونصف و PBS بارد لغسل التجويف البريتوني. عد الخلايا السرطانية المستردة لتحديد الخلايا المتسللة للورم.

قم بإزالة الورم في مرحلة متأخرة من تحدي الورم ثم قم بتقطيع الورم إلى ثلاث قطع. ضع قطعة الورم الأولى في قارورة التبريد وضع القارورة على ثلج جاف. إصلاح القطعة الثانية على الفور الفورمالديهايد.

احتفظ بالقطعة الثالثة في وسائط RPMI 1640 المكيفة بعد تجفيف أقسام المناديل المحفوظة بالتبريد. قم بإصلاحها في الأسيتون البارد لمدة 15 دقيقة بعد تجفيف الأقسام الثابتة بالهواء لمدة 15 دقيقة أخرى. اغسل الشرائح لمدة خمس دقائق في PBS بعد الغسيل.

ضع الشرائح في غرفة رطبة وقم بتغطية أقسام الأنسجة ب 30 ميكرولتر من 3٪ B و SA و PBS لمدة 30 دقيقة لمنع الارتباط غير المحدد. ثم امسح المخزن المؤقت المانع واحتضان أقسام الأنسجة بمزيج سعة 50 ميكرولتر من الجسم المضاد PE المضاد ل TCR RV alpha Two والجسم المضاد المضاد للبويضات المخفف في 3٪ PSA في PBS في الغرفة الرطبة لمدة ساعتين في نهاية الحضانة. اغسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني بارد ، وأخيرا قم بتركيب الأقسام بوسائط تثبيت مائية قبل الفحص المجهري الفلوري لتحليل التدفق الخلوي للخلايا التائية التي تتسلل إلى الورم.

اسحق الورم في معلق خلية واحدة. ثم قم بتحليل الخلايا بحثا عن علامات سطح محددة. يتم استخدام C CD three و TCR beta كعلامات للخلايا التائية لتحديد ما إذا كان تحفيز خلايا IPS مع ترابط الشق DL يمكن أن يساهم في التعبير عن سطح الخلية التائية CD أربعة و CD ثمانية على CD ، تم تقييم ثلاث خلايا مشتقة من خلية IPS إيجابية TCR r beta.

لاحظ المخطط النقطي على اليمين الذي يظهر اليوم 22 CD ، ثلاثة CD إيجابي TCR R ، بيتا إيجابي ، أربعة CD سلبي ، ثماني خلايا تائية موجبة مفردة موجبة تم إنشاؤها من خلايا IPS في المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، أنتجت خلية IPS خلايا موجبة مفردة من الشكل السابق إنترلوكين اثنين وإنترفيرون جاما عند تحفيزها في المختبر بواسطة الأجسام المضادة المضادة للقرص المضغوط المضادة للأشعة السينية المغلفة بالصفيحة ثلاثة والأجسام المضادة للذوبان المضادة للقرص المضغوط 28 مما يؤكد أن الخلايا التائية المشتقة من خلية IPS تعمل بعد النقل بالتبني إلى الفئران المتلقية. خضعت غالبية خلايا IPS المنقولة من جين TCR للتمايز إلى CD ثمانية CTLs إيجابية ، والتي استجابت في المختبر لتحفيز الببتيد عن طريق إفراز الإنترلوكين الثاني والإنترفيرون جاما في هذه المخططات النقطية من خلايا العقدة الليمفاوية والطحال المجمعة.

إنشاء ثمانية خلايا تائية إيجابية من القرص المضغوط في الفئران المنقولة بالتبني باستخدام خلايا IPS المنقولة من TCR ولكن ليس التحكم فيها. كانت المجموعات الإيجابية للقرص المضغوط الثمانية إيجابية V beta الخمسة إيجابية لتلوين السيتوكين داخل الخلايا للإنترلوكين الثاني وإنتاج إنترفيرون جاما الممثلة في هذه الرسوم البيانية بالخطوط الداكنة مقارنة بالرسوم البيانية للتحكم في النمط المتماثل المظللة مما يشير إلى أن CTLs المشتقة من IPS كانت وظيفية. تظهر هذه البيانات أن الخلايا المرتفعة CFSE تنبض بإبتيد ممثلة بالقمم الموجودة على اليمين في كل رسم بياني وخلايا التحكم المنخفضة CFSE التي تمثلها القمم الموجودة على اليسار التي تم حقنها في الفئران بعد 10 أسابيع من نقل خلايا IPS أو بعد يوم واحد من نقل O OT واحد CTL.

استجابت CTLs المشتقة من IPS الخاصة بالمستضد لتحفيز المستضد وكان لها نشاط سام للخلايا كما يتضح من عدم وجود خلايا عالية CFSE هنا. تم نقل خلايا IPS المنقولة بجين TCR واحد بالتبني إلى C 57 ستة فئران سوداء ثم تعرضت الفئران للتحدي مع مخطط كهربية الدماغ سبع خلايا سرطانية في اليوم 20 تم تعداد الخلايا السرطانية في التجويف البريتوني. لاحظ الانخفاض الكبير في أعداد الخلايا السرطانية في الفئران التي تلقت IPS المحولة TCR مقارنة بمجموعات التحكم.

الأهم من ذلك ، أن النقل بالتبني لخلايا IPS المنقولة TCR أدى إلى تسلل CTLs مفرط التفاعل إلى أنسجة الورم وحماية من تحدي الورم كما هو موضح في هذا التلوين h و e لأنسجة الورم التي تعافت يوما من 30 إلى 35 بعد أورام تحدي الورم من الفئران المنقولة بالتبني مع الخلايا المنقولة TCR أو OT one CTLs ولكن ليس الحقن الوهمي أو التحكم. تم اختراق الخلايا المنقولة بواسطة الخلايا الالتهابية كما هو موضح في الأسهم الحمراء هنا. تم العثور على Ova specific V alpha اثنين من CTLs الإيجابية باللون الأحمر للتسلل إلى البويضات التي تعبر عن أنسجة الورم باللون الأخضر.

في حين أن الأورام في الفئران من المجموعات الضابطة كانت تحتوي على عدد أقل من الخلايا المتسللة للورم أو معدومة في هذا الشكل ، فقد تم تحليل معلقات الخلية المفردة من أنسجة الورم للتعبير عن إيجابية V alpha two و V beta five إيجابية عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد البوابات على CD ثمانية إيجابية. لاحظ أن أنسجة الورم من الفئران المنقولة بالتبني مع خلايا IPS المنقولة TCR أظهرت أعلى مستوى من الخلايا المتسللة للورم بينما أورام الفئران التي تلقت السيطرة. لم يظهر IPS المحول أي تسلل بواسطة البويضات الخاصة بثمانية خلايا تائية موجبة للمضغوطة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد خلايا تائية خاصة بالمستضد من خلايا IPS وكيفية تقييم وظائف IPS المشتقة من الخلايا التائية.