و في المختبر المشارك عدوى نموذج لدراسة المتصورة المنجلية HIV-1-التفاعلات في الإنسان خلايا الوحيدات المشتقة الابتدائية المناعي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير نموذج في المختبر لدراسة آثار كريات الدم الحمراء المصابة بالمتصورة على تكاثر فيروس نقص المناعة البشرية في البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة الأولية البشرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل المتصورة أولا ، خلايا الدم الحمراء المصابة بالفقرة الكاذبة باستخدام نظام veac ، ثم تعريض البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة البشرية للخلايا المصابة. بعد ذلك ، تصاب البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة المعرضة لخلايا الدم الحمراء بفيروس نقص المناعة البشرية التكاثري بالكامل أو ترميز لوسيفيراز النسخ المتماثل الفردي ، فيروس نقص المناعة البشرية.

أخيرا ، يتم حصاد المواد الطافية المزرعة في الأيام 3 و 6 و 9 و 12 بعد الإصابة للفيروس التكاثري الكامل لفيروس ترميز لوسيفيراز. تكذب الخلايا المصابة بعد 72 ساعة من الإصابة. في النهاية ، يمكن مراقبة تكاثر الفيروس عن طريق تحديد كمية بروتين القفيصة لفيروس نقص المناعة البشرية في المواد الطافية بواسطة إليزا ويمكن مراقبة النسخ الفيروسي عن طريق القياس الكمي لوسيفيراز محللات الخلية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الملاريا والعدوى المشتركة بفيروس نقص المناعة البشرية. على سبيل المثال ، كيف تؤثر العدوى بطفيلي المتصورة على تكاثر فيروس نقص المناعة البشرية؟ على الرغم من أن هذه الطريقة تم تطويرها لدراسة التفاعلات بين المتصورة وفيروس نقص المناعة البشرية في البلاعم ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنواع الخلايا الأخرى.

على سبيل المثال ، ستكون الخلايا المتغصنة أو الخلايا الوحيدة أو الخلايا التائية الأربعة التي توضح الإجراء هي غوادالوبي أندرياني. زميل ما بعد الدكتوراه في المختبر ابدأ بحصاد خلايا الدم الحمراء من لوحة الثقافة ، وغسل الخلايا المستردة في 10 مل من وسط البلاعم المشتق من الخلايا الأحادية ، ثم أعد تعليق الحبيبات في 12 مل من وسط زراعة البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية. الآن أضف تعليق الخلية ببطء إلى عمود Milton ECS واترك التعليق يتدفق من خلاله بعد غسل العمود مرة واحدة بوسط جديد ، وقم بإزالته من المغناطيس وقم بغسل 12 مل من ثقافة البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية.

متوسط من خلال العمود ، مراوغة من خلايا الدم الحمراء المصابة في أنبوب معقم لتعريض البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة لخلايا الدم الحمراء المصابة أو غير المصابة. أضف حجم تعليق خلايا الدم الحمراء المناسب إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا معدة مسبقا تحتوي على البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة. احتضان المزارع المشتركة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد أربع ساعات ، وقم بإزالة الوسط الذي يحتوي على خلايا الدم الحمراء ثم أضف برفق 600 ميكرولتر من PBS الخالي من السموم الداخلية إلى كل منها ، مع شفط PBS ثلاث مرات مباشرة بعد كل غسلة.

الآن في 200 ميكرولتر من الثلج ، الماء البارد والمعقم لكل بئر لخلايا الدم الحمراء التي تستنشق الماء بعد 20 ثانية. ثم عند 600 ميكرولتر من وسط زراعة البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية لكل بئر واحتضان المزارع لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لتقييم تأثير المتصورة الكاذبة على فيروس العوز المناعي البشري ، تكاثر واحد في البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة عند 300 ميكرولتر من وسط البلاعم المشتق من الخلايا الوحيدة المحتوي على P 24 من NL أربعة ثلاثة فيروسات BO IV واحد في الآبار المناسبة على غرار البروتوكول الموضح في هذا الشكل.

بعد احتضان الثقافات المشتركة لمدة ساعتين ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 600 ميكرولتر من PBS الخالي من السموم الداخلية. ثم عند 600 ميكرولتر ، وسط بلاعم مشتق من الخلية الأحادية الطازجة لكل بئر واستمر في احتضان المزارع المشتركة في الأيام 3 و 6 و 9 و 12 بعد الإصابة الفيروسية الأولية ، قم بحصاد 200 ميكرولتر من كل سنات لاستبدال تعليق الخلية المستردة ب 200 ميكرولتر من البلاعم الطازجة المشتقة من الخلايا الأحادية. متوسط. بعد ذلك قم بتخزين المواد الطفية المحصودة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لتحليلها لاحقا بواسطة إليزا.

من أجل تحديد تأثير الطفيليات على فيروس نقص المناعة البشرية ، هناك تعبير جيني واحد في البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة عند 300 ميكرولتر من وسط البلاعم المشتق من الخلايا الوحيدة التي تحتوي على P 24 من الفيروس المغطى باللوسيفيراز ENC الذي يهم الآبار المقابلة المشابهة للبروتوكولات الموضحة هنا. بعد احتضان وغسل ثقافات الكود كما هو موضح للتو للفيروس غير المغلف ب ENC غير لوسيفيراز ، قم بإزالة الوسط بعد 72 ساعة من الإصابة وأضف 200 ميكرولتر من مقايسة لوسيفيراز. يقوم المخزن المؤقت للتحلل الضارب الآن بوضع الخلايا في درجة حرارة الغرفة مع هز لطيف ثم تخزين المزارع المشتركة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

بعد الذوبان ، تنقل اللوحة 40 ميكرولترا من المحللة من كل بئر إلى البئر المقابل في لوحة مقياس الإضاءة 96 بئر. ثم أضف 100 ميكرولتر من مجموعة فحص لوسيفيراز ركيزة لوسيفيراز إلى كل منها. حسنا ، أخيرا قم بقياس نشاط اليراع لوسيفيراز في مقياس الإضاءة.

وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في هذه التجربة ، تعرضت البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة لخلايا الدم الحمراء المصابة أو غير المصابة ثم أصيبت ب NL أربعة ثلاثة بلين. كما هو موضح للتو ، تمت مراقبة إنتاج البروتين الفيروسي P 24 بواسطة ELIZA لفيروس نقص المناعة البشرية واحد P 24 في المواد الطافية الخالية من الخلايا في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى الفيروسية الأولية. لاحظ الانخفاض الكبير في إطلاق الجسيمات الفيروسية في اليوم 12 كما تم قياسه بواسطة فيروس نقص المناعة البشرية واحد P 24 بروتين القفيصة في الغطاء الزائد من البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية المعالجة مسبقا بالطفيليات.

في هذه التجربة ، تعرضت البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة لخلايا الدم الحمراء المصابة وغير المصابة ثم أصيبت بالفيروس المشفر لوسيفيراز كما تم تقييم تعبير لوسيفيراز في محللة الخلية بعد 72 ساعة من الإصابة بالفيروس الأولي في الإصابة. عدوى البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية بمثل هذه الفيروسات التي تؤوي إما خارج الجنس VS. VG أو HIV واحد أدت البروتينات السكرية إلى إنتاج أقل بكثير من لوسيفيراز في الخلايا المعرضة ل p الصاري الكاذب. من الجدير بالذكر أن الفيروسات المصنفة الزائفة VSVG أسفرت عن نشاط لوسيفيراز أكبر بكثير من JRFL على نظيراتها بسبب كفاءة العدوى الأكبر للجزيئات المصنفة الزائفة VSPG.

ستسمح هذه التقنية للباحثين في مجال الملاريا والعدوى المشتركة بفيروس نقص المناعة البشرية باستكشاف التفاعلات بين هذين المسببين الممرضين في نموذج مختبري قابل للتكيف مع دراسة العديد من أنواع الخلايا المناعية.