الخلايا الجذعية وبناء الحصانة المهندسة ضد العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية في نموذج إنساني ماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء فأر متوافق مع البشر معدل بمستقبلات مستضد خيمرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات فيروس نقص المناعة البشرية والمناعة فيما يتعلق باختبار فعالية المناعة المهندسة القائمة على الخلايا الجذعية ضد عدوى فيروس نقص المناعة البشرية وغيرها من الالتهابات والأورام الخبيثة المزمنة. مثل آلية الفشل المناعي وطرق تعزيز جهاز المناعة وتطوير علاج لخلق مناعة أفضل مضادة للفيروسات أو مضادة للأورام.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قادرة على قدر كبير من التلاعب التجريبي. يحاكي نموذج الفئران BLT المتوافق مع البشر المناعة البشرية وفي هذه الحالة يسمح بإجراء اختبارات قبل السريرية للعلاجات الجينية القائمة على الخلايا ضد عدوى فيروس نقص المناعة البشرية. وسيتم إثبات الإجراء فاليري رزيك وبريانا لام, وهما فنيان من مختبري.

ابدأ باستخدام المشارط لتقطيع الغدة الصعترية إلى قطع صغيرة طولها حوالي ملليمتر واحد مكعبات في طبق يحتوي على وسط RPMI مكمل. ثم استخدم ملقط حاد منحني لوضع كل قطعة من الغدة الصعترية في بئر واحد على لوح 96 بئر. أضف 100-200 ميكرولتر من الوسائط إلى جميع الآبار حتى لا تجف الأنسجة.

تصور الأنسجة تحت المجهر للتخلص من أي نسيج قد لا يكون الغدة الصعترية أو به نسيج ضام متصل. بعد ذلك ، قم بإزالة القطع المؤكدة من الغدة الصعترية ، واجمعها في قارورة ثقافة الخلايا T25. أضف سبعة ملليلتر من وسائط RPMI المكملة بالمضادات الحيوية إلى القارورة وقم بالصخور برفق لخلطها.

ثم ضع القارورة في حاضنة زراعة الأنسجة. هذه الخطوة تمنع التلوث البكتيري للأنسجة. ابدأ في عزل الخلايا الجذعية السرطانية الإيجابية CD34 من كبد الجنين باستخدام مشرطين لتقطيع الكبد إلى قطع صغيرة من حوالي ثلاثة ملليمترات مكعبة في طبق يحتوي على IMDM.

قم بإزالة والتخلص من أي نسيج ضام أبيض. ثم استخدم حقنة سعة 10 ملليلتر مزودة بإبرة حادة قياس 16 لإخراج قطع الكبد والوسائط ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. امتص برفق وطردها من خمس إلى سبع مرات أخرى لتجانس الأنسجة تماما.

بعد تحضير 10 ملليلتر من وسائط IMDM ، قم بتكملها بالكولاجيناز والهيالورونيداز والمضادات الحيوية و Dnase ومكافحة الفطريات. مرر الوسائط عبر مرشح 0.22 ميكرون. ثم أضف الوسائط المفلترة إلى تعليق الكبد.

بعد تغطية الأنبوب المخروطي سعة 50 مليلتر الذي يحتوي على تعليق الكبد ، قم بإغلاقه بإحكام بغشاء ذاتي الختم مثل البارافيلم لمنع التسرب. قم بالتدوير في أنبوب دوار في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بتصفية معلق الخلية المهضومة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون في أنبوب جديد سعة 50 مل.

أضف PBS إلى التعليق ليصل الحجم الإجمالي إلى 50 ملليلترا. قسم هذا إلى أنبوبين سعة 50 مليلتر ، يحتوي كل منهما على 25 مل من تعليق الخلية. إبطاء الخلايا في كل أنبوب ووضعها برفق مع 10 ملليلتر من وسائط الطرد المركزي الكثافة ، مثل Ficoll.

تدور في 1200 مرة جم لمدة 20 دقيقة دون انقطاع. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الواجهة بعناية من كل أنبوب ونقلها إلى أنبوبين منفصلين سعة 50 ملليلترا. ارفع حجم كل أنبوب واجهة إلى 50 مل مع PBS.

ثم جهاز الطرد المركزي عند 300 مرة جم لمدة سبع إلى 10 دقائق. امزج واغسله كريات الخلية ثلاث مرات مع 50 مل من PBS تحتوي على اثنين بالمائة FBS ، وتدور عند 300 مرة جم لمدة سبع إلى 10 دقائق في كل مرة. بعد الدوران النهائي ، أعد تعليق الحبيبات في 50 مل من وسائط RPMI بالإضافة إلى 10 بالمائة FBS.

عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. بعد ذلك ، قم بفرز الخلايا الموجبة CD34 على الفور باستخدام مجموعة فرز CD34 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، واحفظ كل من CD34 الموجب والكسر السالب CD34. تسكب قطع الغدة الصعترية ومتوسطة من القارورة في طبق 60 ملم.

قم بتبريد بعض أطراف ماصة الإزاحة الإيجابية عن طريق وضعها في أنابيب ذات غطاء لولبي معقم سعة 1.5 مل على الجليد. أيضا ، ضع كريات الخلية وحجم خليط البروتين الجيلاتيني مثل ماتريجل على الثلج. تخدير الفئران المتلقية بمخدر عن طريق الحقن وفقا لبروتوكول حيواني معتمد.

تحقق من مستوى تخدير الفأر عن طريق الضغط على مخلب. يشير عدم وجود رد فعل على القرصة إلى مستوى جراحي للتخدير. احلق الجانب الأيسر من كل فأر من الورك إلى الكتف بين مركز الظهر والمعدة.

حقن تحت الجلد ستة ملليغرام لكل كيلوغرام من الكاربروفين المخفف في كتف أو المثلث الإربي. اغسل قنية المبزل باستخدام PBS في طبق 60 ملم. باستخدام زوج من الملقط المنحني غير الحاد ، ضع قطعة من الغدة الصعترية من الطبق 60 ملم داخل فتحة القنية مباشرة ، ثم اسحب المبزل لشفط الأنسجة في القنية.

بعد ذلك ، استخدم ماصة الإزاحة الإيجابية وطرفا مبردا لإضافة خمسة ميكرولترات من خليط البروتين الجيلاتيني البارد في الأنبوب مع حبيبات الخلية. ويقلب برفق لتوليد تعليق الخلية. قم بتعليق الخلية في فتحة القنية واسحب المبزل ببطء لتحميل الإبرة.

مسحة المنطقة المحلوقة من الفأر مع بوفيدون اليود متبوعا بالأيزوبروبينيل ثلاث مرات. تحديد أغلك بقعة تحت الجلد تشير إلى موقع الطحال. يبلغ طول الكلية حوالي خمسة ملليمترات ظهرية من الطحال.

بعد التأكد من مستوى مناسب من التخدير من خلال عدم وجود تفاعل لقرصة المخلب ، استخدم ملقطا منحنيا لرفع الجلد واستخدم المقص الجراحي لعمل شق 15 ملم في الجلد الموازي للطحال. ثم قم بعمل قطع مماثل في طبقة الصفاق أدناه. في الذكور ، يمكن رؤية الكلى بسهولة ، وبالتالي يتم بثقها ببساطة عن طريق الضغط على البطن.

ادعم الكلى باستخدام ملقط دموستاتي أو زوج من الملقط غير الحاد المنحني. في الإناث ، يميل المبيضان إلى منع الكلى من الاستخراج السهل. باستخدام مرقئ ، التقط المبيض وكشف الكلية بعناية.

استخدم ملقطا برأس إبرة لنتف ثقب صغير في الطرف الخلفي من كبسولة الكلى. حرك المبزل في هذه الفتحة وعلى طول الكلى حتى يتم تغطية فتحة القنية بالكامل بواسطة كبسولة الكلى. قم ببثق الأنسجة الموجودة أسفل كبسولة الكلى برفق واسحب المبزل للخارج.

استخدم الملقط المنحني للتأكد من أن قطعة الغدة الصعترية لا تعود بالإبرة. بعد ذلك ، ارفع الصفاق بالملقط واستخدم الهيموسات برفق لدفع الكلية إلى مكانها. اربط غرزة مزدوجة معقودة بخياطة جراحية في الصفاق.

ضع أيضا مقطعين من مشابك الجرح Autoclips لإغلاق الجلد. الآن امزج الخلايا الإيجابية CD34 المنقولة وشفط 0.5 مرة 10 إلى الخلايا الست في حجم 100 ميكرولتر في حقنة الأنسولين. حقن هذه الخلايا في الفأر من خلال حقن الوريد المداري الرجعي.

بعد الحقن ، امسح قطرة صغيرة من زيوت التشحيم على كل عين ، وضع الفأر على جانبه في قفص. بعد زرع جميع الفئران ، تأكد من أن قد استعادت ضميرها وأنها متنقلة قبل إعادتها إلى غرفة السكن. تم التضحية بالفئران بعد 10 أسابيع من الجراحة وتم حصاد الدم والطحال والغدة الصعترية ونخاع العظام.

تم تلطيخ الخلايا الناتجة بأجسام CD45 المضادة للإنسان ومضادات CD4 المضادة للإنسان وتحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي. كما هو موضح هنا ، يمكن اكتشاف الخلايا المعدلة لمستقبلات المستضد الخيمري CD4 في الأنسجة اللمفاوية المتعددة عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن أن تتمايز الخلايا المعدلة لمستقبلات المستضد الخيمري CD4 إلى سلالات متعددة.

هنا ، تم حصاد خلايا الطحال من الفئران المعدلة بمستقبلات المستضد الخيمري CD4 وتلطيخها لعلامات الخلايا التائية والبائية. كانت الخلايا السالبة لعلامات الخلايا التائية والبائية إيجابية لعلامات الخلايا الوحيدة والضامة والخلايا القاتلة الطبيعية. تم تحفيز خلايا الطحال من الفئران المستقبلة للمستضد الخيمري CD4 المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية إما بخلايا T one المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية أو غير المصابة ويظهر إنتاجها داخل الخلايا للسيتوكين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء فئران BLT المتوافقة مع البشر المعدلة بمستقبلات مستضد خيمرية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 48 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل بوتيرة ثابتة وإيلاء اهتمام وثيق لحالة الماوس الذي يتم تشغيله.

بالنسبة للمبتدئين ، من المهم ممارسة الجراحة وحقن العين قبل العمل مع الأنسجة والخلايا الجذعية الأكثر قيمة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال فيروس نقص المناعة البشرية والأمراض المعدية الأخرى لاستكشاف التسبب في الأمراض والعلاجات القائمة على المناعة في نموذج الفأر المتوافق مع البشر.